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木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探

刘小丽 韦运谢

刘小丽,韦运谢. 木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−7. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
引用本文: 刘小丽,韦运谢. 木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−7. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
LIU Xiaoli, WEI Yunxie. Cloning and preliminary functional analysis of MeIAA19 in cassava[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
Citation: LIU Xiaoli, WEI Yunxie. Cloning and preliminary functional analysis of MeIAA19 in cassava[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145

木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
基金项目: 海南省研究生创新科研课题资助项目(Qhys2023-252)
详细信息
    第一作者:

    刘小丽(1999—),女,海南大学热带农林学院2022级硕士研究生。E-mail:dmyvsm5q@126.com

    通信作者:

    韦运谢(1989—),女,研究员,博士生导师。研究方向:热带作物分子生物学。E-mail:994016@hainanu.edu.cn

  • 中图分类号: S533

Cloning and preliminary functional analysis of MeIAA19 in cassava

  • 摘要: 为了探究Aux/IAA基因的初步功能,本研究克隆并鉴定了木薯(Manihot esculentaMeIAA19基因,通过生物信息学分析发现,该基因编码244个氨基酸,具有典型Aux/IAA蛋白的PB1保守结构域。通过构建MeIAA19-pET32a原核表达载体,诱导表达出该蛋白,并通过外源施加蛋白促进木薯植株活性氧爆发和MePRs基因表达量。基因表达分析表明,MeIAA19基因的表达量在Xam侵染过程中随时间的延长而增加。本研究结果显示,木薯MeIAA19基因可能参与了木薯免疫。
  • 图  2  MeIAA19蛋白结构分析

    Fig.  2  Structural analysis of MeIAA19 protein

    图  3  MeIAA19与不同植物中的同源基因序列比对

    Fig.  3  The multiple sequence alignment of MeIAA19 with homologous genes from different plants

    图  4  MeIAA19的亚细胞定位

    A:MeIAA19亚细胞定位预测;B:MeIAA19亚细胞定位,DAPI染色显示细胞核定位,比例尺=20 μm。

    Fig.  4  Subcellular localization of MeIAA19

    A:Prediction of the subcellular localization of MeIAA19;B:Subcellular localization of MeIAA19,DAPI staining showing the nuclei,scale bar = 20 μm.

    图  5  MeIAA19-pET32a原核表达载体构建

    M:DL2000 DNA Marker;M1:15 000 DNA Marker;A:MeIAA19扩增;1~4:以MeIAA19-pEASY-T3为模板扩增的MeIAA19;B:菌落PCR验证;1~5:不同克隆;C:双酶切验证阳性克隆;1~4:不同阳性克隆。

    Fig.  5  Construction of the prokaryotic expression vector MeIAA19-pET32a

    M: DL2000 DNA Marker; M1: 15 000 DNA Marker; A: Amplification of MeIAA19; 1−4: Amplification of MeIAA19 using MeIAA19-pEASY-T3 as template; B: PCR validation of the colonies; 1−5: Different clones; C: Verification of the positive clones via dual enzyme digestion; 1−4: Different positive clones.

    图  6  MeIAA19蛋白诱导表达

    M:预染蛋白质分子量标准(19~117 kDa),箭头表示对照及目的蛋白;A:考马斯亮蓝染色检验;从左到右依次为对照蛋白的0、1、3和6 h样品,MeIAA19-pET32a蛋白0、1、3和6 h的样品;B:Westren blot检验;从左到右依次为对照蛋白的0、1、3和6 h样品,MeIAA19-pET32a蛋白0、1、3和6 h的样品。

    Fig.  6  Induced expression of MeIAA19 protein

    M: Pre-stained color protein Marker (19−117 kDa) and the arrows indicate the control and target protein; A: The test of coomassie brilliant blue staining; from left to right 0, 1, 3, and 6 h samples of control protein, and 0, 1, 3, and 6 h samples of MeIAA19-pET32a protein; B: The test of western blot; from left to right 0, 1, 3, and 6 h samples of control protein, and 0, 1, 3, and 6 h samples of MeIAA19-pET32a protein.

    图  7  MeIAA19蛋白功能分析

    A:Flg22诱导的活性氧爆发,B:MePR1MePR2基因的表达分析。

    Fig.  7  The function analysis of MeIAA19 protein

    A:Flg 22 induced the burst of reactive oxygen species,B:The transcript level of MePR1 and MePR2.

    图  8  MeIAA19基因在Xam侵染下的表达分析

    MeIAA19基因0 h的表达量设置为1.0。所有数据至少包含三个生物重复,每个生物重复中大约有20片叶子。采用双因素方差分析(ANOVA)和t检验计算,不同字母表示P < 0.05的显著差异。

    Fig.  8  The expression level of MeIAA19 under Xam infection

    The transcript level of MeIAA19 at 0 h was set as 1.0. All data contain at least three biological replicates, with about 20 leaves each replicate. The data were subjected to two factor analysis of variance (ANOVA) and t-test. Different letters indicate significant differences (P < 0.05) calculated by two-way ANOVA and student’s t-test.

    表  1  MeIAA19编码蛋白的理化性质

    Table  1  The physical and chemical properties of MeIAA19

    基因
    Gene
    蛋白分子量/kDa
    Protein molecular weight/kD
    等电点
    Isoelectric point
    GRAVY
    亲水性平均值
    脂肪系数
    Aliphatic index
    不稳定指数
    Instability Index
    氨基酸数量
    Number of amino acids
    IAA1926.648.20−0.51567.9037.71244
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  • [1] ALI J, MUKARRAM M, OJO J, et al. Harnessing phytohormones: advancing plant growth and defence strategies for sustainable agriculture[J]. Physiologia Plantarum, 2024, 176(3): e14307. doi:  10.1111/ppl.14307
    [2] WANG Z, LI X, WANG X, et al. Arabidopsis endoplasmic reticulum-localized UBAC2 proteins interact with PAMP-INDUCED COILED-COIL to regulate pathogen-induced callose deposition and plant immunity[J]. The Plant Cell, 2019, 31(1): 153 − 171. doi:  10.1105/tpc.18.00334
    [3] KAZAN K, MANNERS J M. Linking development to defense: auxin in plant-pathogen interactions[J]. Trends in Plant Science, 2009, 14(7): 373 − 382. doi:  10.1016/j.tplants.2009.04.005
    [4] RAMOS J A, ZENSER N, LEYSER O, et al. Rapid degradation of auxin/indoleacetic acid proteins requires conserved amino acids of domain II and is proteasome dependent[J]. The Plant Cell, 2001, 13(10): 2349 − 2360. doi:  10.1105/tpc.010244
    [5] 冯寒骞, 李超. 生长素信号转导研究进展[J]. 生物技术通报, 2018, 34(7): 24 − 30.
    [6] NEBENFüHR A, WHITE T, LOMAX T L. The diageotropica mutation alters auxin induction of a subset of the Aux/IAA gene family in tomato[J]. Plant Molecular Biology, 2000, 44(1): 73 − 84. doi:  10.1023/A:1006437205596
    [7] LISCUM E, REED J W. Genetics of Aux/IAA and ARF action in plant growth and development[J]. Plant Molecular Biology, 2002, 49(3/4): 387 − 400. doi:  10.1023/A:1015255030047
    [8] JAIN M, KAUR N, GARG R, et al. Structure and expression analysis of early auxin-responsive Aux/IAA gene family in rice (Oryza sativa)[J]. Functional & Integrative Genomics, 2006, 6(1): 47 − 59.
    [9] WANG Y, DENG D, BIAN Y, et al. Genome-wide analysis of primary auxin-responsive Aux/IAA gene family in maize (Zea mays L.)[J]. Molecular Biology Reports, 2010, 37(8): 3991 − 4001. doi:  10.1007/s11033-010-0058-6
    [10] WANG S, BAI Y, SHEN C, et al. Auxin-related gene families in abiotic stress response in Sorghum bicolor[J]. Functional & Integrative Genomics, 2010, 10(4): 533 − 546.
    [11] GAO J, CAO X, SHI S, et al. Genome-wide survey of Aux/IAA gene family members in potato (Solanum tuberosum): identification, expression analysis, and evaluation of their roles in tuber development[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 471(2): 320 − 327. doi:  10.1016/j.bbrc.2016.02.013
    [12] 司马晓娇, 郑炳松. 植物生长素原初响应基因Aux/IAA研究进展[J]. 浙江农林大学学报, 2015, 32(2): 313 − 318. doi:  10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.021
    [13] SINGLA B, CHUGH A, KHURANA J P, et al. An early auxin-responsive Aux/IAA gene from wheat (Triticum aestivum) is induced by epibrassinolide and differentially regulated by light and calcium[J]. Journal of Experimental Botany, 2006, 57(15): 4059 − 4070. doi:  10.1093/jxb/erl182
    [14] BASSA C, MILA I, BOUZAYEN M, et al. Phenotypes associated with down-regulation of Sl-IAA27 support functional diversity among Aux/IAA family members in tomato[J]. Plant & Cell Physiology, 2012, 53(9): 1583 − 1595.
    [15] WANG F, NIU H, XIN D, et al. OsIAA18, an Aux/IAA transcription factor gene, is involved in salt and drought tolerance in rice[J]. Frontiers in Plant Science, 2021, 12: 738660. doi:  10.3389/fpls.2021.738660
    [16] SALEHIN M, LI B, TANG M, et al. Auxin-sensitive Aux/IAA proteins mediate drought tolerance in Arabidopsis by regulating glucosinolate levels[J]. Nature Communications, 2019, 10: 4021. doi:  10.1038/s41467-019-12002-1
    [17] SU Y, WANG G, HUANG Z, et al. Silencing GhIAA43, a member of cotton AUX/IAA genes, enhances wilt resistance via activation of salicylic acid-mediated defenses[J]. Plant Science, 2022, 314: 111126. doi:  10.1016/j.plantsci.2021.111126
    [18] 庞祥宇. 木薯IAA/ARF基因家族预测、表达及功能分析 [D]. 南宁: 广西大学, 2019.
    [19] OGBONNA A C, BRAATZ DE ANDRADE L R, RABBI I Y, et al. Large-scale genome-wide association study, using historical data, identifies conserved genetic architecture of cyanogenic glucoside content in cassava (Manihot esculenta Crantz) root[J]. The Plant Journal, 2021, 105(3): 754 − 770. doi:  10.1111/tpj.15071
    [20] 关玲, 赵密珍, 王庆莲, 等. 改良CTAB方法提取果树不同组织的RNA[J]. 江苏农业科学, 2018, 46(15): 19 − 22.
    [21] 董亚彬, 白玉晶. 木薯过氧化氢酶基因的克隆与原核表达[J]. 分子植物育种, 2024, 22(15): 4912 − 4918.
    [22] 白玉晶, 韦运谢. 木薯金属硫蛋白基因的克隆和表达分析[J]. 分子植物育种, 2020, 18(8): 2439 − 2444.
    [23] MARTíNEZ-DE LA CRUZ E, GARCíA-RAMíREZ E, VáZQUEZ-RAMOS J M, et al. Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings[J]. Journal of Plant Physiology, 2015, 176: 147 − 156. doi:  10.1016/j.jplph.2014.11.012
    [24] ZHANG Z, RUNIONS A, MENTINK R A, et al. A WOX/auxin biosynthesis module controls growth to shape leaf form [J]. Current Biology: CB, 2020, 30(24): 4857−4868.e6.
    [25] LUO J, ZHOU J J, ZHANG J Z. Aux/IAA gene family in plants: molecular structure, regulation, and function[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(1): 259. doi:  10.3390/ijms19010259
    [26] 樊书宏. 木薯Aux/IAA家族分离鉴定及其在木薯细菌枯萎病抗性反应的功能 [D]. 海口: 海南大学, 2019.
    [27] KIDD B N, KADOO N Y, DOMBRECHT B, et al. Auxin signaling and transport promote susceptibility to the root-infecting fungal pathogen Fusarium oxysporum in Arabidopsis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2011, 24(6): 733 − 748. doi:  10.1094/MPMI-08-10-0194
    [28] WANG D, PAJEROWSKA-MUKHTAR K, CULLER A H, et al. Salicylic acid inhibits pathogen growth in plants through repression of the auxin signaling pathway[J]. Current Biology, 2007, 17(20): 1784 − 1790. doi:  10.1016/j.cub.2007.09.025
  • [1] 何娇妍, 陈奥, 闫语.  木薯MeKIN10与MeRAV1/2蛋白互作结构域鉴定 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250028
    [2] 郑伊蒙, 段家文, 张艺, 李晨辉, 谢珍玉, 黄爱优.  三角褐指藻乳酸脱氢酶的原核表达及纯化鉴定 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240176
    [3] 羊娥月, 李杨, 莫明珠, 杨东梅, 刘亚, 吴友根, 于靖.  越南油茶CdMYC2基因克隆、生物信息学分析与表达模式研究 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250031
    [4] 谭梦婷, 徐浩然, 曾鸿秋.  MeDAWDLE基因的克隆和蛋白功能验证 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240146
    [5] 丁家辉, 张倩玉, 袁红梅.  橡胶草TkBZR家族基因的鉴定与原核表达分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250029
    [6] 何二秀, 罗红丽.  胶孢炭疽菌Pth11-like型CFEM蛋白CgCFEM17的功能分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250009
    [7] 胡文成, 朱寿松, 王艺璇, 阳达, 陈银华.  木薯茉莉酸氧化酶JOXs基因家族的鉴定及表达模式分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240199
    [8] 张子赫, 郑蔺玲, 李可, 陈银华, 高豫.  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族的鉴定与表达分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250035
    [9] 唐璐芝, 吴竞远, 陈元来, 朱彬彬, 赵惠萍.  木薯RXam2的原核蛋白表达及抗病功能分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240147
    [10] 冯亚亭, 张逸杰, 林南方, 陈银华, 骆凯.  木薯不同组织内生细菌多样性的比较分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230077
    [11] 贾素行, 朱寿松, 符仁稳, 李春霞, 陈银华.  木薯MePPD3基因的克隆及功能分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
    [12] 邓雅洁, 刘云豪, 孙琪, 邱越, 宋家明, 赖杭桂.  在干旱胁迫下有性四倍体木薯叶片的蛋白质组学研究 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.010
    [13] 董晨, 魏永赞, 王弋, 郑雪文, 李伟才.  转录组荔枝Dof基因家族的鉴定及其表达 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.01.002
    [14] 唐佳, 倪兴振, 邢皓程, 王佑笑, 杨倩曦, 闫智聪, 周智, 赵建民.  鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重组蛋白的表达及其体外抑菌活性特征 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.001
    [15] 张伊动, 马香, 李宏, 唐鸿倩, 刘柱, 唐燕琼.  维氏气单胞菌Cbl蛋白的原核表达及纯化 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.03.009
    [16] 门佳丽, 李芳, 孙进华, 许云.  荔枝‘妃子笑’AP2同源基因的克隆及表达 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.009
    [17] 赵锐, 樊若晨, 丁凯旋, 唐枝娟, 王红刚, 黄思源, 蒋凌雁, 陈银华, 耿梦婷.  木薯MeNOSIP与MeRbohD蛋白的互作验证及其对外源激素的响应 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.007
    [18] 闫冰玉, 巩笑笑, 谭玉荣, 王丹, 高璇, 张恒, 李双江, 王鹏, 潘英文, 刘进平.  文心兰OnRR10基因的克隆及表达分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.03.005
    [19] 白雪杨, 陈秀珍, 黄天帆, 江行玉, 周扬.  盐胁迫下拟南芥SCAMP基因克隆和表达的生物信息学分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.003
    [20] 宋娜, 张刘宁颖, 曹敏, 郭文雅, 洪雨慧, 吴金山, 陈银华, 于晓惠.  木薯ERF转录因子调控的靶基因筛选与表达分析 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.008
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-09-14
  • 录用日期:  2025-02-28
  • 修回日期:  2024-11-05

木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
    基金项目:  海南省研究生创新科研课题资助项目(Qhys2023-252)
    作者简介:

    刘小丽(1999—),女,海南大学热带农林学院2022级硕士研究生。E-mail:dmyvsm5q@126.com

    通讯作者: 韦运谢(1989—),女,研究员,博士生导师。研究方向:热带作物分子生物学。E-mail:994016@hainanu.edu.cn
  • 中图分类号: S533

摘要: 为了探究Aux/IAA基因的初步功能,本研究克隆并鉴定了木薯(Manihot esculentaMeIAA19基因,通过生物信息学分析发现,该基因编码244个氨基酸,具有典型Aux/IAA蛋白的PB1保守结构域。通过构建MeIAA19-pET32a原核表达载体,诱导表达出该蛋白,并通过外源施加蛋白促进木薯植株活性氧爆发和MePRs基因表达量。基因表达分析表明,MeIAA19基因的表达量在Xam侵染过程中随时间的延长而增加。本研究结果显示,木薯MeIAA19基因可能参与了木薯免疫。

English Abstract

刘小丽,韦运谢. 木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−7. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
引用本文: 刘小丽,韦运谢. 木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−7. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
LIU Xiaoli, WEI Yunxie. Cloning and preliminary functional analysis of MeIAA19 in cassava[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
Citation: LIU Xiaoli, WEI Yunxie. Cloning and preliminary functional analysis of MeIAA19 in cassava[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
  • 植物激素是植物生长和发育的关键调节因子,广泛参与植物抵御环境胁迫[1]。植物面对外界胁迫时,一般会激活其体内复杂的免疫调控网络,包括植物体内激素浓度的变化、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的爆发、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)的激活、胼胝质沉积增加和防御相关基因表达等[2]。生长素几乎存在于所有植物中,参与植物细胞发育的各个阶段。此外,还作为植物免疫信号网络的调节因子参与调节植物发育和防御之间的平衡[3]Aux/IAAAuxin/indoleacetic acid)、SAURsmall auxin-up RNA)、GH3Gretchen Hagen 3)3个家族属于生长素早期应答基因家族[4]。其中,Aux/IAA家族在生长素早期响应中起核心作用,调控生长素信号转导的整个过程[5]。目前,Aux/IAA蛋白已被证实是生长素反应的负调节因子,其可通过与生长素反应因子ARF(Auxin response factor)相互作用进而调节其转录活性发挥作用[4]。在番茄(Solanum lycopersicum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)和马铃薯(Solanum tuberosum)等植物中分别鉴定26、34、31、25、31和26个Aux/IAA基因成员[6-11]。研究表明,拟南芥的AtIAA3AtIAA19AtIAA28参与其侧根的形成[12]。小麦(Triticum aestivumTaIAA1参与调控其根、叶、花等器官的发育[13]。而番茄的SlIAA27沉默植株可提高对生长素的感应,导致胚珠和花粉的发育均明显下降[14]。此外,有研究报道,Aux/IAAs在各种逆境胁迫中起着关键作用,如OsIAA18通过调节ABA信号传导,参与水稻的耐旱和耐盐性[15]AtIAA5AtIAA6AtIAA19则通过调节脂肪族硫代葡萄糖苷(Glucosinolate,GLS)的水平进而调控拟南芥耐旱性[16]。也有研究表明,IAAs参与植物的生物胁迫应答反应,如棉花(Gossypium hirsutum)的GhIAA43表达量受黄萎菌Verticillium dahliae 侵染影响,且通过调节水杨酸合成和信号传导相关基因表达介导棉花对V. dahliae抗性[17],目前,关于热带作物木薯(Manihot esculentaAux/IAAs的相关研究鲜见报道,在不同品种(‘SC124’、‘F01’、‘16P’、‘F9I’、‘KU50’和‘C4’)中,通过脱落酸、盐、低温、高温、干旱胁迫仅处理分析了Aux/IAAs的表达量[18],具体功能有待进一步探究。

    木薯(Manihot esculenta)是重要的粮食作物和经济作物,是世界热带和亚热带地区近10亿人赖以生存的主粮[19],也被广泛用于制药、造纸及饲料加工等行业,是我国生产饲料、乙醇和工业淀粉等的重要原材料。在农业生产中,木薯产量受到诸多生物和非生物因素的制约。本研究从木薯‘SC124’品种克隆了MeIAA19基因,通过生物学信息分析、蛋白亚细胞定位和蛋白的生物学功能分析,初步明确了MeIAA19蛋白功能,现报道如下。

    • 试验材料为木薯品种‘SC124’ (South China 124)的后代,种植于海南大学海甸校区热带农业试验基地(20°03′N,110°19′E)。

    • 取适量木薯叶片进行液氮速冻,将其充分研磨至粉末,使用CTAB法[20]提取RNA,反转录为cDNA后,−80 ℃低温储存。

      根据Phytozome数据库中木薯MeIAA19基因的序列信息,设计全长扩增引物MeIAA19-F(ATGGCGAGCGTGCTAGGAGGC)和MeIAA19-R(TCAGGTTCTGCTCTTGCATTT)。以木薯cDNA为模板,使用Pfu高保真酶扩增MeIAA19片段。产物经琼脂糖凝胶电泳检测后进行切胶回收,并连接至pEASY-T3载体中。转化后经菌落PCR检测,挑选条带单一的阳性克隆测序验证。将测序对比结果与目的片段一致的菌液低温保存备用。

    • 通过在线软件ProtParam分析MeIAA19编码蛋白的理化性质。使用在线网站InterPro鉴定MeIAA19蛋白序列内的保守结构域。通过数据库Phytozome13查找MeIAA19在其他物种中的同源序列,并运用DNAMAN软件进行比对。

    • 利用数据库UniProt对木薯MeIAA19蛋白进行亚细胞定位预测。构建植物表达载体pEGAD-MeIAA19,与空载pEGAD分别转入GV3101农杆菌感受态,并侵染烟草叶片48 h后,通过激光共聚焦显微镜观察侵染的叶片。

    • 根据同源重组原理重新设计引物,并在R端加Flag标签,以测序正确MeIAA19-T3的质粒为模版扩增目的片段,连接至BamHI和EcoRI酶切回收后的pET32a载体上,进一步挑取单菌落进行PCR并酶切验证。将验证成功的质粒转入DE3大肠菌株中,并诱导蛋白。菌液OD600值为0.6左右时,加入IPTG,并取0、1、3、6 h样品,离心后弃上清,留存菌体。最后使用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)重悬菌体后进行检测[21]

    • 将37 ℃条件下诱导0、1、3、6 h的蛋白样品,离心并重悬。在其中加入蛋白上样缓冲液,涡旋充分,进行SDS-PAGE电泳检测。电泳完成后,分别进行考马斯亮蓝染色和WB检测[22]

    • 按照1.5步骤摇菌诱导蛋白后,测定MeIAA19-pET32a和pET32a蛋白浓度,以0.5 mg·mL−1的浓度进行早晚喷施木薯叶片。3 d后取样测活性氧并提RNA反转录cDNA,分析MePR1和MePR2的表达量。

    • 所用Xam菌株由实验室自行分离鉴定。将Xam菌株活化后用无抗LB在28 ℃条件下培养12 h后,将菌液放入离心机中4 000 r·min−1,离心10 min得到菌体,用渗透液(100 mL ddH2O中含1 mL 1 mol·L−1 的MgCl2,pH5.7)重悬菌体后接种处理木薯叶片。

    • 使用引物对MeIAA19-F/R对木薯叶片的cDNA进行PCR扩增,获得约750 bp大小的特异亮带(图1),将目的片段进行回收纯化后连接pEASY-T3载体并转化至大肠杆菌中。通过单菌落PCR验证,得到条带大小与目的片段一致的阳性克隆,并将以上单克隆摇菌送测序。测序结果显示扩增序列片段长732 bp,序列比对后发现其与木薯基因组数据库中的MeIAA19基因序列一致。

      图  1  MeIAA19全长扩增

      Figure 1.  Amplification of full-length MeIAA19

    • 使用在线工具ProtParam分析MeIAA19编码蛋白的理化性质,结果显示:MeIAA19编码244 aa,等电点为6.63,蛋白分子量为26.64 kDa,脂肪系数为67.90,亲水系数为−0.515(<0),不稳定系数为37.71(<40),属于稳定亲水蛋白(表1)。同时,使用InterPro在线网站鉴定MeIAA19蛋白序列内的保守结构域,发现MeIAA19蛋白在其16~234 aa中含有AUX/IAA结构域,其中,125~225 aa处含有1个PB1保守结构域,与AUX/IAA家族的特征一致(图2)。

      表 1  MeIAA19编码蛋白的理化性质

      Table 1.  The physical and chemical properties of MeIAA19

      基因
      Gene
      蛋白分子量/kDa
      Protein molecular weight/kD
      等电点
      Isoelectric point
      GRAVY
      亲水性平均值
      脂肪系数
      Aliphatic index
      不稳定指数
      Instability Index
      氨基酸数量
      Number of amino acids
      IAA1926.648.20−0.51567.9037.71244

      图  2  MeIAA19蛋白结构分析

      Figure 2.  Structural analysis of MeIAA19 protein

    • 为了研究MeIAA19蛋白在不同植物中是否具有较高的同源性,将MeIAA19与杨树(Populus deltoides)、水稻、拟南芥、大豆(Glycine max)、香蕉(Musa acuminata)、番茄、马铃薯的IAAs序列进行同源比对,发现IAAs蛋白在不同的植物中具有较高的特异性,且在C端具有较高的保守性(图3)。MeIAA19与杨树中IAA蛋白的同源性最高,同源性为84.67%。

      图  3  MeIAA19与不同植物中的同源基因序列比对

      Figure 3.  The multiple sequence alignment of MeIAA19 with homologous genes from different plants

    • 为了探究MeIAA19蛋白在植物体内的亚细胞定位,对MeIAA19蛋白的定位进行预测,结果表明:MeIAA19蛋白定位于细胞核中(图4−A)。同时,为了进一步确定其定位,通过农杆菌侵染烟草观察荧光发现对照组pEGAD空载在细胞核和细胞质均分布较强的绿色荧光信号,而融合表达载体MeIAA19-pEGAD只在细胞核观察到绿色荧光,与DAPI染色结果一致,说明MeIAA19蛋白定位于细胞核中(图4−B)。

      图  4  MeIAA19的亚细胞定位

      Figure 4.  Subcellular localization of MeIAA19

    • 提取测序正确的MeIAA19-T3菌株质粒,并通过PCR扩增得到目的片段(图5−A),通过同源连接法将MeIAA19连接到pET32a载体上,再进行菌落PCR验证(图5−B),进一步双酶切验证获得4个阳性克隆(图5−C),表明MeIAA19-pET32a融合载体构建成功。将构建好的MeIAA19-pET32a (DE3)菌株置于37 ℃诱导蛋白,分别于诱导表达0、1、3、6 h取蛋白样品。

      图  5  MeIAA19-pET32a原核表达载体构建

      Figure 5.  Construction of the prokaryotic expression vector MeIAA19-pET32a

    • 将上述取的不同时间点蛋白样品进行超声破碎、离心,通过考马斯亮蓝染色(图6−A)和Western blot(图6−B)同时进行验证。结果显示,该温度条件下可以成功诱导目的蛋白,并且随着诱导时间的增加,其蛋白浓度也随之增加。

      图  6  MeIAA19蛋白诱导表达

      Figure 6.  Induced expression of MeIAA19 protein

    • 为了探究MeIAA19蛋白是否参与木薯的免疫反应,将MeIAA19-pET32a和对照pET32a蛋白分别喷施于木薯叶片上,发现喷施MeIAA19-pET32a蛋白后,其活性氧爆发明显增加与对照组相比(图7−A)。同时,实验组中MePR1的表达量是对照组5倍、MePR2表达量是对照组的2倍(图7−B),差异极显著,推测该蛋白参与木薯免疫反应。

      图  7  MeIAA19蛋白功能分析

      Figure 7.  The function analysis of MeIAA19 protein

    • 为进一步探究MeIAA19在响应生物胁迫中的功能,分析其在Xam胁迫处理下的表达模式,发现接种XamMeIAA19的转录水平在0~24 h内随时间的增加呈现上升的变化趋势(图8),进一步表明MeIAA19可能参与木薯的免疫反应。

      图  8  MeIAA19基因在Xam侵染下的表达分析

      Figure 8.  The expression level of MeIAA19 under Xam infection

    • 生长素几乎在所有植物中都有存在,广泛参与植物生长、发育及各种逆境胁迫等过程[3, 2324]AUX/IAA家族是生长素早期响应的关键家族,是调控植物生长素反应的重要转录调节因子,与生长素反应因子相互作用发挥功能[56]

      本研究从木薯中克隆并鉴定MeIAA19基因,其编码蛋白包含1个Phox and Bem1p(PB1)保守结构域,该结构域促进Aux/IAA和ARF蛋白的相互作用[25],推测MeIAA19可能与ARF蛋白互作,进而通过IAA信号介导木薯的生长发育和响应胁迫反应,还需进一步的升入探究。通过烟草瞬时转化证实MeIAA19定位于细胞核。此外,外源施加该蛋白可显著诱导木薯的活性氧爆发和免疫相关基因MePRs的表达。这些结果表明MeIAA19可能通过活性氧信号和水杨酸信号调节木薯的免疫反应,与前人的研究结果基本一致[26]。本研究通过原核表达蛋白并分析该蛋白的功能,缩短研究周期,是一种快速研究基因功能的简单便捷的方法。

      研究表明,AUX/IAA基因家族参与植物免疫[17],通过对木薯叶片进行Xam胁迫处理,发现MeIAA19转录水平随Xam侵染时间的增加呈现上升的变化趋势。在拟南芥中,AUXIN RESISTANT2AXR2)(编码IAA7蛋白)和AUXIN RESISTANT3AXR3)(编码IAA17蛋白)的表达量在Fusarium oxysporum处理下被显著诱导表达,且负调控拟南芥对F.oxysporum的抗性[27]。此外,棉花的GhIAA43通过调节水杨酸合成和信号传导相关基因(PALPAD4NPR1EDS1PR1PR2PR3PR4)表达介导棉花对V.dahliae抗性[17]。同样,水杨酸通过稳定IAA7蛋白从而介导拟南芥对Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (PstDC3000) 的抗性[28],推测MeIAA19可能通过介导多个信号通路参与木薯对细菌性枯萎病的抗性。同时,这些结果表明IAAs广泛参与介导植物对细菌性和真菌性病害的免疫反应。此外,研究表明MeIAA19主要在不同品种苗期和主根的形成期表达,且低温、高温、盐胁迫等非生物胁迫处理抑制其表达[18],说明MeIAA19可能参与木薯苗期的发育和主根的形成。总之,MeIAA19有望作为潜在的木薯抗病育种候选基因。这对后续探究木薯MeIAA19抗逆的调控机理奠定基础,也为发掘MeIAA19在木薯遗传改良或生物技术应用中的潜在价值提供参考。

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