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槟榔（Areca catechu L.）属棕榈科多年生常绿乔木，是热带珍贵药用植物，为四大南药之首。海南是我国槟榔的主产区，全省槟榔种植面积约为102 530 hm2，产量约255 114 t，占全国产量的95%以上，主要分布于万宁市（18 138 hm2）、琼海市（16 311 hm2）、琼中县（12 447 hm2）、屯昌县（11 092 hm2）、定安县（8 917 hm2）和保亭县（6 685 hm2）[1]。目前，海南约有230万农民从事槟榔种植，槟榔已经成为海南农民重要的经济来源。海南槟榔产业年产值超过百亿元，已经成为海南省重要的支柱产业[1]，但在槟榔种植规模迅速扩大的同时，槟榔黄化现象对海南省槟榔产业造成了严重的威胁。据初步调查，海南省已有上万亩槟榔树出现了黄化现象，导致植株挂果严重减少，发病严重的植株会逐渐枯死，且槟榔黄化呈现逐年加重的趋势，给槟榔产业造成了巨大损失[2]。关于槟榔黄化的病因，有报道认为导致槟榔黄化的原因主要包括类细菌和类菌原体[3]，后来在海南槟榔黄化病病株的叶脉、叶鞘基部发现植原体[4]，且也有报道认为椰心叶甲、介壳虫、棕榈长翅蜡蝉、飞虱等害虫的危害也会导致黄化的发生；此外，栽培不当也会导致槟榔黄化病的发生，如使用化肥、除草剂和其他用药不当等[5]。目前，治疗槟榔黄化尚无非常有效的防治方法，仍采用挖出病株并烧毁，或使用广谱性的杀菌剂等方法，但效果均不理想。
生物有机肥往往通过功能微生物的大量繁殖，改变了土壤微生物群落结构进而对植物根系形成保护和促生作用[6]，且根系分泌物介导下的植物－微生物互作关系变化对于土壤肥力、健康状况以及植物生长发育有着极其重要的作用[7]。因此，在植物生长发育过程中，根系周围的微生物类群显著影响着植物对土壤中养分、重金属的吸收和转运、作物根际微生物种群的结构等[8]；一些有害微生物也会对作物的生长产生抑制作用，影响其生长发育[9]。蚯蚓粪是蚯蚓的代谢物，在种植业上应用价值较大。蚯蚓粪本身具有速效、长效、抗病、改良土壤和抗板结作用[10]，而且其中的功能微生物还可以不断将土壤中作物难以吸收的养分转化为易吸收的形态[11]，提高养分利用率，从而提高农作物产量、改善产品品质[12]，目前蚯蚓粪已得到了广泛的应用并取得了很好的效果。
由于目前对于槟榔根系微生物组的研究报道较少，且蚯蚓粪缓解槟榔黄化的机制有待进一步解析，本研究拟通过高通量测序技术比较施用蚯蚓粪前后槟榔跟围土微生物多样性的变化，并结合分析其与土壤理化性质的相关性分析，探究蚯蚓粪对槟榔园土壤微生物多样性以及互作网络的影响，旨在找出施加蚯蚓粪组、蚯蚓粪和化肥组与对照组的差别，揭示改善槟榔黄化现象的机制。
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研究选取万宁龙滚槟榔种植园为实验区，在根系设置蚯蚓粪、蚯蚓粪和化肥、无任何添加共3种处理，10个月后进行采样，比较分析施加后3种处理下的土壤细菌和真菌多样性变化、微生物多样性和土壤理化性质的关联分析，并比较了3种处理下的微生物互作网络。蚯蚓粪来自三亚鑫苑农业科技发展有限公司。全氮、全磷和全钾含量≥5%，有益活菌≥0.2亿个·g−1，有机质含量≥20%，pH7.0。
2019年1月中旬进行蚯蚓粪以及化肥的施加，在示范地选取3块长势一致的槟榔种植园，槟榔树龄均为10 a，分别对每棵摈榔树施加蚯蚓粪（10 kg）、施蚯蚓粪和化肥（10 kg）、不作任何处理的区域。在两棵相邻槟榔树中间挖10 cm2×50 cm2左右的方形壕沟，分别进行上述3种处理。施肥10个月后取样，在3块区域中分别划分4块小区域，每块小区域选取3棵槟榔树，取地下10 cm左右、施肥附近的土壤，每份样品约500 g。不同处理的区域各取4份，共12份样品。在土样采集时均佩戴无菌手套，将采集的土壤样品迅速置于冰盒中存放，一部分样品用于土壤理化性质的分析，一部分用于土壤微生物DNA的提取，用于提取DNA的土壤样品带回实验室后立即进行DNA的提取。
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将采集到的土壤自然晾干，按标准法测定样品的基本理化性质[13]。测量指标为：pH值、有机质（Organic Matter，OM)、全氮（Nitrogen，N）、碱解氮（Alkali-hydrolyzable nitrogen，HN）、全磷（Phosphorus，P）、速效磷（Olsen-P，OP）、全钾（Potassium，K）、速效钾（Avail K，AK）。
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将采集到的土壤进行DNA的提取，采用德国QIAGEN公司的DNeasy PowerSoil Kit试剂盒，按说明书提取。通过超微量分光光度计（NanoDrop 1000）检测DNA浓度≥20 ng∙mL−1，OD260/280为1.8～2.0。即为合格。提取的DNA保存于−40 ℃条件下用于后续PCR扩增。
扩增细菌16S rDNA基因的引物采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，并采用IIIumina Miseq 2∙300测序平台对PCR扩增产物进行双端测序。测序部分由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
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测序完成后，对有效序列进行去杂、修剪、去除嵌合体等过滤处理，得到优化序列。基于OTU聚类分析结果，对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。
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由表1可见，与对照（TLG3）相比，施加蚯蚓粪、蚯蚓粪和化肥处理后土壤理化性质表现出明显差异，所测指标都有明显上升，均具有显著性差异（P<0.05）。两个处理组相比，除施加蚯蚓粪组（TLG1）的pH和速效钾高于蚯蚓粪加化肥处理组（TLG2）外，其他的理化因子指标都相反，其中全氮、全磷、全钾、碱解氮和速效钾达到显著性差异。
表 1 不同处理方式下槟榔种植区土壤的理化性质
Table 1. Soil physical and chemical properties in the rhizosphere of arecanut plants in the arecanut plantation
土壤理化性质
Soil physical and chemical properties蚯蚓粪 TLG1 蚯蚓粪加化肥 TLG2 对照 TLG3 pH 5.86±1.01a 5.65±0.78a 4.57±0.18b 有机质/% 2.65±0.44a 2.72±1.51a 1.69±0.53b 全氮/（g·kg−1） 1.21±0.23a 1.97±0.51b 0.79±0.19c 全磷/（g·kg−1） 0.95±0.54a 1.83±0.86b 0.47±0.08c 全钾/（g·kg−1） 1.70±1.05a 2.37±0.26b 1.08±0.18c 碱解氮/（mg·kg−1） 70.60±19.69a 101.96±39.46b 49.25±8.39c 速效磷/（mg·kg−1） 89.51±39.95a 89.70±77.20a 59.10±8.59b 速效钾/（mg·kg−1） 163.95±107.61a 134.74±59.67b 131.58±20.89b 注：同行不同字母表示差异性显著（P<0.05）。
Note: Different lowercase letters in the same line indicates significant differences among treatments at P<0.05. -
97%相似水平上对土壤样品细菌群落进行alpha多样性指数分析，结果（表2）表明，与对照组相比，施加蚯蚓粪组和蚯蚓粪加化肥组槟榔土壤细菌的Shannon指数有明显升高，Simple指数明显降低，表明施加蚯蚓粪和蚯蚓粪加化肥处理后槟榔土壤细菌群落多样性升高，且只施加蚯蚓粪的处理组中的细菌群落多样性高于施加蚯蚓粪和化肥的处理组。
表 2 细菌群落多样性指数
Table 2. Diversity index of bacterial community in the rhizosphere
处理 Treatments OTUs Ace Chao1 Coverage Shannon Simpson TLG1 2 924 5 106.9 5 027.0 0.977 28 6.588 7 0.007 0 TLG2 2 641 5 014.9 5 034.0 0.987 59 5.797 2 0.007 8 TLG3 2 773 5 292.8 5 308.6 0.989 37 5.772 4 0.009 2 -
在属水平上对OTU进行聚类分析，得到不同处理组的槟榔树土壤的细菌群落结构组成，结果（图1）表明，在属水平上只施加蚯蚓粪的处理中，主要的菌属为热酸菌属（Acidothermus，9.45%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.84%）、不动杆菌属（Acidibacter，3.69%）、Occallatibacter（3.04%）；在施加蚯蚓粪加化肥的处理组中，主要的属为热酸菌属（Acidothermus，13.84%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（3.52%）、不动杆菌属（Acidibacter，5.18%）、norank_f_Xanthobacteraceae（4.88%）；在对照组中主要的属为：norank_f_norank_o_Subgroup_2（10.99%）、norank_f_norank_o_Acidobacteriales（9.48%）、独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter，5.19%）。此外还包括norank_f_norank_o_Acidobacteriales、 norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_Xanthobacteraceae、norank_f_norank_o_Elsterales、norank_f_norank_o_norank_c_norank_p_WPS-2、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter等。
图 1 属水平下槟榔土壤细菌群落结构组成
Figure 1. Bacterial community composition at the genus level in the rhizosphere of arecanut plants
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分别对蚯蚓粪组和蚯蚓粪加化肥组与对照组的细菌类群在属的水平上进行了组间差异分析。结果（图2）表明，在只施加蚯蚓粪与对照的比较中（图2-a），norank_f_norank_o_Acidobacteriales、独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）、norank_f_norank_o_norank_c_AD3和Conexibacter达到了极显著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2达到了显著性水平。在施加蚯蚓粪−化肥的处理组与对照的比较中（图2-b），热酸菌属（Acidothermus）、独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）和Conexibacter达到了极显著水平，norank_f_norank_o_Subgroup_2、norank_f_norank_o_Acidobacteriales和norank_f_norank_o_norank_c_AD3达到了显著性水平。
图 2 不同处理下细菌菌属与对照组差异分析
Figure 2. Analysis of difference in bacteria at the genus level between the treatments and the control
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结合理化性质，在细菌门水平上对施加蚯蚓粪前后的土壤和对照组进行了Redundancy Analysis（RDA）分析（图3）。RDA分析显示，第一主轴能够解释所有信息的72.21%，第二主轴能够解释11.30%，两者累计解释所有信息的83.51%。pH和速效钾对物种影响程度最大，各环境因子之间均呈正相关。只施加蚯蚓粪组中，TLG1-1、TLG1-3、TLG1-4微生物群落变化与所有环境因子之间呈正相关，TLG1-2与全钾、速效磷呈负相关，与其余环境因子呈正相关。蚯蚓粪加化肥组中，TLG2-1、TLG2-3、TLG2-4与所有环境因子呈正相关，TLG2-2与所有环境因子呈负相关。对照组中所有样本微生物群落变化与所有环境因子呈负相关。变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门（Actinobacteria）与所有环境因子呈正相关，WPS-2、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）与所有环境因子呈负相关。其微生物群落程度表现为：酸杆菌门（Acidobacteria）>绿弯菌门（Chloroflexi）>WPS-2。
图 3 不同处理下微生物群落与土壤指标RDA排序图
Figure 3. RDA ordination diagram for microbial community and soil index of each treatment
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为了分析物种与物种之间的相关性，在门的水平上对样本丰度前50的种进行单因素网络分析（图4）。对照组中分类水平总丰度前50的物种中（图4-c），主要的门为Acidobacteriota（17）、Firmicutes（3）、Planctomycetota（1）、Chloroflexi（9）、WPS-2（1）、GAL15（3）、Myxococcota（1）、Proteobacteria（10）、Actinobacteriota（6）、FCPU426（1）和Bacteroidota（1）；在只施加蚯蚓粪的处理组中（图4-a），主要的门为Cyanobacteria（1）、Actinobacteriota（14）、Proteobacteria（19）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）、Acidobacteriota（11）和Chloroflexi（2）；在施加蚯蚓粪和化肥的处理组中（图4-b），主要的门为Proteobacteria（20）、Actinobacteriota（11）、Acidobacteriota（11）、WPS-2（2）、Patescibacteria（1）和Chloroflexi（5）。可以看出前50丰度的物种在门水平上处理组相对于对照组少了Firmicutes、Planctomycetota、GAL15、Myxococcota、FCPU426和Bacteroidota所包含的菌种。只施加蚯蚓粪的处理组中多出了Cyanobacteria门的一种菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），丰度前50的物种有8种与其有相关性，其中大多数为负相关。施加蚯蚓粪−化肥的处理组中多出了Patescibacteria门的一种菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8），丰度前50的物种有8种与其有相关性，其中大多数为正相关。
图 4 不同处理下单因素网络分析
Figure 4. Monofactor network analysis of different treatments
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施加蚯蚓粪可以提高土壤pH，有效抑制土壤的酸化；且槟榔种植区的土壤有机质、全氮、全磷、全钾、碱解氮、速效磷和速效钾的含量均有明显增加。土壤有机质是土壤养分的重要组成部分[14]，能够改善土壤的物理和理化性质[15]，同时也是各种植物生长的营养来源[16]。施加蚯蚓粪后土壤中有机质含量有明显升高，表明其土壤得到了改善。
97%相似水平上对土壤样品细菌群落进行alpha多样性指数分析，结果表明，施加蚯蚓粪后其微生物多样性升高，这与周东兴等[17]的研究结果一致，周东兴等人通过研究施加蚯蚓粪对温室黑土酶活性以及细菌多样性的影响，证明蚯蚓粪的施加提高了土壤的细菌多样性。施加蚯蚓粪及蚯蚓粪-尿素的处理均对土壤微生物的多样性造成了显著的影响，如独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）和Conexibacter出现了显著性差异，其中独活假丝酵母属（Candidatus Solibacter）已有报道表明其为分解有机质、利用碳源的菌属，与土壤有机质含量呈正相关关系[18]。通过土壤理化性质和微生物在细菌门水平上分布的RDA分析，结果表明，理化因子之间速效钾的含量达到显著性差异，同时N、P、K的含量都有所增高。这与王英男等[19]研究蚯蚓粪可以提高土壤营养物质N、P、K含量是一致的。
通过单因素网络分析施加蚯蚓粪和施加蚯蚓粪和化肥后的土壤。只施加蚯蚓粪的处理组中多出了Cyanobacteria门的一种菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），施加蚯蚓粪-化肥的处理组中多出了Patescibacteria门的一种菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8）。这两种未命名的菌种对槟榔黄化也许有一定影响。
蚯蚓粪在促进作物生长、提高产量、改善土壤肥力和抑制植物病害等方面均有重要作用[20]。钱春桃等[21]将蚯蚓粪肥均匀撒施在松花菜地里，发现可以有效降低连作地土壤水溶性盐总量（EC），缓解土壤酸化，提高土壤速效碳氮钾的含量；张峰等人[22]发现蚯蚓粪肥极显著提高土壤NaOH-Po含量和酸性磷酸酶活性，有效促进NaOH-Po活化的同时提高微生物对磷的贮存能力，提高磷肥利用率。因此，研究表明蚯蚓粪对改善土壤肥力以及保证作物健康生长具有重要的作用。本研究通过高通量测序技术对外源施加蚯蚓粪对槟榔种植区的土壤微生物多样性进行了比较分析，结果表明，施加蚯蚓粪可显著提升土壤养分，改善土壤状况，增强微生物之间的多样性。此结果为深入解析蚯蚓粪对槟榔黄化的缓解机制奠定基础。
Effects of Earthworm Castings on the Microbial Diversity in the Rhizosphere of Arecanut Plants
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摘要: 槟榔是海南省重要的支柱产业，而槟榔黄化严重导致了槟榔产量和品质下降，严重影响了海南省槟榔产业的发展。研究发现在槟榔根系施加蚯蚓粪对槟榔黄化具有较好的改善作用，但蚯蚓粪改善槟榔黄化的机制尚未清楚。因此，本研究选取海南万宁龙滚槟榔种植园为实验区，在根系设置3种处理，即蚯蚓粪组(TLG1)、蚯蚓粪和化肥（尿素）组(TLG2)、无任何添加的对照组(TLG3)，10个月后进行采样，利用Illumina Miseq高通量测序动态比较分析不同处理组土壤细菌多样性变化及微生物互作网络、揭示微生物多样性和土壤理化性质的相关性。结果表明，施加蚯蚓粪、蚯蚓粪和化肥的处理显著增强了槟榔根围土的微生物多样性，尤其是Acidothermus、Occallatibacter、Conexibacter在施加蚯蚓粪后显著增加（P<0.05）；而Candidatus Solibacter则明显降低（P<0.01），微生物互作网络分析结果表明，只施加蚯蚓粪的处理组中，所占丰度在前50的物种多出了Cyanobacteria门的一种菌（s_unclassified_g_norank_f_norank_o_Chloroplast），施加蚯蚓粪-化肥的处理组中多出了Patescibacteria门的一种菌（s_uncultured_bacterium_g_norank_f_LWQ8）。外源添加蚯蚓粪可显著增强土壤微生物的多样性和丰度，且显著增加了根系微生物互作网络的稳定性。此外，速效钾等理化因子对微生物类群拥有显著的影响，本研究结果对于进一步解析蚯蚓粪缓解槟榔黄化机制奠定了基础。Abstract: Areca nut is an important pillar industry in Hainan Province, and arecanut yellow leaf disease occurring seriously in Hainan has led to the decline of areca nut yield and quality, and seriously affects the development of areca nut industry in Hainan Province. It was found that earthworm castings as vermicompost could reduce yellowing of arecanut leaves when applied to the rhisosphere, but its mechanism in reducing leaf yellowing resulting from arecanut leaf yellow disease was not clear. Therefore, an experiment was made at a Longgun arecanut plantation in Wanning County, Hainan Province by using earthworm castings as manure to observe the microbial diversity in the rhizosphere of arecanut plants in the arecanut plantation. Three treatments were arranged: earthworm castings (TLG1), earthworm castings + chemical fertilizer (urea) (TLG2) and the blank control (TLG3). After 10 months of treatment, samples were collected from the rhizosphere in the arecanut plantation to analyze the dynamic changes of soil bacterial diversity and microbial interaction network in different treatments by using Illumina Miseq high-throughput sequencing to reveal the correlation between microbial diversity and soil physical and chemical properties. The results showed that the treatments with the earthworm castings and the earthworm manure + urea increased significantly the microbial diversity in the rhizosphere of the aracanut plants, as compared with the control. The treatments of the earthworm castings and the earthworm castings + urea increased significantly Acidothermus, Occalatibacter and Conexibater at the genus level in the rhizosphere (P < 0.05), and reduced significantly Candidatus Solibacter (P < 0.05). The microbial interaction network analysis showed that a special bacteria (s_unclassified_G_norank_F_norank_O_Chloroplast), belonging to the phylum Cyanobacteria, and a species of bacteria (S_uncultured_ bacterium_ G_ norank_ F_ LWQ8), belonging to the phylum Patescibacteria, were found in the top 50 abundant species in the treatments with the earthworm castings and the earthworm castings + urea, respectively. This experiment showed that exogenous earthworm castings could significantly enhance the diversity and abundance of soil microorganisms in the rhizosphere of arecanut plants in the arecanut plantation, and significantly increase the stability of microbial interaction network in the rhizosphere. Moreover, the available potassium and other physical and chemical factors had a significant impact on microbial groups. The results of this experiment might provide some reference for further understanding of the mechanism of the earthworm castings in reducing leaf yellowing resulting from the yellow leaf disease.
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图 2 不同处理下细菌菌属与对照组差异分析
a. 施加蚯蚓粪后；b. 施加蚯蚓粪和化肥后。*表示具有显著性差异；**和***表示具有极显著性差异。
Fig. 2 Analysis of difference in bacteria at the genus level between the treatments and the control
a. Bacterial difference between TLG1 and TLG3 at the genus level; b. Bacterial difference between TLG2 and TLG3 at the genus level. * indicates that there are significant differences between the two treatments；** and *** indicate that there are extremely significant differences in the figure.
图 3 不同处理下微生物群落与土壤指标RDA排序图
Fig. 3 RDA ordination diagram for microbial community and soil index of each treatment
图 4 不同处理下单因素网络分析
a. 施加蚯蚓粪组；b. 施加蚯蚓粪加化肥组；c. 对照组。图中节点的大小表示物种丰度大小，不同颜色表示不同的物种；连线的颜色表示正负相关性，红色表示正相关，绿色表示负相关；线的粗细表示相关性系数的大小，线越粗，表示物种之间的相关性越高；线越多，表示该物种与其他物种之间的联系越密切。
Fig. 4 Monofactor network analysis of different treatments
a. Monofactor network analysis of TLG1; b. Monofactor network analysis of TLG2; c. Monofactor network analysis of TLG3. The size of nodes in the graph indicates the species richness, and different colors indicate different species; the color of lines indicates positive and negative correlation, red indicates positive correlation, and green indicates negative correlation; the thickness of lines indicates the size of correlation coefficient; the thicker the line, the higher the correlation between the species; the more the lines, the closer the relationship between a species and other species.
表 1 不同处理方式下槟榔种植区土壤的理化性质
Table 1 Soil physical and chemical properties in the rhizosphere of arecanut plants in the arecanut plantation
土壤理化性质
Soil physical and chemical properties蚯蚓粪 TLG1 蚯蚓粪加化肥 TLG2 对照 TLG3 pH 5.86±1.01a 5.65±0.78a 4.57±0.18b 有机质/% 2.65±0.44a 2.72±1.51a 1.69±0.53b 全氮/（g·kg−1） 1.21±0.23a 1.97±0.51b 0.79±0.19c 全磷/（g·kg−1） 0.95±0.54a 1.83±0.86b 0.47±0.08c 全钾/（g·kg−1） 1.70±1.05a 2.37±0.26b 1.08±0.18c 碱解氮/（mg·kg−1） 70.60±19.69a 101.96±39.46b 49.25±8.39c 速效磷/（mg·kg−1） 89.51±39.95a 89.70±77.20a 59.10±8.59b 速效钾/（mg·kg−1） 163.95±107.61a 134.74±59.67b 131.58±20.89b 注：同行不同字母表示差异性显著（P<0.05）。
Note: Different lowercase letters in the same line indicates significant differences among treatments at P<0.05.
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表 2 细菌群落多样性指数
Table 2 Diversity index of bacterial community in the rhizosphere
处理 Treatments OTUs Ace Chao1 Coverage Shannon Simpson TLG1 2 924 5 106.9 5 027.0 0.977 28 6.588 7 0.007 0 TLG2 2 641 5 014.9 5 034.0 0.987 59 5.797 2 0.007 8 TLG3 2 773 5 292.8 5 308.6 0.989 37 5.772 4 0.009 2
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