试验地位于海南大学儋州校区农科实验基地（19°51′N，109°49′E），属于典型热带季风气候区，年均气温23.5 ℃，年降水量2 000 mm，光照充足，土壤为红壤土，地势平坦且通风排水良好。

砧木选取海南大学儋州校区农科基地木棉试验田5年生健康美丽异木棉（Ceiba speciosa）（胸径12.0±1.6 cm）。接穗选取当年生、长约8～12 cm、叶芽饱满的健壮半木质化木棉枝条。以木棉为接穗，以美丽异木棉为砧木，进行劈接，共240株。具体操作方式为：首先用嫁接刀在接穗的底端两边各削一刀，形成长度为 1.5～2.0 cm的2个削面，削面平滑，接穗保留顶芽。用枝剪在砧木上合适位置剪断，使用嫁接刀将砧木切口修整平滑，从砧木剪断面中央垂直劈开，劈口长度约为3～4 cm。将准备好的接穗插入，确保砧木与接穗的形成层对接，然后用塑料保鲜膜包扎固定，完成嫁接。

每个嫁接组合嫁接处理后按1、3、5、7、10、14、17、21、25、30、35、40 d共采样12次，采用完全随机法，每次取15株嫁接成活苗的结合部茎段（生物学重复），其中剪取3株约1.5 cm长的结合部茎段，立即浸入70%FAA固定液，存放于4 ℃冷藏环境备用，取样完成后统一进行切片。剩余12株将嫁接口茎段经液氮冷冻后，放入−80 ℃冰箱保存，取样完成后统一进行生理生化分析，分为3次技术重复进行指标测定。

硬组织树脂包埋切磨片实验步骤，样品从固定液中取出，新鲜组织确定取材部位，将植物组织用70%FAA固定48 h，依次通过60% → 70% → 80% → 90% → 95%酒精脱水，每梯度处理24～72 h，再用T7200树脂浸润20 d。之后将组织放入包埋模具，调整包埋面，加入T7200树脂，光固化12 h，接着进行平行切片。平行粘片后，进行切片磨片，最后将切磨片进行甲苯胺蓝染色，透明封片。染色结果显示，木质化细胞壁呈蓝绿色，纤维素细胞壁呈紫蓝色。将切片置于日本产的Nikon Eclipse E100正置光学显微镜下观察并拍照。

采用蒽酮比色法^[10]对可溶性糖含量进行测定，采用考马斯亮蓝^[11]测定可溶性蛋白含量，过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性均通过分光光度法测定。试验所需的试剂盒全部由苏州科铭生物技术有限公司提供。生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）及脱落酸（ABA）的含量均通过酶联免疫吸附法测定。

数据处理及绘图使用Excel 2023和Origin 2022，照片处理使用Photoshop 2023，数据统计分析采用SPSS 27.0进行单因素方差分析，误差线表示均值±标准差（n=3）。

观察发现，隔离层和愈伤组织分别在嫁接后第1天（图1−A）和第3天（图1−B）开始形成；到第10天（图1−E），愈伤组织填充了砧木和接穗之间的空隙，二者紧密结合，形成愈伤组织桥，隔离层消失。嫁接后第22天（图1−H）时，连成完整的形成层带。砧穗结合部的形成层环表明嫁接体已愈合。到嫁接后第40天（图1−L），新形成的维管束进一步分化，分布从规整变为不规整，形成维管束混合群体，标志着嫁接体成活。木棉嫁接愈合过程可分为4个阶段，分别是隔离层形成期（第0～3天）；愈伤组织形成期（第3～10天）；愈伤组织分化和连接期（第10～22天）；形成层连接和维管组织分化期（第22～40天）。

图  1  木棉嫁接愈合全过程横切示意图

Figure 1.  Cross-sectional schematic diagram of the entire graft healing process in Bombax ceiba

隔离层由坏死的细胞组织构成，主要起到保护伤口的作用。在嫁接后的第1天（图2−A）和第3天（图2−B），在砧木与接穗切口处的形成层位置，观察到褐色坏死组织（隔离层）形成，它在嫁接初期有助于减少水分蒸发，保护伤口。

图  2  隔离层形成期横切图

Figure 2.  Transverse section at the formation stage of the isolation layer

在嫁接后的第5天（图3−A），砧木伤口附近出现不规则的薄壁细胞，即愈伤组织形成。在嫁接后的第7天（图3−B），愈伤组织大量增殖，形成无序排列的愈伤组织细胞团。在嫁接后的第10天（图3−C），砧木与接穗的愈伤组织继续增生，径向薄壁细胞层数增加，并出现细胞融合现象。

图  3  愈伤组织形成期横切图

Figure 3.  Transverse section at the callus formation stage

在嫁接后的第14天（图4−A），愈伤组织抱合连接，填满了砧木与接穗之间的空隙，形成愈伤组织桥，隔离层消失，愈伤组织桥成为细胞流通的关键途径，在维管束形成前的嫁接初期，愈伤组织桥是砧木向接穗提供水分和营养的主要通道。嫁接后第22天（图4−C），薄壁细胞持续分化形成新的形成层，并向接穗生长，最终形成完整的形成层带，带状结构扭曲。砧穗结合部形成层环表明嫁接体已愈合。

图  4  愈伤组织分化和连接横切图

Figure 4.  Transverse section showing callus differentiation and vascular connection

在嫁接后的第26天（图5−A）：完整的形成层带开始活跃分化，向内生成木质部，同时新生导管开始形成。嫁接后第30天（图5−B），形成大量规则的木质部和韧皮部结构，导管清晰可见。嫁接后的第35天（图5−C），新分化出的维管束扩大分化，分布从规整变为不规整，形成维管束混合群体。嫁接后的第40天（图5−D），砧穗已完整地连为一体，嫁接愈合过程基本结束。

图  5  形成层连接和维管组织分化横切图

Figure 5.  Transverse section of cambium layer connection and vascular tissue differentiation

从图6−A可知，在1～5 d可溶性蛋白含量持续下降，在第5天下降至最低点（5.55 g·kg⁻¹），随即在第5～22天可溶性蛋白含量逐步上升，在第22天显著上升至最高点（10.53 g·kg⁻¹），最高点是最低点的1.90倍。在第22天出现峰值后，可溶性蛋白含量22～40 d逐步下降，在第40天趋于稳定（7.60 g·kg⁻¹）。可溶性蛋白含量在嫁接愈合过程中呈现出先下降后上升再下降的变化趋势。从图6−B可知，在1～10 d可溶性糖含量持续下降，在第10天显著下降至最低点（2.13 g·kg⁻¹），随即在第10～40天逐步上升至峰值，在第35天显著上升至最高点（14.66 g·kg⁻¹），最高点是最低点的6.88倍，且在形成层连接和维管组织分化阶段（22～40 d）可溶性糖含量与可溶性蛋白含量呈相反变化趋势，可溶性糖在整个嫁接愈合过程中呈现处先下降后上升的变化趋势。

图  6  嫁接结合部愈合过程中营养物质含量动态变化

Figure 6.  Dynamic changes in nutrient content during the graft union healing process

从图7−A可知，过氧化物酶（POD）活性第1天为最低点（24.74 U·g⁻¹），在1～5 d过氧化物酶活性持续上升，在第5天上升至第1个峰值（80.48 U·g⁻¹），随即在第5～10天过氧化物酶活性略微下降，过氧化物酶活性在第10～22天显著上升至最高点（169.87 U·g⁻¹），最高点是最低点的6.87倍，在第22天出现峰值后，过氧化物酶活性在第22～40天显著下降后平稳波动。过氧化物酶活性在整个嫁接愈合过程中呈现先上升后下降，再上升再下降的变化趋势。从图7−B可知，在嫁接后1～18天超氧化物歧化酶（SOD）活性持续上升，在第18天上升至最高点（223.64 U·g⁻¹），随即在第18～40天超氧化物歧化酶活性逐步下降，在第40天显著下降至最低点（63.16 U·g⁻¹），最高点是最低点的3.54倍。超氧化物歧化酶活性在整个嫁接愈合过程中呈现出先上升后下降明显变化趋势。从图7−C可知，在1～10 d过氧化氢酶（CAT）活性持续上升，在第10天上升至最高点（9.55 μmol·min⁻¹·g⁻¹），随即在第10～40天过氧化氢酶活性波动性下降，在第40天显著下降至最低点（3.11 μmol·min⁻¹·g⁻¹），最高点是最低点的3.07倍。过氧化氢酶活性在整个嫁接愈合过程中呈现出先上升后下降的明显变化趋势。

图  7  嫁接结合部愈合过程中酶活性动态变化

Figure 7.  Dynamic changes in enzyme activity during the graft union healing process

从图8−A可知，在嫁接后1～22 d激素IAA浓度波动上升，在第22天上升至最高点（328.2 mg·L⁻¹），随即在第22～30天激素IAA浓度逐步下降，在第30～40天激素IAA浓度波动起伏逐渐平稳。第1天为最低点（128.7 mg·L⁻¹），最高点是最低点的2.55倍。激素IAA浓度在整个嫁接愈合过程中总体呈现出先上升后下降的变化趋势。如图8−B所示，在1～18 d激素CTK浓度持续上升，在第18天上升至最高点（45.89 μg·L⁻¹），随即在第18～22 d激素CTK浓度急剧下降，在第22～40 d激素CTK浓度波动起伏逐渐平稳，第3 d为最低点（19.79 μg·L⁻¹）最高点是最低点的2.32倍。激素CTK浓度在整个嫁接愈合过程中总体呈现出先上升后下降的变化趋势。从图8−C可知，在1～22 d激素ABA浓度持续下降，在第22天下降至最低点（39.41 μg·L⁻¹），随即在第22～40天激素ABA浓度波动性上升，第3天为最高点（75.08 μg·L⁻¹），最高点是最低点的1.91倍。激素ABA浓度在整个嫁接愈合过程中呈现出先下降后上升的明显变化趋势。如图8−D所示，在1～30 d激素GA浓度波动性上升，在第30天上升至最高点（102.7 nmol·L⁻¹），随即在第30～40 d激素GA浓度急剧下降，第1天为最低点（55.87 nmol·L-1），最高点是最低点的1.84倍。激素GA浓度在整个嫁接愈合过程中呈现出先上升后下降的变化趋势。

图  8  嫁接结合部愈合过程中内源激素含量动态变化

Figure 8.  Dynamic changes in endogenous hormone levels during the graft union healing process

对嫁接愈合整个过程中各生理生化指标数值进行相关性分析，从表1可知，除CAT与可溶性蛋白、POD以及SOD与可溶性糖无显著相关性之外，其余各指标之间均呈显著相关（P<0.05）趋势，特别是可溶性糖与可溶性蛋白、SOD与可溶性蛋白、SOD与POD以及SOD与CAT之前均存在极为显著的正相关（P<0.01）关系，CAT与可溶性糖呈现极为显著负相关（P<0.01）趋势。通过相关性分析，嫁接愈合过程中多种生理生化指标之间呈现出显著的相关性，特别是一些抗氧化酶与可溶性糖、可溶性蛋白之间的关系。SOD、CAT和POD作为抗氧化酶，可能通过减轻氧化应激，促进愈合过程中的细胞修复和代谢。与此同时，可溶性糖与可溶性蛋白的显著正相关也提示它们在植物愈合过程中可能相互支持，维持愈合所需的能量和物质合成。

对嫁接愈合整个过程中IAA、CTK、GA、ABA的含量进行相关性分析，由表2可知，除CTK与GA无显著相关性之外，其余各指标之间均呈显著相关（P<0.05）趋势，其中IAA与CTK、IAA与GA呈现极为显著正相关（P<0.01）趋势，ABA与CTK、GA、IAA呈现极为显著负相关（P<0.01）趋势。IAA与CTK、GA之间呈现显著的正相关关系，表明它们在嫁接愈合过程中通过协同作用共同促进愈伤组织的生成和植物的生长。ABA与IAA、CTK、GA之间存在显著的负相关，作为植物应激反应的关键激素，ABA通过抑制细胞过度分裂与生长，协助植物应对逆境。它通过与IAA、CTK、GA的负相关作用，调控植物的生长，以减少不必要的能量消耗，从而增强植物在不良环境条件下的生存能力。

嫁接愈合是一个复杂的生物学过程，通常包括多个阶段，尽管不同研究者对愈合阶段的划分有所不同，但愈合过程一般包括隔离层形成、愈伤组织形成、愈伤组织分化、形成层分化及维管组织形成等关键阶段，最终促使砧木与接穗在细胞和组织层面实现连接，从而结合成一个新个体。美国山核桃（Carya illinoinensis）嫁接愈合过程分为4个阶段^[12]，梨树嫁接愈合过程可分为愈伤组织形成期和维管形成层形成及活动期两个阶段^[13]；圆齿野鸦椿（Euscaphis konishii）嫁接愈合过程可分为3个阶段^[14]，将山苍子（Litsea cubeba）嫁接愈合过程可分为4个阶段^[15]。尽管嫁接体愈合过程展示相似的解剖特征，但嫁接成活时间受植物种类、年龄、嫁接方法和部位等多种因素的影响，各类植物的愈合时间表现出明显差异。例如，美国山核桃在嫁接后第30天即可实现砧穗的结合^[12]，油茶（Camellia oleifera）在第35天形成维管束桥^[6]，而黄瓜（Cucumis sativus）则在第12天愈合部位形成新维管束 ^[16]，马铃薯与枸杞嫁接后第17天愈合完成^[17]。这些时间差异反映了植物种类、年龄、嫁接方式和部位等因素对植物愈合能力和速度的显著影响。本试验中，木棉的嫁接愈合在第四十天完成愈合，根据嫁接口在愈合过程中的动态变化，本研究结果表明，木棉嫁接愈合过程可分为四个阶段，分别是隔离层形成期（第0 d～3 d）；愈伤组织形成期（第3 d～10 d）；愈伤组织分化和连接期（第10～22天）；形成层连接和维管组织分化期（第22～40天），前22天是决定嫁接成活的关键期，而前40天，则对嫁接苗的存活至关重要。

在木棉嫁接愈合过程中，可溶性糖和可溶性蛋白的含量动态变化在不同愈合阶段发挥着至关重要的作用。可溶性糖主要提供了嫁接过程中的能量支持，并帮助调节嫁接部位的渗透压，确保水分和养分的有效运输^{[18 − 20]}。本研究结果表明，可溶性糖在嫁接愈合中整体趋势为先下降后升高，可溶性糖在愈伤组织形成阶段含量最低，是由于隔离层阻隔了砧穗间养分运输通道导致可溶性糖下降，而愈伤组织的形成也需要大量消耗可溶性糖来提供能量。这与潘淑民等^[21]的研究结果基本一致。可溶性蛋白通过调节植物激素的合成和信号传递，促进细胞分裂、扩展和愈伤组织的形成，通过参与细胞壁的重构和愈伤组织的合成，调节嫁接部位的组织修复，加速嫁接愈合过程并提高嫁接成功率，在嫁接愈合过程中起到关键作用^{[22 − 23]}。本研究结果表明，可溶性蛋白质在嫁接愈合中整体趋势为先下降后升高先下降后上升再下降，蛋白质含量在形成层连接和维管组织分化阶段达到高峰，是由于在维管组织形成阶段，细胞壁重构和维管组织的分化需要大量可溶性蛋白的支持，因此蛋白质含量达到高峰，这与王习政等^[15]的研究结果基本一致。

植物细胞抗氧化系统清除酶主要包括过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（POD），可作为嫁接亲和性的判定指标^{[24 − 25]}。在木棉嫁接愈合过程中，POD、SOD和CAT通过协同作用，有效地清除活性氧，减轻氧化损伤，促进伤口愈合。POD主要通过有效保护膜结构，促进木质素合成，增强伤口结构稳定性，SOD通过转化超氧化物为过氧化氢，清除氧化损伤，维持细胞内的氧化还原平衡，CAT则通过分解过氧化氢，保护细胞免受氧化毒害，促进伤口愈合^[26][27][28]。本研究结果表明，POD、SOD和CAT三类抗氧化酶活性在嫁接初期上升，是由于嫁接口受机械损伤后激活了抗氧化系统，增强了自由基清除能力，有效防止了氧化损伤，随着细胞的快速增殖和分化产生大量活性氧（ROS），三类抗氧化酶在愈伤组织分化和连接阶段均达到最高峰，随后随着形成层和维管组织的稳定，三类抗氧化酶活性下降后平稳波动。杨冬冬等^[28]的研究结果表明，西瓜嫁接体中POD活性的增加与木质素合成相关，本试验中POD活性的上升趋势可能与细胞木质化反应的增加有关，表明POD活性的提升有助于接合部的愈合。苏媛等^[29] 的研究结果也表明，嫁接后愈合过程中，POD活性先上升后下降，这与本试验的结果基本一致。胡艳青等^[16]的研究结果表明，嫁接初期，SOD活性升高，有利于转化超氧化物阴离子（O²⁻）为过氧化氢（H₂O₂）来减轻氧化损伤；嫁接体成活后，SOD活性随之下降，SOD呈现先上升后下降的趋势，嫁接初期，CAT活性增强，有助于清除氧自由基、减轻氧化损伤并去除多余的H₂O₂；嫁接稳定后，CAT活性下降。上述研究均与本实验结果一致，本研究结果表明，POD、SOD、CAT活性的增强对嫁接体愈伤组织的形成具有促进作用，在嫁接体逐渐稳定后，三类酶活性随之下降，通过三类酶的活性变化初步判定在木棉嫁接愈合过程中愈伤组织分化和连接期是关键阶段。

植物内源激素是嫁接体发育的关键因子之一^[30][31]，在本研究中，探讨了生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）等植物激素在木棉嫁接愈合过程中的动态变化。在本实验中，3种激素均呈现先上升后下降的趋势，在相关性分析中呈现显著正相关，在嫁接愈合过程，IAA、GA和CTK协同作用，刺激细胞分裂分化，促进维管束形成及木质部与韧皮部的连接，Zhang等^[32]也得出了类似的结果。本研究结果表明，IAA和CTK在愈伤组织分化和连接阶段浓度达到最高峰，支持愈伤组织的增生与初步连接，并协同调节愈伤组织向功能性维管组织的转化，确保接穗与砧木间形成高效的运输通道，GA在形成层连接和维管组织分化阶段浓度达到最高峰，以促进细胞的伸长，推动导管和筛管的形成，帮助形成新的维管组织，与Melnyk 等^[33]的研究结果一致。ABA与上述3种激素均呈现显著负相关，在本实验中呈现先下降后上升的趋势，ABA作为一种抗逆境的激素，在嫁接过程中主要通过提高植物的抗逆性、减缓胁迫下的不必要的生长以及平衡植物激素来促进愈合过程。本研究结果表明，ABA在隔离层阶段浓度最高，ABA通过抑制伤口区域细胞的过度分裂，促进伤口的愈合环境稳定，避免了伤口部位的过度反应，在细胞增殖分化阶段浓度降低，这与Momoko等^[34] 的研究结果一致。

本研究发现，可溶性糖与可溶性蛋白之间呈现极为显著的正相关（P<0.01）。在嫁接愈合过程中，植物可能通过增加可溶性糖的含量来促进可溶性蛋白的合成。这是因为可溶性糖不仅为植物提供能量，而且参与了许多代谢过程，包括蛋白质合成。可溶性糖作为能量来源，为蛋白质合成提供必要的能量支持。特别是在愈伤组织的形成和愈合过程中，细胞分裂和蛋白质的合成是关键活动，糖类提供能量，维持细胞的代谢活动，进而促进愈伤组织的生长与修复。也有研究表明，插穗在逆境响应中通过激活蛋白酶系统加速大分子物质水解代谢，促使可溶性蛋白含量显著提升；并使淀粉酶介导的碳源分解代谢与叶片光合产物共同驱动可溶性糖的积累，二者呈协同作用^[35]。本研究结果表明，SOD与POD之间呈现极为显著正相关（P<0.01）。这2种抗氧化酶在植物的氧化应激反应中共同作用，SOD通过减少超氧阴离子自由基的积累，降低细胞氧化损伤，而POD则进一步分解过氧化氢，减少由过氧化氢引起的细胞损伤。在愈合过程中，SOD和POD协同作用，共同清除植物体内的过氧化物和自由基。SOD与CAT之间呈现极为显著正相关（P<0.01）。SOD主要负责清除超氧阴离子自由基，而CAT则进一步清除过氧化氢，防止其积累并对细胞造成损害。SOD和CAT共同工作，减少氧化损伤，促进细胞的修复和代谢。朱丽丽等^[36]的研究结果也表明，柑橘在胁迫条件下 主要通过POD、SOD和CAT三者协同作用，使自由基维持在一个低水平，从而防止自由基伤害。本研究结果表明，IAA与CTK之间呈现出极为显著的正相关（P<0.01）。生长素（IAA）与细胞分裂素（CTK）协同作用，共同调控植物的生长。在愈伤组织形成及植物发育过程中，两者通过互相调节共同促进细胞的分裂与扩展，进而加速愈伤组织的形成，推动植物组织的生长与愈合过程。IAA与GA之间也呈现出极为显著的正相关（P<0.01）。生长素（IAA）和赤霉素（GA）之间存在协同作用，尤其在植物生长和发育过程中，二者共同促进细胞的分裂和伸长。GA主要负责调节细胞的伸长与愈伤组织的扩展，而IAA则主要调节细胞分裂，二者的协同作用有效促进了植物的正常生长及愈合过程。上述结果与Schaller等^[37]的研究结果一致：CTK，GA的作用通常通过与IAA信号通路相互作用而发生，激素互作调控细胞。本研究结果表明，ABA与IAA之间呈现极为显著的负相关（P<0.01）。生长素（IAA）通常促进植物的生长和细胞的伸长，而ABA则在植物面对不良环境（如干旱、盐分等）时发挥抑制作用，减少过度的细胞扩展。ABA通过减少IAA的作用，帮助植物应对逆境，抑制不必要的生长。张佳兴等^[38]的研究结果也表明，IAA的降低和ABA的升高体现了拮抗作用，显著影响着无患子（Sapindus mukorossi）的嫁接愈合的过程。

本试验通过对木棉嫁接结合部进行解剖学显微观察，木棉嫁接愈合过程可分为隔离层形成期（第0～3天）；愈伤组织形成期（第3～10天）；愈伤组织分化和连接期（第10～22天）；形成层连接和维管组织分化阶段（第22～40天）这4个阶段，前22 d是决定嫁接成活的关键期，而前40 d则对嫁接苗的存活至关重要。在生理生化分析中，多数生理生化指标在愈伤组织的分化和连接期会达到最高峰，这进一步证实了该时期是嫁接愈合过程中的关键环节，本研究未直接测定活性氧（ROS）含量，但嫁接早期抗氧化酶活性动态提示氧化应激的存在。未来将整合ROS原位检测与转录组分析，精准解析木棉嫁接中氧化还原调控网络,从多方面深入探讨木棉嫁接愈合的形成机制，推动木棉优良无性系的繁育与应用。