绿色木霉碱性蛋白酶基因<i>TvALP</i>的克隆与原核表达

徐杨玉; 刘付香; 洪彦彬; 陈小平; 李海芬; 温世杰; 李杏瑜; 李玲; 梁炫强

doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

1. 广东省农业科学院作物研究所, 广州 510640;
2. 广东农垦热带农业研究院有限公司, 广州 511365;
3. 广东省中山市实验中学, 广东中山, 528404;
4. 华南师范大学生命科学学院, 广州 510631

基金项目:

2023年国家花生产业技术体系遗传改良研究室岗位科学家项目(CARS-13)

广东省自然科学基金重点项目(07117967)

详细信息

第一作者:
徐杨玉(1987-),男,高级农艺师。研究方向:花生黄曲霉生物防治。E-mail:574301612@qq.com

通信作者:
梁炫强(1964-),男,博士,研究员。研究方向:花生抗黄曲霉研究。E-mail:Liang804@yahoo.com

中图分类号: Q78

The cloning and prokaryotic expression of the alkaline protease gene TvALP from Trichoderma viride

1. Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, Guangdong 510640;
2. Guangdong Agribusiness Tropical Agriculture Research Co., Ltd., Guangzhou, Guangdong 511365;
3. Guangdong Zhongshan Experimental Middle School, Zhongshan, Guangdong 528404;
4. School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou, Guangdong 510631, China

摘要: 基于绿色木霉中抗菌蛋白质的de-novo质谱测定得到的部分肽段序列，通过BLASTp数据库检索，发现该肽段由碱性蛋白酶基因编码，采取同源克隆技术扩增出目的基因片段。生物信息学分析揭示，TvALP基因（GenBank编号KJ659907）完整开放读码框为1 230 bp，并编码了一个由409个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质的预测分子量约为43 kD，且含有一段由20个氨基酸组成的信号肽。根据分类，该蛋白质属于Peptidase inhibitor＿I9超家族，并且是枯草杆菌蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶S8家族的一个成员。利用双酶切法将测序正确的质粒连接至原核表达载体pET30a中，在宿主菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达。结果在45 kD处显示出1条特异蛋白质条带，与生物性信息预测目的蛋白大小一致，表明切除信号肽的表达质粒pET30a-ΔTvALP（“Δ”表示切除信号肽）在宿主菌BL21(DE3)pLysS中成功表达。经超声波破碎后，蛋白形成了包涵体。但经体外复性技术，未能获得有活性的蛋白进行抗菌机理研究。
- 绿色木霉 /
- 碱性蛋白酶基因 /
- 原核表达 /
- 包涵体
Abstract: A peptide sequence was identified from antimicrobial proteins in Trichoderma viride based on the denovo mass spectrometry determination. Through BLASTp database searching, it was found that this peptide sequence is encoded by a alkaline proteinase gene, and the target gene fragment was amplified using homologybased cloning. Bioinformatics analysis reveals that the TvALP gene（GenBank number KJ659907） has a complete open reading frame of 1 230 bp and encodes a protein composed of 409 amino acids. This protein has a predicted molecular weight of about 43 kD, and an isoelectric point of 7.96, and contains a signal peptide composed of 20amino acids. According to classification, the protein belongs to the peptidase inhibitor＿I9 superfamily and is a member of the subtilisin serine protease S8 family. The sequenced plasmid was ligated into the prokaryotic expression vector pET30a using double digestion, and the expression was induced in the host bacterium BL21（DE3）pLysS. The result showed a specific protein band at 45 kD, which was consistent with the predicted size of the target protein, indicating that the expression plasmid pET30a-ΔTvALP（“Δ” Signaling peptide excision） was successfully expressed in the host bacterium BL21（DE3）pLysS. After sonication, the protein formed inclusion bodies. However, after in vitro renaturation, no active protein was obtained for antibacterial mechanism research.
- Trichoderma viride /
- alkaline proteinase gene /
- prokaryotic expression /
- inclusion bodies

[1]	曾立,程万里,余豪,等.多粘类芽孢杆菌KM2501-1发酵液对番茄根结线虫的防治效果[J].应用与环境生物学报, 2020, 26(5):1046-1050.
[2]	范亚磊,赵敏,邓晟,等.侵染江苏猕猴桃的北方根结线虫(Meloidogyne hapla)形态学描述和分子特征分析[J].江苏农业学报, 2021, 37(1):75-82.
[3]	李通,毛维兴,薛应钰,等.绿色木霉B3菌株发酵液杀线活性分析及其稳定性测定[J].西北农业学报, 2019,28(9):1535-1542.
[4]	PENG K C, LIN C C, LIAO C F, et al. Expression of Lamino acid oxidase of Trichoderma harzianum in tobacco confers resistance to Sclerotinia sclerotiorum and Botrytis cinerea[J]. Plant Science:an International Journal of Experimental Plant Biology, 2021, 303:110772.
[5]	SWAIN H, ADAK T, MUKHERJEE A K, et al. Novel Trichoderma strains isolated from tree barks as potential biocontrol agents and biofertilizers for direct seeded rice[J].Microbiological Research, 2018, 214:83-90.
[6]	YOUSSEF S A, TARTOURA K A, ABDELRAOUF G A.Evaluation of Trichoderma harzianum and Serratia proteamaculans effect on disease suppression, stimulation of ROS-scavenging enzymes and improving tomato growth infected by Rhizoctonia solani[J]. Biological Control,2016, 100:79-86.
[7]	刘畅,张欣玥,蔡汶妤,等.绿色木霉与哈茨木霉对黄瓜幼苗促生作用机理的研究[J].江苏农业科学, 2020,48(16):156-160.
[8]	王禹佳,武佶,李享,等.发根农杆菌与绿色木霉对玉米幼苗根系生长的影响[J].江苏农业科学, 2020, 48(15):112-117.
[9]	RODRIGUEZ-KABANA R, KELLEY W D, CURL E A.Proteolytic activity of Trichoderma viride in mixed culture with Sclerotium rolfsii in soil[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1978, 24(4):487-490.
[10]	叶思帆,赵媛.微生物源碱性蛋白酶的生产及其应用[J].青海科技, 2018, 25(2):73-76.
[11]	王兴吉,佟新伟,王克芬,等.芽孢杆菌产碱性蛋白酶的研究进展[J].食品与发酵科技, 2019, 55(1):62-65.
[12]	KUMAR C G, TAKAGI H. Microbial alkaline proteases:from a bioindustrial viewpoint[J]. Biotechnology Advances,1999, 17(7):561-594.
[13]	RAJAN S, MURUGESAN A. Optimization and Production of Alkaline Protease enzyme from Bacillus subtilis168 isolated from food industry waste[J]. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences,2014, 3(6):36-44.
[14]	BARZKAR N. Marine microbial alkaline protease:an efficient and essential tool for various industrial applications[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 161:1216-1229.
[15]	SHARMA K M, KUMAR R, PANWAR S, et al. Microbial alkaline proteases:Optimization of production parameters and their properties[J]. Journal, Genetic Engineering&Biotechnology, 2017, 15(1):115-126.
[16]	BHATT H B, SINGH S P. Cloning, expression, and structural elucidation of a biotechnologically potential alkaline serine protease from a newly isolated haloalkaliphilic Bacillus lehensis JO-26[J]. Frontiers in Microbiology,2020, 11:941.
[17]	SZEKERES A, KREDICS L, ANTAL Z, et al. Isolation and characterization of protease overproducing mutants of Trichoderma harzianum[J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 233(2):215-222.
[18]	SUÁREZ M B, VIZCAÍNO J A, LLOBELL A, et al. Characterization of genes encoding novel peptidases in the biocontrol fungus Trichoderma harzianum CECT 2413using the TrichoEST functional genomics approach[J].Current Genetics, 2007, 51(5):331-342.
[19]	纪明山,李博强,陈捷,等.绿色木霉TR-8菌株对尖镰孢的拮抗机制[J].中国生物防治, 2005, 21(2):104-108.
[20]	迟玉杰,杨谦,宋颖琦.对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定[J].哈尔滨工业大学学报, 2002,34(6):784-788.
[21]	POZO M J, BAEK J M, GARCıA J M, et al. Functional analysis of tvsp1, a serine protease-encoding gene in the biocontrol agent Trichoderma virens[J]. Fungal Genetics and Biology, 2004, 41(3):336-348.
[22]	KAPAT A, ZIMAND G, ELAD Y. Effect of two isolates of Trichoderma harzianumon the activity of hydrolytic enzymes produced by Botrytis cinerea[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1998, 52(2):127-137.
[23]	徐杨玉,刘付香,洪彦彬,等.绿色木霉对花生黄曲霉毒素污染的防治[J].热带生物学报,2019,10(4):367-371. DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2019.04.010.
[24]	康彬,童哲.一种利于蛋白质回收的快速SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色-脱色方法[J].生物化学与生物物理进展, 2000, 27(2):210-211.
[25]	BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72:248-254.
[26]	RAWLINGS N D, BARRETT A J. Proteolytic enzymes:serine and cysteine peptidases[J]. Methods in Enzymology, 1994, 244(26):19-61.
[27]	黄萱,徐子勤,陈立余,等.小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J].分子细胞生物学报, 2006,39(2):91-96.
[28]	YAHIAOUI N, SRICHUMPA P, DUDLER R, et al.Genome analysis at different ploidy levels allows cloning of the powdery mildew resistance gene Pm3b from hexaploid wheat[J]. The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology, 2004, 37(4):528-538.
[29]	姜海霞,刘永生,杨孝朴,等.人朊蛋白基因的克隆与原核表达[J].甘肃农业大学学报, 2006, 41(3):11-15.
[30]	王晓东,牟玉莲,张莉,等.近交五指山小型猪SLADQA基因的克隆及在大肠杆菌的原核表达[J].甘肃农业大学学报, 2006, 41(4):23-26.

[1]	彭晓莹, 金海峰, 闫文乾, 咸利民, 席羽, 张宝琴. 三叶草斑潜蝇过氧化氢酶基因的克隆、表达及其对温度的响应 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-10. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240033
[2]	胡文成, 朱寿松, 王艺璇, 阳达, 陈银华. 木薯茉莉酸氧化酶JOXs基因家族的鉴定及表达模式分析 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-10. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240199
[3]	胥梦洋, 刘钰, 王海博, 徐文鑫, 张秀丽, 冯顺, 李茂富. 油梨乙酰辅酶A羧化酶基因家族鉴定及表达分析 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-11. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250037
[4]	姜浩楠, 吕雨蝶, 邬伊萍, 邬国良, 王睿, 张漫漫, 刘铜. 降解莠去津木霉筛选鉴定及其降解条件优化 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-11. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240204
[5]	刘梓权, 朱家红, 王颖, 李辉亮, 李玉姬, 唐燕琼, 郭冬. 橡胶树HbbZIP74基因的表达分析及蛋白原核表达纯化 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-11. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250015
[6]	刘小丽, 韦运谢. 木薯MeAux/IAA19基因的克隆及功能初探 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-7. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240145
[7]	谭梦婷, 徐浩然, 曾鸿秋. MeDAWDLE基因的克隆和蛋白功能验证 . 热带生物学报, 2025, 16(3): 370-378. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240146
[8]	唐璐芝, 吴竞远, 陈元来, 朱彬彬, 赵惠萍. 木薯RXam2的原核蛋白表达及抗病功能分析 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-9. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240147
[9]	郑伊蒙, 段家文, 张艺, 李晨辉, 谢珍玉, 黄爱优. 三角褐指藻乳酸脱氢酶的原核表达及纯化鉴定 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-8. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240176
[10]	丁家辉, 张倩玉, 袁红梅. 橡胶草TkBZR家族基因的鉴定与原核表达分析 . 热带生物学报, 2025, 16(): 1-11. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250029
[11]	刘云飞, 李言, 田维敏. 橡胶树蛋白激酶基因SnRK2.7的克隆及表达 . 热带生物学报, 2024, 15(1): 1-9. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230004
[12]	李飞航, 武浩恒, 李宏, 李娟娟, 马香, 唐燕琼, 刘柱. 抗菌肽Cathelicidin-1真核表达及发酵液抑菌活性鉴定 . 热带生物学报, 2023, 14(5): 474-480. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230010
[13]	谢言, 邢薿文, 肖倩, 覃尧. 装载鸡传染性支气管炎病毒 S1蛋白重组HD11细胞源外体的构建 . 热带生物学报, 2022, 13(6): 562-568. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.06.004
[14]	邓雅洁, 刘云豪, 孙琪, 邱越, 宋家明, 赖杭桂. 在干旱胁迫下有性四倍体木薯叶片的蛋白质组学研究 . 热带生物学报, 2021, 12(2): 210-218. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.010
[15]	唐佳, 倪兴振, 邢皓程, 王佑笑, 杨倩曦, 闫智聪, 周智, 赵建民. 鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重组蛋白的表达及其体外抑菌活性特征 . 热带生物学报, 2021, 12(2): 139-146. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.001
[16]	张伊动, 马香, 李宏, 唐鸿倩, 刘柱, 唐燕琼. 维氏气单胞菌Cbl蛋白的原核表达及纯化 . 热带生物学报, 2021, 12(3): 333-339. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.03.009
[17]	曹欣, 唐燕琼, 李宏, 马香, 刘柱. Flag-ALD融合载体构建及蛋白表达 . 热带生物学报, 2020, 11(2): 132-137, 155. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.002
[18]	张转丹, 肖正泮, 武新丽, 孙艳, 罗应, 吴昊, 韦双双, 裴业春, 王大勇. 鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1融合基因的原核表达 . 热带生物学报, 2020, 11(2): 145-155. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.004
[19]	武新丽, 韦双双, 裴业春, 赵景锋, 王大勇. 反相高效液相色谱法对小鼠血清中基因重组人促肾上腺皮质激素前体及其代谢物的测定 . 热带生物学报, 2019, 10(1): 83-88. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2019.01.014
[20]	高豫, 庄南生, 王英, 高和琼. MYC基因家族5成员在巴西橡胶树染色体上的物理定位 . 热带生物学报, 2018, 9(2): 163-169. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.02.006

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绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

第一作者:
徐杨玉(1987-),男,高级农艺师。研究方向:花生黄曲霉生物防治。E-mail:574301612@qq.com

通信作者:
梁炫强(1964-),男,博士,研究员。研究方向:花生抗黄曲霉研究。E-mail:Liang804@yahoo.com

The cloning and prokaryotic expression of the alkaline protease gene TvALP from Trichoderma viride

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绿色木霉碱性蛋白酶基因TvALP的克隆与原核表达

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

1. 广东省农业科学院作物研究所, 广州 510640;

2. 广东农垦热带农业研究院有限公司, 广州 511365;

3. 广东省中山市实验中学, 广东中山, 528404;

4. 华南师范大学生命科学学院, 广州 510631

作者简介:
徐杨玉(1987-),男,高级农艺师。研究方向:花生黄曲霉生物防治。E-mail:574301612@qq.com

通讯作者: 梁炫强(1964-),男,博士,研究员。研究方向:花生抗黄曲霉研究。E-mail:Liang804@yahoo.com

English Abstract

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doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240077

第一作者: 徐杨玉(1987-),男,高级农艺师。研究方向:花生黄曲霉生物防治。E-mail:574301612@qq.com

通信作者: 梁炫强(1964-),男,博士,研究员。研究方向:花生抗黄曲霉研究。E-mail:Liang804@yahoo.com

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1. 广东省农业科学院 作物研究所, 广州 510640; 2. 广东农垦热带农业研究院有限公司, 广州 511365; 3. 广东省中山市实验中学, 广东 中山, 528404; 4. 华南师范大学 生命科学学院, 广州 510631

作者简介: 徐杨玉(1987-),男,高级农艺师。研究方向:花生黄曲霉生物防治。E-mail:574301612@qq.com

通讯作者: 梁炫强(1964-),男,博士,研究员。研究方向:花生抗黄曲霉研究。E-mail:Liang804@yahoo.com

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第一作者:
徐杨玉(1987-),男,高级农艺师。研究方向:花生黄曲霉生物防治。E-mail:574301612@qq.com

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梁炫强(1964-),男,博士,研究员。研究方向:花生抗黄曲霉研究。E-mail:Liang804@yahoo.com

1. 广东省农业科学院作物研究所, 广州 510640;

2. 广东农垦热带农业研究院有限公司, 广州 511365;

3. 广东省中山市实验中学, 广东中山, 528404;

4. 华南师范大学生命科学学院, 广州 510631

作者简介:
徐杨玉(1987-),男,高级农艺师。研究方向:花生黄曲霉生物防治。E-mail:574301612@qq.com