2023年3月至2024年3月期间，从海口地区9家动物医院招募受试伴侣犬，所有受试犬的血液样本与临床信息采集均征得犬主知情同意。采样过程的所有操作符合海南大学动物伦理操作规范。调查前根据研究需求设计问卷，在血液样本采集当天由采样人员询问主人回答问卷中的问题。调查问卷包括受试犬的基本信息、户外活动情况、驱虫史、其他信息以及相关临床病史5个部分构成，详细问询内容见表1。

SNAP 4Dx Plus 床旁检测试剂盒（美国IDEXX有限公司）。

台式高速冷冻离心机（德国 Eppendorf）；立式压力蒸汽灭菌锅（鸡西市辰丰医疗器械制造有限公司）；超低温冰箱（海尔集团）；S1010掌上离心机（美国赛洛捷克）。

从动物臂头静脉采血后，将血液样本置于不含抗凝剂的采血管中，静置10 min后3 000 r·min⁻¹离心5 min，分离血细胞和血清，并在−80 ℃条件下长期储存。

将SNAP 4Dx Plus试剂盒中的所有试剂从冰箱取出后在室温下复温30 min，使用试剂商提供的巴氏滴管，取3滴血清样本至样品管中，随后向其中滴加4滴预混液，颠倒混匀并使用掌上离心机瞬时离心后，将样品管中所有液体转移至试剂盒的样品孔中，待液体流过结果窗，到达指定位置后按下激活装置，8 min后读取结果。

使用Excel（Microsoft Excel 2013）整理保存数据信息，并将问卷信息整理精简，供后续数据分析使用。

使用R（R version 4.3.2）和R Studio（R Studio version 2023.12）对调查问卷所采集的临床信息进行统计分析。首先，通过对二分类变量进行单因素逻辑回归分析和对多分类变量进行似然比检验，识别出潜在的风险因素（统计学显著性水平定义为P<0.25）。随后，将筛选出的所有因素纳入多因素逻辑回归分析中，通过计算方差膨胀因子（VIF）判断因素之间的共线性（阈值定义为VIF<10），并采用后向逐步回归法剔除不显著的变量。最终通过保留P<0.05的显著变量识别出对结果有重要影响的风险因素。模型结果以各水平的系数、P值、优势比（OR）及其95%置信区间（95% CI）的方式呈现。此外，最终模型的拟合优度通过皮尔森卡方检验（Pearson Chi-square Test）、赤池信息准则（AIC）和贝叶斯信息准则（BIC）进行评估，其中皮尔森卡方检验的统计学显著性水平定义为P<0.05。

在研究期间，共对184只受试犬的血液样本进行了无形体抗体检测，所有血液样本均记录了采样地点和时间。其中128只受试犬的临床数据信息完整，可用于相关风险因素分析。这128只受试犬的平均年龄为3.6岁。根据其他文献报道，本研究将犬分为幼年犬（≤2岁）、成年犬（2～7岁）、中年犬（7～13岁）以及老年犬（≥13岁）4个年龄，其中成年犬占比最大，达51.2%；幼年犬次之，占30.7%；中年犬和老年犬的比例相对较少，分别为17.3%和0.8%。性别组成方面，雄性犬65只，雌性犬63只。在所有调查的犬品种中，贵宾犬占比最高，达26.6%，随后为比熊犬和柯基犬，分别占18.0%和13.3%。

根据SNAP 4Dx Plus试剂盒说明书，该试剂盒可对A. phagocytophilum/A. platys抗体进行检测，部分阳性检测结果如图1所示。通过对海口地区184份血液样本进行检测，发现A. phagocytophilum/A. platys抗体的流行率为7.1%，9家动物医院的阳性率见表2。

图  1  SNAP 4Dx Plus试剂盒检测结果

Figure 1.  The results of the SNAP 4Dx Plus test kit

通过对犬年龄、性别、品种、户外活动史、蜱虫叮咬史、体外驱虫情况、所处环境中是否有其他伴侣动物、来源以及旅游史等变量进行分析，识别出潜在的风险因素，分析结果见表3。通过单因素逻辑回归分析和似然比检验发现，犬的年龄、性别、蜱虫叮咬史以及体外驱虫情况可能和无形体血清抗体检测结果存在关联。

将单因素逻辑回归分析和似然比检验所得到的潜在风险因素全部纳入多因素逻辑回归分析中。结果显示，所有纳入多因素逻辑回归分析的变量的VIF值均小于10，表明这些变量不存在明显的共线性问题。通过模型优化，最终得到仅含有“蜱虫叮咬史”风险因素的模型。模型表达式如公式（1）所示。

式中，P表示无形体血清抗体检测为阳性的可能性；$ \dfrac{P}{1-P} $ 反映了无形体血清抗体检测呈阳性相对于阴性的几率；x则需要根据不同的情况赋予不同的值，当没有蜱虫叮咬史时，$ {x}_{1} $和$ {x}_{2} $值均取0；当有蜱虫叮咬史时，$ {x}_{1} $值取1，$ {x}_{2} $值取0；当不清楚是否有蜱虫叮咬史时，$ {x}_{1} $值取0，$ {x}_{2} $值取1。此外，由最终模型得出的表达式计算显示，有蜱虫叮咬史犬检出无形体抗体阳性的概率为21.2%，并通过计算OR值，可得出有蜱虫叮咬史的犬检出无形体抗体阳性的可能性是无蜱虫叮咬史犬的9倍。最终模型中该风险因素在不同水平下的系数、P值、OR值及其95%置信区间如表4 所示。

使用皮尔森卡方检验、AIC和BIC对最终模型的拟合优度进行评估。结果显示，皮尔森卡方统计量为124，P值为0.41。AIC值为66.31，BIC值为74.77，和其他模型相比，两者均为最低值。上述结果表明，相较于其他模型而言，最终模型对数据的拟合较好，能够较好地解释数据中的变异性。

本研究通过调查海南省海口地区伴侣犬无形体血清抗体的阳性率，初步明确了海口地区无形体血清抗体的流行情况，流行率可达7.1%，这一结果和同处于热带和亚热带地区的哥斯达黎加（6.4%）、巴西（9.8%）以及巴基斯坦（6.4%）的结果相似^{[25 − 27]}，但低于周边国家或地区先前报道的数据（21.1%～29.0%）^{[16 − 18]}。导致这种差异的原因一方面是研究对象的不同，另一方面是研究地点的差异。部分研究的调查主体为流浪犬，并纳入了众多非城市地区。与生活在城市的伴侣犬相比，流浪犬或在乡村居住的伴侣犬更加频繁地接触外界环境，且接受医疗检查的机会有限，导致其患虫媒病的概率更高。有研究分别于2012年和2017年对北京、长沙、成都、福州等21个城市的伴侣犬进行了无形体血清抗体的流行率调查，发现除了福州（10.0%）和厦门（8.6%）外，其余地区的流行率均低于本研究结果^{[28 − 29]}。这可能是由于我国南方沿海地区温暖潮湿的气候特点，导致相关蜱类种群的高丰度，从而增加了犬无形体病的患病风险。这表明在适宜蜱虫生长的地区，需要进一步加强虫媒病的防控措施。

本研究结合动物的临床数据，采用与其他研究一致的分类方式，对年龄、体外驱虫状况等因素进行分析，以探讨与无形体抗体阳性结果相关的风险因素^{[30 − 31]}。通过单因素逻辑回归分析，发现犬的年龄、性别、体外驱虫情况以及蜱虫叮咬均会影响无形体血清抗体的检测结果。其中，无形体抗体阳性的年龄偏好与其他研究的结论类似，即老年犬对无形体的易感性较高^{[31 − 32]}。其原因在于与青年犬相比，年龄较大的犬暴露于外界环境的时间更长，增加了媒介生物寄生和感染相关病原的可能^[32]。而无形体血清抗体阳性结果的雄性倾向，则可能与雄性群体的行为有关。这些行为使其更容易与蜱虫接触，进而增加感染风险^[31]。在多因素逻辑回归分析中，蜱虫叮咬史与无形体血清抗体检测结果呈显著关联，即有蜱虫叮咬史的犬检出无形体抗体阳性的可能性显著高于无蜱虫叮咬史的犬，这一结论和大多数研究一致，进一步证实了蜱虫作为病媒生物的重要角色^{[22, 30, 33 − 34]}。

动物来源和生活环境是影响病原传播的重要因素之一，例如居住在乡村的犬因其接触环境更加多样，户外活动更为频繁，其患虫媒病的风险也会更高^[35]。基于这一假设，本研究调查了动物来源和无形体血清抗体阳性结果之间的关系，结果发现，两者之间并没有显著关联。这可能是由于受到了样本量的限制^[25]。另一个原因可能为调查过程中未充分考虑动物进入家庭时的年龄。如果动物在幼龄阶段进入家庭，其在高风险环境中的暴露时间有限，接触虫媒和虫媒病病原的机会也会相应减少，一定程度上削弱了动物来源与虫媒病感染风险之间的关联性。此外，犬的饲养密度也是影响虫媒病传播的风险因素之一，同一环境中共同生活的犬数量越多，动物感染虫媒病的风险越大，这可能和蜱虫的生活史和病原在蜱虫中的传播方式有关^[22]。为了验证伴侣犬饲养密度和无形体血清抗体结果之间的关联，本研究纳入了“多宠家庭”这一因素，然而结果显示二者并无显著关联。血红扇头蜱属于三宿主蜱，即蜱虫生长发育的3个阶段需要在3个不同的宿主上寄生发育才能完成^[36]。在本研究采集的临床信息中，大部分家庭的养犬数量并未超过3只，这可能意味着单个家庭的犬数量不足以支持蜱虫完成完整的生活周期，从而影响病原的传播效率。

本研究使用的床旁检测试剂盒是针对无形体p44/MSP2蛋白所产生的IgG和IgM抗体所设计的，该试剂盒目前广泛应用于兽医临床实践中，针对无形体抗体的检测具有较高的敏感性（94.1%）和特异性（98.4%），但由于抗体的交叉反应，该试剂盒无法对动物感染的具体无形体种类做出判断^{[37 − 39]}，因此，本研究只能得出伴侣犬是否存在无形体感染的一般性结论，无法确定动物感染的具体无形体种。此外，由于抗体反应的滞后性和持久性，本研究中使用的试剂盒并不能完全反映动物的感染状态，即当血清学检测显示阳性时，只能说明动物产生了抗原抗体反应，并不能明确表明动物当前正在感染；当血清学检测为阴性时，并不意味着动物一定未发生感染，可能由于感染后并不能即时检测到产生的抗体^[40]，因此在后续研究中，应使用PCR对病原进行进一步检测，以确定动物的感染状态以及所感染的无形体种。但周飒等通过对海南地区546只犬体表蜱虫所携带的无形体检测发现，没有蜱虫携带A. phagocytophilum，有1.1%的蜱虫携带A. platys^[41]。这一结果表明，海南地区犬感染的无形体可能主要为A. platys，而非A. phagocytophilum。此外，在多因素逻辑回归分析中，仅有1个因素被纳入最终模型中，这可能是由于没有考虑到其他混杂因素的作用，例如户外活动频次、驱虫频次等。样本量的限制也可能会降低模型的统计功效，导致某些具有微弱效应的风险因素无法呈现显著关联，进而使其未能被纳入最终模型中。

作为一种重要的人兽共患病病原，无形体对人类健康造成严重威胁。数据显示，2012—2016年，美国共报道了15 778例A. phagocytophilum感染的病例，感染率为每百万人感染7.72例，其中2008—2010年，感染率增幅更是高达53%^{[13, 42]}。尽管A.platys在人类中的报道较少^[43]，但从Battilani等基于16s rRNA对无形体所构建的进化树分析来看，A. platys和A. phagocytophilum有较近的亲缘关系，暗示着这两种病原在形态、生物特点或生态位上可能表现出一些相似性，具有重要的公共卫生意义^[7]。从“全健康”视角分析，犬无形体的高流行率可能意味着与其共处同一环境的人类也面临着感染虫媒病的风险。因此，本研究发现的无形体在海南省海口地区伴侣犬的高流行率不仅说明了无形体对伴侣犬会造成健康威胁，也对与犬有密切接触的宠物主人起到了警示作用。此外，本研究通过风险因素分析，发现有蜱虫叮咬史犬检出无形体抗体阳性的概率为21.2%，进一步明确了蜱虫作为病媒生物的重要角色。考虑到伴侣犬和人类的密切接触，特别是在伴侣犬数量激增的当下，对伴侣犬虫媒病的监测尤为重要。宠物主人应该充分了解虫媒病的潜在危害，同时认识到仅凭动物是否表现出临床症状，无法全面反映其健康状况。为降低伴侣犬感染虫媒病的风险，应尽量减少其在森林、草坪等蜱虫密集区域的活动时间，并定期检查宠物身上的蜱虫寄生情况。一旦发现寄生，应迅速采取措施，做到早发现，早治疗，早预防。此外，从公共卫生和预防医学的角度分析，伴侣犬发挥的“哨兵”作用应得到重视，在伴侣犬虫媒病的流行区域，宠物主人也应该做好自身防护，避免蜱虫叮咬，如发现不适，应及时就医，并向临床医生及时说明和宠物的接触史，为准确诊断争取时间。本研究结果为预防和控制蜱传疾病提供了科学依据，为海南地区伴侣犬无形体流行情况的深入研究奠定了基础。

致谢：诚挚感谢各采样医院及相关医务人员在研究设计、数据收集以及受试犬主人沟通等方面的大力支持与无私协助，为本研究的顺利开展提供了坚实保障。同时感谢海南医科大学尹飞飞研究员在研究设计初期提供的宝贵意见和建议，为本研究的顺利推进奠定了坚实基础。