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木薯MePPD3基因的克隆及功能分析

贾素行 朱寿松 符仁稳 李春霞 陈银华

贾素行,朱寿松,符仁稳,等. 木薯MePPD3基因的克隆及功能分析[J]. 热带生物学报,2024, 15(1):10−18. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
引用本文: 贾素行,朱寿松,符仁稳,等. 木薯MePPD3基因的克隆及功能分析[J]. 热带生物学报,2024, 15(1):10−18. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
JIA Suhang, ZHU Shousong, FU Renwen, LI Chunxia, CHEN Yinhua. Cloning and physicochemical characterization of MePPD3 gene from cassava (Manihot esculenta)[J]. Journal of Tropical Biology, 2024, 15(1): 10-18. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
Citation: JIA Suhang, ZHU Shousong, FU Renwen, LI Chunxia, CHEN Yinhua. Cloning and physicochemical characterization of MePPD3 gene from cassava (Manihot esculenta)[J]. Journal of Tropical Biology, 2024, 15(1): 10-18. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035

木薯MePPD3基因的克隆及功能分析

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
基金项目: 国家自然科学基金地区项目(31860485)
详细信息
    第一作者:

    贾素行(1997−),男,海南大学热带作物学院 2020 级硕士研究生。E-mail:1982888092@qq.com

    通信作者:

    李春霞(1980−),女,博士,教授。研究方向:植物与病原互作机制。E-mail:chun_xia_li@126.com

    陈银华(1976−),男,博士,教授。研究方向:热带作物与微生物互作。E- mail: yhchen@hainanu.edu.cn

  • 中图分类号: S 533

Cloning and physicochemical characterization of MePPD3 gene from cassava (Manihot esculenta)

  • 摘要: 为了探究PsbP蛋白是否在木薯(Manihot esculenta)抗病中发挥功能,以木薯‘华南8号’总RNA为模板,通过RT-PCR扩增MePPD3基因(Phytozome数据库编号:Manes.05G127800)。序列分析结果显示,MePPD3基因全长807 bp,编码268个氨基酸,在氨基酸序列第106~266位存在PsbP结构域,推测其为psbP蛋白。蛋白多序列比对、进化树和保守结构域分析表明,木薯MePPD3蛋白与巴西橡胶(Hevea brasiliensis)中PsbP家族蛋白的同源性最高,同源率高达99%。亚细胞定位显示,MePPD3蛋白定位在叶绿体。qRT-PCR结果显示,MePPD3基因在木薯不同组织中的表达量具有较大差异,在叶片特别是成熟叶片中表达量最高;此外,该基因表达量受到菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas phaseoli pv. manihotis, Xpm)诱导后显著上升。利用VIGS技术沉默MePPD3基因,qRT-PCR结果表明,MePPD3基因沉默成功,其表达量显著下降;Xpm侵染植株后,沉默植株pCsCMV-MePPD3叶片的病斑面积显著小于野生型植株,故推测MePPD3可能负调控木薯对细菌性枯萎病的抗病性。
  • 图  2  MePPD3蛋白的生物信息学分析

    a:磷酸化位点预测;b:糖基化位点预测;c:跨膜结构域预测;d:信号肽预测;e:二级结构预测;f:三级结构预测。

    图  3  MePPD3在不同植物中的同源序列比对

    红线框代表PsbP结构域;蓝线代表叶绿体/线粒体定位信号。

    图  4  不同物种间MePPD3同源蛋白的系统进化树分析

    图  5  MePPD3结构域分析

    图  6  MePPD3蛋白的亚细胞定位

    a:亚细胞定位载体构建;b:MePPD3烟草中亚细胞定位分析,图中线段长度为20 μm。

    图  7  MePPD3基因在木薯不同部位的表达模式图

    *表示P<0.05,下同。

    图  8  病原菌侵染后不同时间MePPD3基因的表达量

    图  9  VIGS沉默植株表型及抗病性检测

    a:沉默成功表型;b:MePPD3基因沉默效率;c:接菌表型;d:统计病斑面积;‘SC8’为野生型、pCsCMV-MePPD3为沉默植株。

    表  1  本研究所用引物

    引物名称 引物序列(5′−3′) 引物用途
    EF1α-F TGCCATGTTCCGTGGAAAGATG 内参基因引物
    EF1α-R CCCCTAGGTGGAATGTCACAGACAC 内参基因引物
    MePPD3-F CATATGATGGCGTCTGTTTCTTTGCTGTC 扩增目的基因
    MePPD3-R GAATTCTCATGAAATGAACCTGAAGGATG 扩增目的基因
    qpcr-MePPD3-F AGACTGATGAGCTTCGCGTT 定量分析
    qpcr-MePPD3-R TGACTTGAACCCGCCGTTAG 定量分析
    1300-MePPD3-F TTGATACATATGCCCGTCGACATGGCGTCTGTTTCTTTGC 亚细胞定位
    1300-MePPD3-R GCCCTTGCTCACCATGGATCCTGAAATGAACCTGAAGGATG 亚细胞定位
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    表  2  MePPD3在不同植物中的同源蛋白

    物种名称学名基因号
    木薯 Manihot esculenta Manes.05G127800.1
    橡胶 Hevea brasiliensis XP_021686524.1
    蓖麻 Ricinus communis XP_015573931.1
    胡杨 Populus euphratica XP_011041160.1
    雷公藤 Tripterygium wilfordii XP_038714823.1
    茶树 Camellia sinensis XP_028073751.1
    芒果 Mangifera indica XP_044475605.1
    麻风树 Jatropha curcas XP_012073570.1
    开心果 Pistacia vera XP_031270258.1
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-03-09
  • 录用日期:  2023-05-04
  • 修回日期:  2023-04-23
  • 网络出版日期:  2023-05-08
  • 刊出日期:  2024-01-16

木薯MePPD3基因的克隆及功能分析

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
    基金项目:  国家自然科学基金地区项目(31860485)
    作者简介:

    贾素行(1997−),男,海南大学热带作物学院 2020 级硕士研究生。E-mail:1982888092@qq.com

    通讯作者: 李春霞(1980−),女,博士,教授。研究方向:植物与病原互作机制。E-mail:chun_xia_li@126.com陈银华(1976−),男,博士,教授。研究方向:热带作物与微生物互作。E- mail: yhchen@hainanu.edu.cn
  • 中图分类号: S 533

摘要: 为了探究PsbP蛋白是否在木薯(Manihot esculenta)抗病中发挥功能,以木薯‘华南8号’总RNA为模板,通过RT-PCR扩增MePPD3基因(Phytozome数据库编号:Manes.05G127800)。序列分析结果显示,MePPD3基因全长807 bp,编码268个氨基酸,在氨基酸序列第106~266位存在PsbP结构域,推测其为psbP蛋白。蛋白多序列比对、进化树和保守结构域分析表明,木薯MePPD3蛋白与巴西橡胶(Hevea brasiliensis)中PsbP家族蛋白的同源性最高,同源率高达99%。亚细胞定位显示,MePPD3蛋白定位在叶绿体。qRT-PCR结果显示,MePPD3基因在木薯不同组织中的表达量具有较大差异,在叶片特别是成熟叶片中表达量最高;此外,该基因表达量受到菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas phaseoli pv. manihotis, Xpm)诱导后显著上升。利用VIGS技术沉默MePPD3基因,qRT-PCR结果表明,MePPD3基因沉默成功,其表达量显著下降;Xpm侵染植株后,沉默植株pCsCMV-MePPD3叶片的病斑面积显著小于野生型植株,故推测MePPD3可能负调控木薯对细菌性枯萎病的抗病性。

English Abstract

贾素行,朱寿松,符仁稳,等. 木薯MePPD3基因的克隆及功能分析[J]. 热带生物学报,2024, 15(1):10−18. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
引用本文: 贾素行,朱寿松,符仁稳,等. 木薯MePPD3基因的克隆及功能分析[J]. 热带生物学报,2024, 15(1):10−18. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
JIA Suhang, ZHU Shousong, FU Renwen, LI Chunxia, CHEN Yinhua. Cloning and physicochemical characterization of MePPD3 gene from cassava (Manihot esculenta)[J]. Journal of Tropical Biology, 2024, 15(1): 10-18. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
Citation: JIA Suhang, ZHU Shousong, FU Renwen, LI Chunxia, CHEN Yinhua. Cloning and physicochemical characterization of MePPD3 gene from cassava (Manihot esculenta)[J]. Journal of Tropical Biology, 2024, 15(1): 10-18. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230035
  • 木薯(Manihot esculenta)是热带地区主要的粮食作物和经济作物,有着“地下粮仓”、“淀粉之王”的称号[1-2],木薯在我国主要用于各种工业原料的生产[3-5],其市场前景十分巨大。菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种(Xanthomonas phaseoli pv. manihotis, Xpm)早已列入我国有害生物名录,它是木薯细菌性枯萎病的病原菌,其能够使木薯叶片褪绿萎蔫甚至全株死亡,可导致木薯减产20%~90%[6-7]。1991年于类囊体腔中首次发现PsbP蛋白,后经过不断研究发现PsbP蛋白广泛存在于藻类、蓝细菌和高等植物中[8-9]。目前,已发现的PsbP蛋白分为3大类,分别是PsbP蛋白、类PsbP蛋白PPL(PsbP-like protein)和PsbP结构域蛋白PPD(PsbP-domain protein)[10-12]。PsbP蛋白是叶绿体光系统Ⅱ(photosystem Ⅱ complex, PSⅡ)的重要组成部分,它在维持钙离子、氯离子浓度方面发挥重要作用;此外,敲除PsbP基因后, PSⅡ的功能将受到一定的影响[13-15]。科学家在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现,PPL1能参与 PSⅡ复合体的组装,其和植物适合光照强度变化有关[16-17];拟南芥的PPL2缺失突变体中,叶绿体NADH脱氢酶的积累量和活性降低[17]。Roose等[8]于2007年从拟南芥基因组中鉴定出7个PPD蛋白,它们分别是PPD1、PPD2、PPD3、PPD4、PPD5、PPD6、PPD7。已有研究发现,PPD1是PSI复合体的组装因子,在拟南芥中,PPD1缺失突变体能导致PSI复合体无法正常组装,从而影响植物的光合作用[18-19];在拟南芥中,PPD5蛋白和OST1相互作用并被其磷酸化,使细胞中H2O2积累增加并使气孔关闭增强[20]。但目前尚未有过任何关于PPD3蛋白功能的研究报道。

    本研究以‘华南8号’木薯为材料,通过qRT-PCR扩增得到MePPD3(Manihot esculenta psbP domain-containing protein 3)基因,并对该基因进行生物信息学分析;同时,对该基因在木薯不同部位和病原菌Xpm CHN11侵染后不同时间的表达模式进行分析;最后利用TRV介导的基因沉默技术沉默MePPD3基因后测定抗病表型,旨在为进一步研究MePPD3基因的分子机理和木薯抗细菌枯萎病的抗病机理提供基础。

    • 大肠杆菌DH5α感受态细胞和农杆菌GV3101感受态细胞购自上海唯地生物;菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种Xanthomonas phaseoli pv. manihotis CHN11由笔者所在实验室提供。

    • 供试的木薯品种为‘华南8号’(‘SC8’),由笔者所在实验室提供。

    • 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(RNA prep Pure Plant Kit)和RNA反转录试剂盒(FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix)购自天根生化科技有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自艾德莱。

    • 从phytozome数据库中下载木薯MePPD3基因的CDS序列,使用Primer Primer 5.0分别设计该基因的全长扩增引物、定量分析引物和亚细胞定位引物。本研究所用引物如表1所示。

      表 1  本研究所用引物

      引物名称 引物序列(5′−3′) 引物用途
      EF1α-F TGCCATGTTCCGTGGAAAGATG 内参基因引物
      EF1α-R CCCCTAGGTGGAATGTCACAGACAC 内参基因引物
      MePPD3-F CATATGATGGCGTCTGTTTCTTTGCTGTC 扩增目的基因
      MePPD3-R GAATTCTCATGAAATGAACCTGAAGGATG 扩增目的基因
      qpcr-MePPD3-F AGACTGATGAGCTTCGCGTT 定量分析
      qpcr-MePPD3-R TGACTTGAACCCGCCGTTAG 定量分析
      1300-MePPD3-F TTGATACATATGCCCGTCGACATGGCGTCTGTTTCTTTGC 亚细胞定位
      1300-MePPD3-R GCCCTTGCTCACCATGGATCCTGAAATGAACCTGAAGGATG 亚细胞定位
    • 取少许木薯叶片于液氮中速冻,用液氮预冷后的研钵进行研磨。使用试剂盒提取木薯RNA并将其反转录为cDNA。以木薯cDNA为PCR模板,以MePPD3-F和MePPD3-R为引物,扩增木薯MePPD3基因序列。待琼脂糖凝胶电泳检测结果无误后,转入植物亚细胞载体pCAMBIA1300-35S-GFP中,挑选阳性单克隆送至楠山生物进行测序。

    • 借助SignalP 5.0 Server 对MePPD3蛋白的信号肽进行预测;通过TMHMM Serverv 2.0分析MePPD3蛋白的跨膜结构;利用NetPhos 3.1 Server在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测MePPD3蛋白的磷酸化位点和糖基化位点;分别使用在线网站PSIPRED.(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index)预测MePPD3蛋白的二级结构和三级结构。

      通过NCBI序列比对,找到MePPD3蛋白在不同植物中的同源蛋白。通过DNAMAN 8.0软件对这9个同源蛋白进行多序列比对;使用MEGA 11.0软件对这些同源蛋白构建NJ进化树;使用MEME在线网站对MePPD3及其同源蛋白进行保守Motif分析。

    • 将构建好的植物亚细胞定位载体pCAMBIA1300-35S-GFP-MePPD3与空载pCAMBIA1300-35S-GFP分别转入GV3101菌株。挑取阳性克隆于28 ℃ 200 r·min−1培养过夜,取适量菌液转移至新的LB(含Kan和Rif)液体培养基中扩大培养。调节OD600≈1.0,黑暗静置2.5 h,注射于生长30 d左右的烟草(Nicotiana tabacum)叶片背面,做好标记,培养40 h后于共聚焦显微镜下观察其荧光。

    • 使用Primer Primer 5.0设计定量引物qpcr-MePPD3-F/R。分别取长势相同的木薯的顶芽、幼嫩叶片、成熟叶片、叶柄、须根、块根等部位,每个部位至少3个生物学重复,液氮速冻后,使用RNA prep Pure Plant Kit试剂盒提取木薯总RNA,然后再按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒的流程反转录cDNA。

    • OD600≈0.05的菜豆黄单胞菌木薯萎蔫致病变种Xpm CHN11侵染多株长势相同的木薯,分别于侵染后0 h、6 h、1 d、3 d、5 d随机剪取叶片,液氮速冻后将其研磨提取RNA,并反转录为cDNA。

    • 构建沉默载体pCsCMV-MePPD3。将其与正对照pCsCMV-B和负对照pCsCMV-A分别转化入GV3101菌株,在LB液体培养基(含Kan和Rif)中培养阳性克隆至OD600=1.0。然后注射于木薯‘SC8’叶片背面,24 ℃培养30 d。

      在LPGA固体培养基(含Chl)上活化Xpm CHN11菌株,活化2次后,用无菌水清洗菌体并稀释至OD600=0.05,用该菌液注射木薯叶片。侵染6 d后,观察叶片表面病斑的扩散情况。

    • 以木薯RNA为模板,MePPD3-F/R为上下游引物,通过RT-PCR技术,得到目的基因MePPD3(Manihot esculenta psbP domain-containing protein 3)(图1-a)。基因序列分析发现,MePPD3基因全长807 bp,编码268个氨基酸。ExPasy在线网站分析结果显示,MePPD3相对分子质量为67 522.75,理论等电点为5.11,分子式为C2467H4129N807O1033S184,不稳定系数为49.9,脂肪系数为27.14,亲水系数为0.775。使用NCBI的CDD数据库分析其保守结构域,结果发现,其氨基酸序列第106~266位存在PsbP结构域(图1-b),推测其为PPD3蛋白。

      图  1  MePPD3基因全长扩增及蛋白结构分析

    • 使用NetPhos在线网站,预测MePPD3蛋白有32个磷酸化位点,其中,有19个丝氨酸、6个苏氨酸和7个酪氨酸(图2-a);有5个糖基化位点(图2-b);使用TMHMM在线网站预测发现,其存在跨膜结构域(图2-c);使用SignalIP在线网站发现,其无信号肽(图2-d);使用PSIPRED在线网站预测MePPD3蛋白二级结构,发现其有6处螺旋结构,其中,螺旋占21.3%,折叠占26.5%,无规卷曲占52.2%(图2-e);通过PHYRE2在线网站预测其三级结构,发现其有6个螺旋结构,这符合二级结构预测结果和PsbP蛋白的结构特征(图2-f)。

      图  2  MePPD3蛋白的生物信息学分析

    • 为研究PPD3蛋白在不同植物中是否具有较高的同源性,首先在NCBI通过BLAST比对,在橡胶(Hevea brasiliensis)、蓖麻(Ricinus communis)、雷公藤(Tripterygium wilfordii)、茶树(Camellia sinensis)、胡杨(Populus euphratica)、芒果(Mangifera indica)、麻风树(Jatropha curcas)、开心果(Pistacia vera)等8种植物中找到了与木薯MePPD3蛋白同源的氨基酸序列(表2)。使用DANMAN 8.0对这些序列进行比对(图3),结果发现,MePPD3蛋白在不同的植物中具有较高的同源性,其中与橡胶中PPD3蛋白的同源性最高。PsbP保守结构域在不同植物中的差别不大(图中红线框),且N端氨基酸序列含有叶绿体/线粒体定位信号(图中蓝线),表明MePPD3蛋白可能定位于叶绿体或线粒体。

      表 2  MePPD3在不同植物中的同源蛋白

      物种名称学名基因号
      木薯 Manihot esculenta Manes.05G127800.1
      橡胶 Hevea brasiliensis XP_021686524.1
      蓖麻 Ricinus communis XP_015573931.1
      胡杨 Populus euphratica XP_011041160.1
      雷公藤 Tripterygium wilfordii XP_038714823.1
      茶树 Camellia sinensis XP_028073751.1
      芒果 Mangifera indica XP_044475605.1
      麻风树 Jatropha curcas XP_012073570.1
      开心果 Pistacia vera XP_031270258.1

      图  3  MePPD3在不同植物中的同源序列比对

      为了进一步验证这些蛋白的亲缘关系,使用MEGA11.0对这9个同源蛋白构建NJ进化树(图4)。结果发现,木薯中的MePPD3蛋白与其他几种植物中的MePPD3蛋白具有较高的亲缘关系,值得一提的是它与橡胶中PPD3蛋白的亲缘关系最接近,可达99%,蓖麻中的PPD3蛋白次之。

      图  4  不同物种间MePPD3同源蛋白的系统进化树分析

      应用MEME在线网站对MePPD3蛋白及其同源蛋白进行保守Motif分析(图5),发现这9个同源蛋白至少含有6个保守Motif,其中,Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4和Motif 6具有高度保守性。此外,MePPD3蛋白和橡胶、蓖麻中PPD3蛋白具有Motif的种类和数量一致,均具有这8个Motif。这与同源蛋白多序列比对和进化树分析的结果一致,初步说明,PPD3蛋白在不同植物体内具有较高的保守性,MePPD3蛋白的功能极有可能与其他PPD3蛋白的功能一致。

      图  5  MePPD3结构域分析

    • 为探究木薯MePPD3蛋白在植物细胞内的亚细胞定位,构建了植物亚细胞定位载体pCAMBIA1300-35S-GFP-MePPD3图6-a)。使用已提前转进GV3101菌株的亚细胞定位载体pCAMBIA1300-35S-GFP-MePPD3和空载pCAMBIA1300-35S-GFP注射生长约30 d的烟草叶片。40 h后,剪取叶片观察荧光信号(图6-b),结果发现,与对照(GFP空载)相比,试验组在叶绿体中能观测到绿色荧光,且能与叶绿体的红色自发荧光基本重合,表现出黄色的光。说明MePPD3蛋白定位在叶绿体中,符合Psbp蛋白(叶绿体光系统II亚基蛋白)的特点。

      图  6  MePPD3蛋白的亚细胞定位

    • 为研究木薯MePPD3基因在木薯不同部位中的表达情况,分别选择同一株‘SC8’木薯的成熟叶片、幼嫩叶片、叶柄、顶芽、块根、须根等部位,对其进行real-time PCR检测MePPD3基因的表达量是否发生变化。观察发现(图7),MePPD3基因在木薯不同组织中均有表达,其在木薯叶片中的表达量最高,在幼嫩叶片中的表达量为顶芽的5倍,在成熟叶片中的表达量为顶芽的18倍;在木薯的叶柄、须根、块根的表达量和顶芽接近。这说明MePPD3基因主要在木薯的叶片中表达,这与其具有的Psbp结构域的功能相符。

      图  7  MePPD3基因在木薯不同部位的表达模式图

    • 为探究病原菌Xpm CHN11侵染后MePPD3基因在木薯叶片中的表达量是否发生变化,分别取接种0、6 h,1 、3 、5 d的木薯叶片,通过实时荧光定量PCR检测MePPD3基因的表达量变化(图8)。从中可以明显地看出,在Xpm CHN11侵染木薯后的不同时间,MePPD3基因的表达量呈先上升再下降趋势。在6 h时,其表达量上升了2.5倍;在1 、3 和5 d时,其表达量逐渐下降为本底表达量。这说明,MePPD3基因可能在木薯抗病过程中发挥着作用。

      图  8  病原菌侵染后不同时间MePPD3基因的表达量

    • 为明确MePPD3基因在木薯抗病过程中的作用,采用VIGS技术沉默MePPD3基因,沉默40 d后,接种正对照植株的叶片出现了白化表型(图9-a)。qRT-PCR结果显示,经过VIGS沉默之后,MePPD3基因的相对表达量显著降低,其表达量下降了2倍(图9-b),说明该基因受到了有效沉默。

      图  9  VIGS沉默植株表型及抗病性检测

      分别在沉默植株和野生型植株上接种Xpm CHN11,结果发现,接种后6 d,沉默植株和野生型植株叶片均已产生水渍状病斑,且沉默植株的水渍状病斑明显小于野生型植株(图9-c),统计后发现沉默植株的病斑面积约为对照植株的一半(图9-d),该结果显示MePPD3负调控了木薯的抗病性。

    • 叶绿体是植物体所特有的细胞器,它能为植物体的各项生命活动提供能量。PsbP蛋白是叶绿体光系统Ⅱ的重要组成部分,它能参与 PSⅡ的组装[13-15]。此外,葡萄球菌萄球菌RXLR效应因子RXLR31154通过影响Psbp来降低H2O2积累,从而促进葡萄致病[21]。PPD蛋白是PsbP蛋白家族的一员,目前已发现的PPD蛋白有7种。蛋白在PSI组装过程中发挥重要作用[18-19];PPD5蛋白和ROS爆发、气孔关闭有关[19]。以上研究充分说明了Psbp蛋白在植物光合作用和免疫反应中发挥着一定的作用。但目前关于PPD3蛋白的研究却不是很多。

      为了增进对PPD3蛋白的了解,本研究首次从木薯数据库中得到MePPD3基因。MePPD3基因CDS序列全长807 bp,编码268个氨基酸序列。对MePPD3基因进行了一系列的生物信息学分析,结果发现:该蛋白第50~100位存在跨膜结构,第106到266位为PsbP保守结构域。其三级结构由6个螺旋组成,符合PsbP蛋白家族的结构特征。选取8种植物中的同源蛋白序列进行多序列比对、进化树和保守结构域分析,结果发现,PPD3蛋白在不同植物中具有较高的保守性,木薯MePPD3蛋白和橡胶中PPD3蛋白具有相同的保守结构域,且两者的相似性可达99%。因此,推测PPD3蛋白在不同植物中起到的作用一致或相近。此外,通过烟草瞬时表达,证实MePPD3定位于叶绿体,这与PPD3蛋白的叶绿体/线粒体定位信号相符,说明MePPD3可能在叶绿体中发挥功能。另外,本研究通过qRT-PCR检测,发现MePPD3基因在木薯成熟叶片中表达量最高;黄单胞菌Xpm CHN11侵染木薯叶片后,MePPD3表达量呈现上调趋势,初步推断,MePPD3可能参与了木薯的抗病途径;VIGS沉默MePPD3基因后接种结果显示,MePPD3负调控木薯的抗病途径。结合前人研究推测,MePPD3可能通过影响气孔开闭和ROS爆发来参与木薯抗病,是否正确仍需要后续研究来证实。

参考文献 (21)

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