供试的木薯品种：‘TM60444’，种植于海南大学儋州试验基地，由本实验室种植和保存。菌株：由本实验室在广西分离和保存的Xpm11菌株。主要试剂：多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP441，北京），FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂（TIANGEN，KR118，北京），TB GREEN Ⅱ（TAKARA，RR820A，北京），DNA Marker（TAKARA，3427A，北京），引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

利用Hmmer3.0版本软件和本地blast，以拟南芥ERF基因为探针^{[17 − 18]}，在下载于Phytozome网站（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）的木薯基因组（v.8.1版本）中筛选候选的木薯ERF基因家族成员。运用SMART网站（http://smart.embl.de/）和CDD网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）鉴定候选基因的结构域，保留含有AP2结构域的基因为木薯ERF基因家族成员。MEGA7.0软件和Evolview网站（https://www.evolgenius.info/evolview/#/）分别用于构建和美化系统进化树。MEME网站（https://meme-suite.org/meme/）用于分析木薯ERF基因家族成员的保守基序并用TBtools可视化。利用TBtools软件分析并构建基因的染色体定位图和基因结构图。提取木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因上游2 000 bp的启动子序列，并利用PlantCARE网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对其进行预测分析，筛选与植物生长发育、光响应、激素响应和环境胁迫响应相关元件，并运用TBtools进行可视化。PlantTFDB网站用于预测木薯ERF基因家族Ⅶ亚族转录因子的靶基因。以拟南芥为参考，在STRING数据库（https://cn.string-db.org/）完成蛋白互作网络的构建。不同组织表达的转录组数据（PRJNA324539，GSE82279）下载于GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），病原菌侵染后的转录组数据来源于实验室先前已有保存数据，后用TBtools可视化分析。利用WGCNA算法构建基因共表达网络。

RNA提取试剂盒提取叶片总RNA，并以1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量。以该RNA为模板，利用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂（TIANGEN，KR118）进行反转录并获得cDNA。之后用木薯通用内参基因（Manes.15G054700, F: TCCACTGGGTAGATTCGCTGTTA, R: TAGCTCCACTTGGGTCCTTCTT）检测cDNA质量，保存该cDNA方便进行后续实验。使用NCBI网站设计木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因的qPCR引物，以病原菌处理前和处理后不同时间点的cDNA为模板，在Rotor-Gene Q（QIAGEN）仪器上进行实时荧光定量PCR分析。qPCR体系为：TB GREEN Ⅱ酶10 μL，上下游引物各1 μL，木薯cDNA模板2 μL，ddH₂O 6 μL，每个时间点设计3个技术性重复。

以拟南芥ERF蛋白序列为探针，在木薯v.8.1版本基因组中鉴定木薯ERF基因家族成员。根据保守结构域，共筛选获得161个木薯ERF蛋白，根据其在染色体上的位置依次命名为MeERF1至MeERF161，具体信息见表1。

为了分析木薯和拟南芥ERF基因家族的系统进化关系，利用234个拟南芥ERF和161个木薯ERF蛋白构建种间系统发育进化树（图1）。从图1可知，木薯ERF基因家族分为13个亚族，包括Ⅰ～Ⅹ和Ⅵ～L亚族，一组只含有拟南芥ERF的Orphans亚族，以及仅含有29个MeERFs的Ⅺ亚族。木薯ERF基因分类与拟南芥ERF基因分类大部分一致，说明大部分木薯ERF基因在长期进化中所编码的相应蛋白并未有遗失。除了仅含有MeERFs的Ⅺ亚族，第Ⅷ亚族和第Ⅵ～L亚族分别含有28个和4个MeERFs，分别是含有木薯基因数量最多和最少的亚族。

图  1  ERF基因家族系统发育关系

Figure 1.  Phylogenetic relationships of ERF gene family

运用TBtools软件分析木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员的基因结构。从图2可知，木薯ERF基因家族Ⅶ亚族所有成员均含有2个外显子，非编码区的数量为2～3个。该结果暗示，木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员的功能和亚细胞定位的差异可能受基因结构的影响^[19]（表2，图2）。

图  2  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因结构

Figure 2.  Gene structure of Ⅶ subfamily genes in cassava ERF gene family

运用MEME网站并以保守基序数目10为条件，对木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员进行保守基序分析。分析结果显示，所有MeERFs均具有包括了AP2结构域的motif1，MeERF46和MeERF92含有10个种类的motifs，其余3个MeERFs仅含有motif1、motif2、motif6、motif8和motif10（图3，表2）。木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员具有类型和数量相似的保守基序，推测该亚族成员的生物学功能相似。

图  3  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族保守基序分析

Figure 3.  Conserved motif analysis of Ⅶ subfamily of cassava ERF gene family

对木薯ERF基因家族Ⅶ亚族的5个基因进行染色体位置分布分析，结果如图4所示。木薯ERF基因家族Ⅶ亚族的成员均分布在染色体两端。其中，60%的基因（MeERF12、MeERF38和MeERF46）分布在染色体下端，其余基因（MeERF92和MeERF133）分布在染色体上端。5个基因分别定位于5条不同的染色体，MeERF12、MeERF38和MeERF46分别定位于1号、3号和4号染色体，MeERF92和MeERF133分别定位于11号和15号染色体。

图  4  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员的染色体定位

Figure 4.  Chromosome localization of cassava ERF Ⅶ subfamily

提取木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因上游2 000 bp的启动子序列进行顺式作用元件分析。由图5可知，木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因均包含具有启动子活性的TATA-box和CAAT-box元件，并且主要含有13种顺式作用元件，分别参与植物的生长发育、光响应、激素响应和环境胁迫响应等过程。木薯ERF基因家族Ⅶ亚族所有成员都含有光响应元件，是数量最多的作用元件。4个木薯ERFs含有生长发育相关的反应元件。此外，激素和胁迫响应的元件类型和数目也较多，包括5种激素相关作用元件和3种胁迫相关作用元件。激素相关作用元件包括，水杨酸，赤霉素和脱落酸是胁迫相关作用元件。在5个基因中，MeERF133包含所有激素相关作用元件，且含有的脱落酸响应元件数量最多。MeERF38和MeERF133含有响应干旱胁迫的顺式作用元件，仅有MeERF46含有响应低温胁迫的顺式作用元件。顺式作用元件分析的结果表明，该亚族成员的表达可能受到光照、多种激素和环境胁迫等因素的诱导。

图  5  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族启动子顺式作用元件分析

Figure 5.  Analysis of cis acting elements of the Ⅶ subfamily promoter of cassava ERF gene family

以拟南芥数据库为参考，通过STRING网站构建蛋白互作网络。如图6所示，MeERF46和MeERF92的同源蛋白是ERF071，MeERF12和MeERF133的同源蛋白为ERF073，MeERF38是ERF110的同源蛋白。由蛋白互作网络图可知，ERF073拥有最多的互作蛋白，而ERF110只有一个互作蛋白（Zinc-finger homeodomain protein 2, ZHD1-2），推测MeERF12和MeERF133可能与更多的蛋白有互作关系（图6）。ERF071和ERF073蛋白与重组拟南芥非共生血红蛋白1（Arabidopsis thaliana Non-symbiotic hemoglobin 1, AHB1）、跨膜蛋白（Transmembrane protein, T31P16.30）、‌LAG1长寿保证同源物3（LAG1 longevity assurance homolog 3, LAG13）和酰基辅酶A结合蛋白2（Acyl-CoA-binding domain-containing protein 2, ACBP2）4种蛋白都有直接的互作关系。该结果暗示，4种MeERF（MeERF46、MeERF92、MeERF12、MeERF133）可能是这4类蛋白的互作蛋白。

图  6  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族的互作蛋白网络图

Figure 6.  Protein-protein interaction of cassava ERF Ⅶ subfamily

利用PlantTFDB网站对木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因进行靶基因预测，仅检索到MeERF133和MeERF92的所有靶基因信息。预测获得的所有靶基因分布在1号到18号染色体上，其中MeERF133的靶基因有1 902个，MeERF92的靶基因有4 147个，其中979个为共有靶基因。利用WGCNA包构建共表达网络，并根据推荐阈值将其分为12个模块（图7），其中MEturquoise组和MEgreen组的基因分别在Xpm_6 h和Xpm_6 d处理组中具有很高的正相关性。该结果表明这两组中的基因可能在不同时间点协同表达，以响应Xpm侵染。MEyellow和MEgrey组的基因分别在Xpm_6 h和Xpm_3 d处理组处理组中具有很高的负相关性，表明这两组中的基因可能在不同时间点响应Xpm的侵染。

图  7  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因共表达网络分析

Figure 7.  Co-expression network of Ⅶ subfamily genes in cassava ERF gene family

为了分析MeERFs在木薯不同组织的表达情况，利用下载于GEO数据库的转录组数据绘制表达热图。表达谱显示，所有基因至少在一种组织中表达，其中MeERF46和MeERF92近乎在所有组织中均有较高表达量，MeERF133在木薯块根中的转录水平呈现高于其余基因在任意组织中的情况（图8−A）。利用本实验室前期获得的木薯受到Xpm侵染后的转录组数据构建基因表达热图，以探究Ⅶ亚族MeERFs基因在抗病中的作用。表达谱显示，除MeERF38基因外，其余基因均有明显表达，MeERF12、MeERF92和MeERF133在病原菌侵染后表达量升高，其中MeERF92表达量变化最显著（图8−B）。MeERF46在病原菌侵染前后的表达量均高于其余基因，而MeERF38的表达量则相反。在5个基因中，MeERF46在不同组织中的表达量较稳定，且相较于亚族内其他成员在叶片中的表达量较高，同时其表达量受Xpm的诱导升高约1倍。基于表达模式分析结果推测，MeERF46可能与木薯正常生长发育及病原菌防御均相关，MeERF38可能积极响应Xpm侵染，MeERF133则主要与块根中的生理功能及响应Xpm的侵染相关。

图  8  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因在木薯不同组织中和受Xpm侵染后的表达模式图

Figure 8.  Expression pattern of Ⅶ subfamily genes of cassava ERF gene family in different tissues of cassava and after Xpm infection

为了进一步验证木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员在木薯遭受病原菌侵染时的转录组水平变化，对木薯ERF基因家族Ⅶ亚族进行定量分析。除了MeERF133，木薯ERF基因家族Ⅶ亚族所有成员基因的表达量均在Xpm侵染3 d后显著上调，随后在Xpm侵染6 d后下调（图9）。在Xpm侵染第3 d时，MeERF92的表达量变化最显著，其次是MeERF38。然而，MeERF38的表达量在Xpm侵染第6 d后迅速下降。MeERF133的表达量呈现逐渐升高的趋势，并且在Xpm侵染第6 d达到顶峰，推测其表达量有可能继续上升。

图  9  木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因在Xpm处理下的表达模式

Figure 9.  Expression patterns of Ⅶ subfamily genes of cassava ERF gene family after Xpm infection

在自然界中，植物进化出一系列应对生物和非生物胁迫的功能，其中转录因子是植物抗逆的关键^[20]。转录因子可以特异结合多种基因启动子区的顺式元件，从而调控植物的生长发育和逆境应答^[21]。属于AP2/ERF超家族的ERF转录因子在植物生长发育和多种胁迫应答中发挥重要作用^[22]。在不同植物中，ERF不仅参与许多信号传导过程，还参与响应病原菌侵染^[23]。已有研究表明，过表达OsERFBP1水稻植株不仅可以提升对水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, Xoo）的抗性，还可以提升水稻抗旱耐涝的能力^[24]；玉米ZmERF105可以积极响应玉米对玉米大斑病菌（E. turcicum）的侵染^[25]。拟南芥AT4g13040和拟南芥AtERF71分别正向调控其对丁香假单胞菌和禾谷镰刀菌的抗性，其中AtERF71属于第Ⅶ亚族^{[26 − 27]}。月季RcERF099正向调控其对葡萄孢菌的抗性^[28]。TFIIE和ASHR1分别是RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ的转录因子（Transcription Factor IE/IIE）和组蛋白赖氨酸甲基化转移酶（Histone-lysine N-methyltransferase）。鉴定于木薯v.6.1版本中的MeERF10对MeTFIIE和MeASHR1均有正调控作用；MeERF137对MeTFIE呈负调控作用，但对MeASHR1呈正调控作用；MeERF58仅对MeTFIIE有正调控作用；而MeERF35仅负调控MeASHR1，推测这4种木薯ERFs参与抗木薯细菌性枯萎病的应答^[29]。

本研究在木薯v.8.1版本基因组中挖掘了161个木薯ERF基因家族成员，并分析其在抗病中的潜在功能。161个MeERFs被分为13个亚族，其中第Ⅶ亚族的作用与抗病、盐胁迫和耐寒相关^[30]。木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员均包含motif2、motif6、motif8和motif10，以及包含了AP2结构域的motif1，说明该亚族蛋白高度保守且具有相似生物学功能。在植物不同发育阶段，不同激素能诱导植物自身产生应对生物及非生物胁迫的信号^[31]，其中茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate, MeJA）可以增强植物的抗病能力^{[32 − 33]}。木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员的启动子区域含有参与植物的生长发育、光响应、激素响应和环境胁迫响应的顺式作用元件。除MeERF12外，所有MeERFs启动子区均含有赤霉素响应元件，推测Ⅶ亚族大部分成员均能响应水淹胁迫，该结果与研究团队鉴定出的深水水稻的ERF基因家族SK1（SNORKEL1）和SK2（SNORKEL2）基因所编码的ERF转录因子作用一致^[34]。ERF能够通过水杨酸激素的信号传导响应生物胁迫^[35]，推测2个MeERFs（MeERF38和MeERF133）可能通过水杨酸激素的信号传导途径以响应病原菌的侵染。MeJA正调控柑橘对轮斑病菌的抗病性，且外源MeJA能够进一步增强柑橘的抗病性^[36]。在激素响应元件中，MeJA响应元件数量最多（54%），推测该亚族成员可能主要通过MeJA途径正调控木薯抗病性。

互作蛋白和靶基因的预测以及共表达网络分析有助于解析木薯ERF的抗病通路。AHB1蛋白具有氧有高亲和性，且在响应生物胁迫过程中发挥作用^[37]。ACBP2蛋白属于酰基辅酶A结合蛋白，是一类脂类载体蛋白，在植物调节生长发育和响应非生物及生物胁迫过程中发挥重要作用^{[38 − 39]}。属于同源异形盒蛋白家族的ZHD1-2，也称ZF-HD蛋白，该类蛋白在植物中生长发育和响应多种生物和非生物胁迫过程中发挥作用^[40]。依据蛋白互作的结果推测，4个MeERF（MeERF46，MeERF92，MeERF12和MeERF133）的互作蛋白可能是AHB1和ACBP2，MeERF38的互作蛋白则可能是ZHD1-2。Ying Zhou等人通过实验验证表明，属于同源异形盒蛋白家族的ACBP2蛋白与拟南芥ERF-Ⅶ有直接相互作用，其互作能增强拟南芥介导缺氧信号的传导从而响应水淹胁迫^[41]。根据共表达分析结果，MeERF46属于MEturquoise模块，是MeERFs与Xpm正响应相关的基因，且在受到Xpm侵染6 h时相关性最高。以上结果表明，木薯ERF基因家族Ⅶ亚族基因可以直接或间接地调控下游基因，参与木薯响应Xpm侵染。

木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员在木薯不同组织中表达差异明显，且2个基因在Xpm病原菌侵染时的表达量上调。不同组织的表达谱显示，MeERF46基因在叶片中的表达量最高，MeERF133和MeERF12分别在块根和茎中的表达量最高，其分别是其余基因的在叶片中表达量的60倍，在块根中表达量的660倍和在茎中表达量的160倍。MeERF46、MeERF92和MeERF133基因的表达量显著受到Xpm的诱导，其转录水平除MeERF92上升2倍外，MeERF46和MeERF133分别上升和下降1倍左右。在5个木薯ERF基因家族Ⅶ亚族成员中，MeERF133基因在块根中的表达量较高，且受到Xpm的侵染后，其表达量在第6 d提高9倍，推测该基因主要在木薯块根中发挥抗病功能。有趣的是，5个木薯ERF的qPCR结果与转录组的表达谱不完全一致，推测不同品种中的该亚族基因对病原菌的响应程度稍有区别。然而，MeERF133基因的表达可能在不同品种中均能受到Xpm的显著诱导。

本研究在木薯基因组（v.8.1）中挖掘获得了161个木薯ERF基因家族成员，并将其分为13个亚族。本研究采用生物信息学分析方法对Ⅶ亚族成员进行了保守结构域、基因结构及保守基序分析、启动子元件分析、互作蛋白和靶基因预测，以及表达模式分析，以推测该亚族成员可能在抗Xpm侵染中的作用。研究发现，该亚族成员在结构上高度保守，且含有多种参与植物生长发育、光响应、激素响应和环境胁迫响应的顺式作用元件；AHB1、ACBP2和ZHD1-2可能是该亚族成员的互作蛋白；MeERF46在Xpm侵染后6 h正响应的相关性最高。该亚族成员在木薯不同组织中的表达丰度和受到Xpm侵染后表达量存在差异，MeERF46、MeERF133和MeERF12分别在叶片、块根、茎组织中高度表达，MeERF92表达量显著受到Xpm的诱导。实时荧光定量的结果进一步证明，MeERF92和MeERF133与木薯抗病性正相关，MeERF92的表达量在第3 d上升了6倍，而MeERF133的表达量在第6 d上升了9倍。本研究表明，该亚族成员在木薯的疾病防御机制中具有潜在作用，且MeERF133、MeERF92和MeERF46与木薯抵抗Xpm的侵染具有十分重要的意义，该结果可为进一步研究木薯的抗病机理和抗病育种提供理论依据。