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真菌和细菌共生关系主要是形成真菌–细菌联合体，形成联合体的细菌主要是菌根辅助细菌（mycorrhiza helper bacteria，MHB）和菌丝内生细菌（endofungal bacteria，EFB），在Duponnois和Garbaye的间接土壤熏蒸试验中，首次发现一种能辅助植物菌根形成的细菌—菌根辅助细菌[1]，后来研究发现MHB能提高真菌孢子的萌发率和存活率，建立起植物根系与真菌菌丝之间联系的桥梁，使菌根更容易产生[2]。Poole在樟子松和红乳菇的外生菌根中发现，其中80%的细菌能促进菌根共生关系的建立，20%的细菌对共生关系无明显作用[3]。
菌根真菌和内生细菌在植物的生长和发育过程中起着重要的作用。菌根真菌通过与植物根系形成菌根共生，提供植物所需的养分，增强植物的抗逆性和生长发育能力。同时，菌根真菌还能够分解土壤中的有机物质，促进植物的生长[4 − 5]。内生细菌则通过与植物根系形成根际共生，通过固氮、溶磷和溶钾等功能，为植物提供养分。此外，细菌能产生一些生长调节物质，促进植物的生长和发育[6 − 7]。
金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）是兰科多年生草本植物，其茎为一种重要中药材，具有广泛药用价值[8 − 9]。金钗石斛作为附生兰，已成为海南省槟榔、橡胶等多年生经济林下立体种植常见作物[10 − 11]。石斛作为典型菌根性植物，在石斛菌根真菌与内生细菌的分离研究中，研究者通常将菌根真菌与内生细菌分别分离，然后进行人工组合以形成共生体[7,12 − 13]。然而，在实际分离途中发现，存在一类在自然条件下难以分离菌根真菌和内生细菌菌类组合，这类组合自然共生的机理和特征对揭示石斛与真菌、细菌共生关系的深入研究具有十分重要意义。因此本研究以分离出的真菌与细菌自然共生体为研究对象，对金钗石斛根系微生物菌根真菌和内生细菌共生关系和功能方面测定，分析其自然共生机理，为金钗石斛菌根真菌和内生细菌的共生组合分离筛选和功能测定提供理论依据。
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供试菌种为课题组在海南省海口市秀英区火山口石斛种植园（19°58′43.75″—19°49′46.73″N，110°9′37.60″—110°17′16.75″E）从岩石附生和槟榔树附生的金钗石斛上分离与筛选菌根真菌与细菌自然组合。真菌采用PDA固体培养基培养，细菌则采用NB培养基培养。
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细菌培养采用NB培养基，真菌培养采用PDA培养基，组培苗培养采用1/4 Ms培养基。固氮能力测定采用Ashby培养基，解钾能力测定采用钾长石解钾培养基，解磷采用NBRIP培养基，解纤维采用纤维素刚果红培养基（表1）。
表 1 培养基配方
Table 1. Culture medium formula
功能
Function培养基
Culture medium配方（1 L）
Formula（1 L）pH 细菌 NA 胰蛋白胨10 g、氯化钠5 g、牛肉膏3 g、琼脂20 g 7.4 ± 0.1 NB 胰蛋白胨10 g、氯化钠5 g、牛肉膏3 g 7.4 ± 0.1 真菌 PDA 马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g 自然 PD 马铃薯200 g、葡萄糖20 g 自然 固氮能力测定 Ashby[14] KH2PO40.2 g、NaCl 0.2 g、MgSO4 0.2 g、CaCO3 5 g、K2SO4 0.1 g、葡萄糖10 g、琼脂粉15 g 自然 解钾能力测定 钾长石[15]
培养基蔗糖5 g、（NH4）2SO4 0.5 g、钾长石1 g、NaH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeCl3 0.005 g、CaCO3 0.1 g、琼脂20 g 自然 解磷能力测定 NBRIP[16] 葡萄糖10.0 g、Ca2（PO4）3 5.0 g、MgCl2 5.0 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KCl 0.2 g、（NH4）2SO4 0.1g g、琼脂15.0 g 自然 解纤维素能力测定 纤维素[17]
刚果红纤维素5 g、NANO3 1.2 g、KH2PO4 0.9 g、MgSO4 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪素0.5 g、 自然 -
以筛选中难以分离开的真菌和细菌为自然共生体，进行多次分离筛选，正常生长的定为共生组合，对共生组合进行鉴定，筛选掉生长不良的、难以继代培养的组合，标记为人工可培养的、自然共生组合。
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1、DNA提取和检测：利用天根细菌DNA试剂盒提取细菌DNA，天根植物DNA试剂盒提取真菌DNA，再利用超微量分光光度计和0.5%（w/w）琼脂糖凝胶电泳对产物进行初步检测，不合格的重新提取后，进行送检，使用多种通用引物对细菌的16S和ITS位点序列进行PCR扩增并抽取部分样品进行1%（w/w）琼脂糖凝胶电泳检测[18 − 19]。
2、测序及序列拼接：对PCR产物进行Sanger测序，测序平台为ABI公司的3730xl DNA Analyzer测序仪。Chromas（Version 2.6.5）分析软件进行测序峰图的质控，并导出相应的序列文件，双向测序使用SeqMan（Version 8.0）分析软件进行拼接（表2）。
表 2 引物信息
Table 2. Primer information
微生物类型
Microbial type检测位点
Detection site引物编号
Primer number引物名称
Primer引物序列
Primer sequence细菌 16S 1492R 1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT 27F 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG P80287 27F-SEQ AGGAACACCAGTGGCGAAGG P80288 1492R-SEQ GTTTACGRCGTGGACTACCA 真菌 ITS ITS1 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG P83811 P83811 TCTCCCACCCTTTGTGAACG P83812 P83812 ACCTTGAGAAAAGTTCAG -
（1）将真菌采用三块直径6 mm菌饼接种于PD培养基中培养2 d后，以1%（v/v）接种量（1 mL）接种细菌，培养7-8 d后将真菌菌丝收集烘干称重，对菌液采用分光光度法进行OD600检测。
（2）采用胡亚强的新蚜虫疠霉真菌和醋酸钙不动杆菌共培养方法[20]，橙色冻存管放置NA培养基，在冻存管中接种真菌和细菌，外围培养基采用PDA培养基，过夜培养采用PD培养基。
（3）真菌和细菌拮抗采用平板拮抗法[21]，对峙点样到PDA平板上，观察拮抗关系。
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无菌条件下，用孔径6 mm打孔器依次取G2/G8菌饼放入PDA培养基中，于25 ℃的黑暗培养箱中培养，直至长满培养皿，观察菌落生长变化以及菌落特征，对菌株进行形态学鉴定，挑取培养皿中新鲜菌丝放置载玻片上，通过光学显微镜观察菌丝的形态结构特征并拍照[22 − 23]。
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将内生真菌和共生细菌组合加入PD培养基中，于28℃、180 r·min−1摇床培养，4 d后用镊子挑取液体培养基中的菌丝，放置载玻片上，利用革兰氏染色法对共生组合进行染色，通过光学显微镜400 x 和
1000 x 观察菌丝和细菌结构[24]。 -
真菌采用孔径6 mm打孔器打直径6 mm真菌菌饼，细菌则是用NB培养基培养到OD600=0.4−0.6。
分别将细菌菌液以2%（v/v）接种量（100 μL）、单块真菌菌饼接种到5 mL NBRIP培养基上培养7 d，用钼锑抗比色法测定可溶性磷。以同体积的NBRIP作为对照[25]。
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分别将细菌菌液和真菌菌饼接种于Ashby固体培养基上，置于28 ℃培养箱培养4-6 d，观察是否生长，再将细菌菌液以1%（v/v）接种量（1 mL）、三块真菌菌饼接种到100 mL Ashby液体培养基上培养7 d检测培养基的铵态氮和硝态氮，以空白Ashby液体培养基作为对照[26]。
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将细菌菌液以1 %（v/v）接种量（1 mL）、三块真菌菌饼接种到100 mL钾长石液体培养基上，置于28 ℃培养箱培养7 d然后进行火焰分光光度法测定，以空白钾长石液体培养基作为对照[27]。
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解纤维采用纤维素刚果红固体培养基，将20 μL菌液和三块6 mm菌饼接种于纤维素刚果红固体培养基上，培养3～4 d[28]。
细菌解纤维能力=D（透明圈直径/mm）−d（细菌菌落直径/mm）
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产生长素测定采用Salksowski Ⅰ进行初筛，若产生生长素则采用Salksowski Ⅱ进行比色法定量测定[29]。
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整理数据使用软件WPS office（Version 2023）及GraphPad Prism （Version 9.5.1），核酸序列BLAST比对参考NCBI的Genbank数据库（
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ），系统进化树构建使用软件MEGA-X（Version 11.0.03）采用NJ法构树，Bootstrap（100次）检验。菌种鉴定同时参考BLAST比对结果和系统树聚类结果，部分再结合形态学鉴定。 -
本研究共筛选出真菌（表3）与细菌自然共生组合18组（表4），根据NJ系统树可知，已鉴定共生组合中细菌和真菌多为芽孢杆菌属（Bacillus）细菌和镰刀菌属（Fusarium）真菌（图1）；通过多次筛选、鉴定，去除检测不出、重复以及无法继代培养的共生组合。仅剩G2、G8、G10、G17、G18五组自然共生菌组，基于NJ系统树分析，G2和G8是茄病镰刀菌（Fusarium solani）分别和沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）共生组合；G17和G18是间座壳菌（Diaporthe phaseolorum）和高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）共生组合；G10和G18同种细菌不同种真菌组合，是枯草芽孢杆菌分别与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和间座壳菌共生（图2）。
表 3 细菌菌株鉴定信息
Table 3. Information about identification of bacterial strains
菌株
StrainGenBank登录号
GenBank accession No属名
Genus name最相近的参考菌种
Nearest reference taxon鉴定值（%）
Per. ident（%）G1B OP796350 Bacillus Bacillus thuringiensis 100.00% G2B OP798002 Bacillus Bacillus safensis 100.00% G3B OP798003 Bacillus Bacillus safensis 100.00% G4B OP798008 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.93% G5B OP798009 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.58% G6B OP798010 Bacillus Bacillus subtilis 99.57% G7B OP798005 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.93% G8B OP798006 Bacillus Bacillus cereus 99.65% G9B OP798007 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.93% G10B PP024249 Bacillus Bacillus subtilis 100.00% G11B OQ092446 Peniophora Phytobacter diazotrophicus 99.36% G12B OQ092454 Bacillus Bacillus altitudinis 100.00% G13B OQ092447 Bacillus Bacillus subtilis 99.86% G14B PP024250 Bacillus Bacillus subtilis 100.00% G15B OQ092448 Bacillus Bacillus subtilis 99.93% G16B OQ092432 Bacillus Bacillus altitudinis 100.00% G17B PP024251 Bacillus Bacillus altitudinis 100.00% G18B PP024252 Bacillus Bacillus subtilis 100.00% 注：G1B-G18B代表G1-G18共生组合中的细菌编号。 Note: G1B-G18B represent bacterial numbers in symbiotic combinations G1-G18. 表 4 真菌菌株鉴定信息
Table 4. Information about identification of fungal strains
菌株
StrainGenBank登录号
GenBank accession No属名
Genus name最相近的参考菌种
Nearest reference taxon鉴定值（%）
Per. ident（%）G1F PP990699 / / / G2F PP990700 Fusarium Fusarium solani 100.00% G3F PP990701 Fusarium Fusarium solani 100.00% G4F PP990702 Fusarium Fusarium solani 99.83% G5F PP990703 / / / G6F PP990704 / / / G7F PP990705 Fusarium Fusarium solani 99.64% G8F PP990706 Fusarium Fusarium solani 100.00% G9F PP990707 / / / G10F PP990708 Fusarium Fusarium oxysporum 100.00% G11F PP990709 Peniophora Peniophora sp. 99.38% G12F PP990710 / / / G13F PP990711 Botrytis Botrytis cinerea 99.82% G14F PP990712 Diaporthe Diaporthe phaseolorum 99.14% G15F PP990713 Phomopsis Phomopsis sp. 99.65% G16F PP990714 / / / G17F PP990715 Diaporthe Diaporthe phaseolorum 99.29% G18F PP990716 Diaporthe Diaporthe sp. 99.46% 注：G1F-G18F代表G1-G18共生组合中的真菌编号，“/”代表双峰的真菌种。 Note: G1F-G18F represent the fungal numbers in the symbiotic combinations G1-G18. "/" stands for a true strain with two peaks. 
图 1 基于16S和ITS的内生细菌和菌根真菌的系统树
Figure 1. Phylogenetic tree of endophytic bacteria and mycorrhizal fungi based on 16S and ITS
图 2 共生组合在PD培养基中培养10 d后过滤网情况
Figure 2. Filter screen after symbiotic combinations were cultured in PD medium for 10 days
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通过对比PD培养基中单生真菌菌丝干重和单生细菌OD600，这五组共生菌组在液体培养基中，G10和G18真菌被同组细菌致死（图2、图3），G17真菌菌丝共生组显著低于单生组，G2和G8共生组比单生真菌组真菌菌丝干重增加（图4−A）；细菌方面，G2、G17共生组细菌浓度均显著提高，G8的细菌浓度显著降低（图4−B）。
图 3 共生组合在PD培养基中培养10 d生长情况
Figure 3. Growth of symbiotic combinations cultured in PD medium for 10 days
图 4 细菌生长速率（OD600）和真菌生长速率（菌丝干重）
Figure 4. Bacterial growth rate（OD600）and fungal growth rate（dry weight）
其次，进行真菌和细菌冻存管固体培养基分离培养试验，选取真菌细菌共培养后一个生长较好的平板，进行观察发现：G8盖外真菌菌丝出现细菌菌斑，说明G8细菌伴随真菌扩散；挑取一定量盖外真菌菌丝接种于PD培养基中。倒置过夜培养后发现：PDA固体培养基只存在真菌菌落，而相同培养基相同培养条件下，G2对照组PDA固体培养基上细菌密布，G8对照组未发现细菌。由此可知，G8细菌通过附着在茄病镰刀菌表面，随着孢子飞出盖内，进入盖外培养基。而G2和对照组根据胡亚强的试验结果进行比对，盖外真菌菌丝中有细菌解释只剩下G2和细菌通过G2真菌体表进入其体内，并定殖在真菌体内进入真菌孢子，随着真菌弹射孢子这一途径飞出盖内进入盖外培养基。G17的外围和划线均未发现细菌（图5）。
图 5 共培养放置12 d冻存管NA培养基和24 h培养PDA液体培养基划线
Figure 5. Co-culture of NA culture medium in frozen tube for 12 days and PDA liquid culture medium for 24 hours
对G2、G8、G17三组自然共生组合内的菌根真菌和内生细菌细菌之间进行拮抗试验，G2、G17明显拮抗，G8无明显拮抗。结合液体培养基共培养法和瓶盖共培养法。G2拮抗共生组合，G2细菌内共生且组合促进细菌生长；G8不拮抗共生组合，细菌外共生且两者总生长量增加；G17拮抗共生组合，细菌即不依附菌丝表面也不寄生真菌菌丝，细菌的生长量显著降低，真菌的生长量显著增加，即促进真菌生长的拮抗共生关系（图6）。
图 6 共生菌组菌根真菌与内生细菌之间拮抗关系
Figure 6. Antagonistic relationship between mycorrhizal fungi and endophytic bacteria in symbiotic groups
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对筛选出来的3组共生菌株中的G2/G8真菌做形态学鉴定，结合形态学特征进一步鉴定菌种，为后续功能测定和石斛共培养菌种提供鉴别依据。
茄病镰刀菌（Fusarium solani）在PDA培养基上菌落前期呈白色稀绒状后逐渐变成淡黄色，生长速度较慢，28 ℃环境下，7 d左右长满9 cm培养基，14 d后出现白色孢子。具有气生菌丝，气生菌丝为低平的棉絮状。产孢细胞为瓶梗，长9.65～25.00 μm，着生方式为侧生，与菌丝垂直，顶端发生分生孢子。大型分生孢子呈略微内弯的纺锤形，10.9～17.4 μm × 4.0～5.5 μm，无色。小分生孢子呈卵圆形，7.0～8.6 μm × 3.8～5.1 μm，无色。形态学鉴定与分子鉴定一致，G2和G8均为茄病镰刀菌（Fusarium solani）。
图 7 茄病镰刀菌形态结构图
Figure 7. Morphological structure of Fusarium solani
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G2和G8的共生组中的细菌分别为沙福芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌，均为芽孢杆菌属，是革兰氏染色阳性菌。在显微镜下能被革兰氏染液染成紫红色。通过革兰氏染液染色发现：G2的沙福芽孢杆菌杆菌在G2真菌—茄病镰刀菌菌丝表面有很明显的富集和依附效果（a），同时在G2的厚垣孢子表面也出现沙福芽孢杆菌富集现象（c）（图8−A）。从G8的蜡状芽孢杆菌（d）对比G8菌丝（e）对比观察，发现细菌体积相对较大，不易进入菌丝（图8−B）。
图 8 G2和G8共生菌组的显微镜观察
Figure 8. Microscopic observation of G2 and G8 symbiotic bacteria
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3组自然共生菌中，G8细菌和G17细菌有解磷能力，分别为39.07 mg·kg−1和32.80 mg·kg−1，G2细菌有微弱解磷能力，但与CK无明显差异（图9−A）。真菌与CK可溶磷浓度均无显著性差异，说明3组组合中真菌不具有解磷能力。G8细菌具有较强的解磷能力（图9−B）。
图 9 各内生菌株的解无机磷能力
Figure 9. Ability to dissolve inorganic phosphorus
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通过Ashby固体培养基筛选，真菌不能生长，细菌能正常生长，进行硝态氮的测定，细菌硝态氮均大于CK，G2细菌和G17细菌固氮能力显著强于G8细菌，分别为1.69 μg·mL−1和1.68 μg·mL−1（图10）.
图 10 细菌固氮能力
Figure 10. Nitrogen fixation ability of bacteria
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具有解钾能力的微生物均为硅酸盐细菌或钾细菌，真菌暂未发现解钾能力，因此对共生菌组的细菌进行解钾能力测定，G17具有较弱的解钾能力，水溶钾含量为0.1 ppm，G8具有较强的消耗能力，水溶钾含量为−0.4 ppm（相较于CK），G2则是略小于CK（图11）。
图 11 细菌解钾能力
Figure 11. Potassium solubilizing ability of bacteria
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将上述3组共生菌分别活化接于纤维素刚果红培养基上，培养3d后细菌测量菌落直径和透明圈直径以及差值，真菌则测透明圈直径。可知共生菌组真菌细菌均有解纤维能力，其中真菌中，G2显著大于G8，G17小于其他两组（图12A）。细菌则是解纤维能力G17强于G2、G8但无明显差异（图12B）。
图 12 共生组解纤维素能力
Figure 12. Ability to cellulose decomposition
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对共生菌组进行生长素能力的测定，真菌和细菌均无生长素产生，不具有产生长素能力（图13）。
图 13 共生组产生长素能力的测定
Figure 13. Determination of auxin producing ability
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结合共培养下真菌和细菌生长速度与其组合中的单真菌与单细菌的功能进行功能相关性分析，真菌在共培养状态下生长速度与真菌解纤维素能力显著负相关（−0.96），与解磷能力正相关（0.53），细菌在共培养状态下，与解纤维素能力（−0.70）、解钾能力（−0.87）和固氮能力（−0.81）显著负相关，与解磷能力存在微弱正相关关系（0.33）。即在共培养状态下，具有较强解纤维素、解钾能力和固氮能力的细菌在共培养中生长速度受到抑制，具有较强的解纤维素能力的真菌在共培养中生长速度受到抑制。从功能角度上，G17和G2两组拮抗关系形成原因与两者解纤维素、解钾能力和固氮能力相关；G8不拮抗与两者功能较弱相关（图14）。
图 14 功能相关性分析
Figure 14. Functional correlation analysis
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在石斛菌根真菌和内生细菌分离鉴定中共分离出18组真菌和细菌高度结合的、难以分离的真菌细菌组合，多次分离筛选后，本研究获得5组人工可培育的，疑似自然共生的组合。对这5组组合进行人工共培养发现：G10和G18两组的尖孢镰刀菌和间座壳菌均被同组的枯草芽孢杆菌强烈抑制并致死。这是因为枯草芽孢杆菌作为一种常见的生防菌，其代谢成分脂肽、聚酮类等物质会破坏病原真菌细胞壁[30 − 31]，并且随着枯草芽孢杆菌浓度增高，抑制病原菌的效果越显著[32]。
本研究中三组能够正常共生的分别是茄病镰刀菌和沙福芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌共生以及间座壳菌和高地芽孢杆菌，G2在共培养试验中，真菌干重和细菌浓度均有显著提升，且在后续验证中，细菌在新生菌丝液体培养基培养后划线，重新划出细菌，与醋酸钙不动杆菌与新蚜虫疠霉菌共生结果一致[20,33]，因此G2共生组是细菌内共生结构，G8外圈出现细菌菌斑，说明细菌通过G8的菌丝或者孢子结构移动到外圈，但在新生菌丝液体培养基共培养后划线，并未划出菌丝，说明新生菌丝中并无细菌定居。G17的外圈和划线均未发现细菌，说明细菌并没有跟随真菌菌丝移动或者寄生在菌丝和孢子结构（图4）。
镰刀菌属和芽孢杆菌属是很常见的能形成共生体的真菌和细菌。茄病镰刀菌被报道与慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）共生，并共同解硫[34]；Walley FL等[35]发现球囊霉菌（Glomus clarum）孢子壁上依附的芽孢杆菌属细菌能够起防护作用，保护真菌孢子；之后Xavier LJC等[36]也发现球囊霉菌孢子依赖芽孢杆菌属细菌进行扩散繁殖；Pakvaz S等[37]在地中海的柏树内生真菌中也发现芽孢杆菌属细菌的存在。对G2和G8组合进行显微镜观察，发现G2细菌在G2的菌丝和孢子表面出现富集，说明G2细菌依附G2真菌共生的关系。同时沙福芽孢杆菌属于偏小的芽孢杆菌种（0.4～0.5 μm × 1.2～2.1 μm），属于能进入菌丝或者孢子的细菌。G8的蜡样芽孢杆菌则是偏大的芽孢杆菌种（1.0～1.2 μm × 3.0～5.0 μm），在共生组合中以游离态存在（图8）。
对这三组共生菌组的菌根真菌和内生细菌进行功能测定试验发现：共生菌组的菌根真菌和内生细菌在共有的功能方面呈现出互补趋势，例如G8细菌有较强的解磷能力，解磷能力39.07 mg·kg−1，同时G8真菌消耗磷能力强，G8组真菌比CK组低了1.21 mg·kg−1；G17的真菌解纤维能力弱，真菌透明圈直径仅为21.52 mm，但是G17细菌的解纤维能力强，透明圈与菌落直径差为9.8 mm；并发现解磷菌G8细菌在固氮、解纤维、解钾方面均弱于G2和G17的细菌。其他研究者在解磷、解钾菌筛选中同样出现解磷能力强的细菌比具有解钾能力的解钾能力弱，解钾能力强的细菌比具有解磷能力的解磷能力弱，同时具有固氮能力的根瘤菌解磷能力明显弱于芽孢杆菌属[38 − 39]，3组共生菌组均未发现产生长素的菌株。
结合三组共生菌株的生长速率发现，微生物解磷能力与细菌解钾能力、解纤维能力、固氮能力与生长速率成负相关，说明组合中生长速率越快的真菌和细菌，这些功能相对较弱，结合2.1.2的共培养和拮抗试验结果，这是G2和G17真菌细菌拮抗的原因之一，即当G2和G17共生时，生长速度较慢的真菌和细菌分解和合成的营养物质，被同组生长速度较快的真菌和细菌吸收和利用。
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本试验筛选出三种共生的真菌细菌组合，并通过共培养和功能测定其进行初步的共生验证，并发现：G2（茄病镰刀菌和沙福芽孢杆菌）为拮抗内共生关系，拮抗关系与解纤维素能力、固氮能力、解钾等功能相关。G8（茄病镰刀菌和蜡状芽孢杆菌）为不拮抗外共生关系，共生关系与解磷能力相关。G17（间座壳菌和高地芽孢杆菌）共生状态下能极显著提高细菌生长量，而真菌生长量降低，是偏向G17细菌的偏利共生关系。
Analysis of the natural symbiotic relationship between mycorrhizal fungi and endophytic bacteria of Dendrobium nobile Lindl and determination of its function
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摘要: 为了研究课题组在金钗石斛菌根中发现的菌根真菌和内生细菌自然组合、难以分离这一现象，通过分离、筛选和鉴定，获得3组人工可培育、分离的菌根真菌与内生细菌的自然组合，并通过共培养试验与功能性测定对组合之间的共生关系和共生机理探究。结果表明：G2和G8都是芽孢杆菌属（Bacillus）和茄病镰刀菌（Fusarium solani）的共生组合，而G17同样是芽孢杆菌属（Bacillus）与间座壳菌（Diaporthe phaseolorum）。G2和G17组合之间具有拮抗关系，总生长量增加，G8组合无拮抗关系，两者相互促进。G2和G17组合中真菌均具有强解纤维素能力，透明圈直径达到了27.62 mm和21.52 mm，同时细菌具有固氮能力，分别为1.69 μg·mL−1和1.68 μg·mL−1。强解纤维素能力和固氮能力共同作用于G2和G17组合之间的拮抗关系；G8组合中真菌溶液中水解磷含量最低，细菌解磷能力最强，达到了39.07 mg·kg−1，功能方面存在互补关系。因此，自然共生组合其共生关系存在互补、促进及抑制等多种形式，且功能与共生关系存在相关性。Abstract: An attempt was made to investigate the naturally occurring, difficult-to-separate combinations of mycorrhizal fungi and endophytic bacteria found in the mycorrhizae of Dendrobium nobile Lindl. Three groups of artificially cultivable and separable natural combinations of mycorrhizal fungi and endophytic bacteria were isolated, screened, and identified. Through co-cultivation experiments and functional assessments, the symbiotic relationships and mechanisms among these combinations were analyzed. The results showed that G2 and G8 are symbiotic combinations of Bacillus and Fusarium solani, while G17 is a combination of Bacillus and Diaporthe phaseolorum. There is an antagonistic relationship between the G2 and G17 combinations, leading to an increased total growth, whereas the G8 combination exhibits no antagonistic relationship, with mutual promotion between the two. The fungi in the G2 and G17 combinations possess strong cellulolytic abilities, with clear zone diameters of 27.62 mm and 21.52 mm, respectively, while the bacteria exhibit nitrogen-fixing abilities of 1.69 μg·mL−1 and 1.68 μg·mL−1, respectively. The strong cellulolytic and nitrogen-fixing abilities contribute to the antagonistic relationship between the G2 and G17 combinations. In the G8 combination, the fungal solution contains the lowest hydrolyzed phosphorus, while the bacteria have the highest phosphorus-solubilizing ability, reaching 39.07 mg·kg−1, indicating a complementary functional relationship. Therefore, natural symbiotic combinations exhibit various forms of symbiotic relationships, including complementarity, promotion, and inhibition, and there is a correlation between function and symbiotic relationship.
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Key words:
- Dendrobium nobile Lindl /
- mycorrhizal fungi /
- endophytic bacteria /
- symbionts
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图 2 共生组合在PD培养基中培养10 d后过滤网情况
注：G2（A）真菌菌丝较多，G10（B）和G18（C）真菌未生长。
Fig. 2 Filter screen after symbiotic combinations were cultured in PD medium for 10 days
Note: G2(A) fungi produced more hyphae, while G10(B) and G18(C) fungi failed to grow.
图 3 共生组合在PD培养基中培养10 d生长情况
注：G2（左一）、G8（左二）和G17（左四）为真菌悬浊液，G10（左三）和G18（左五）为细菌悬浊液。
Fig. 3 Growth of symbiotic combinations cultured in PD medium for 10 days
Note: G2（first from left）, G8（second from left）and G17（fourth from left）are fungal suspensions, and G10（third from left）and G18（fifth from left）are bacterial suspensions.
图 4 细菌生长速率（OD600）和真菌生长速率（菌丝干重）
注：****：P ≤0.0001 ；***：P ≤ 0.001；**：P ≤ 0.01；*：P ≤ 0.05;ns:P > 0.05，下同。两两组别之间比较，代表单真菌或细菌（G2F/B、G8F/B、G17F/B）和共生状态下真菌和细菌（G2F/B-S、G8F/B-S、G17F/B-S）生长率差异。
Fig. 4 Bacterial growth rate（OD600）and fungal growth rate（dry weight）
Note: ****: P ≤0.0001; ***: P ≤ 0.001; **: P ≤ 0.01; *: P ≤ 0.05; ns: P > 0.05, similarly hereinafter. The comparison between the two groups represents the difference of growth rate between single fungi or bacteria（G2F/B, G8F/B, G17）and fungi and bacteria（G2F/B-S, G8F/B-S, G17F/B-S）in symbiotic state.
图 5 共培养放置12 d冻存管NA培养基和24 h培养PDA液体培养基划线
注：a−e为共培养放置橙色冻存管NA培养基培养12 d情况，G8背面（d）外圈可看到细菌菌斑。G2（b）和G17（e）无菌斑。A−D为外圈PDA培养基真菌菌丝随机挑选接种，24 h液体培养基培养，划线接种，G2（B，受抑制）和G17（D，受抑制）划线划出细菌。
Fig. 5 Co-culture of NA culture medium in frozen tube for 12 days and PDA liquid culture medium for 24 hours
Note: a−e refers to co-culture with orange cryopreservation tube in NA medium for 12 days, and bacterial plaque can be seen in the outer ring of G8 back（d）. G2（b）and G17（e）: sterile spots. A−D were randomly selected and inoculated with fungal hyphae in PDA medium, cultured in liquid medium for 24 hours, streaking inoculation, and G2（B, inhibited）and G17（D, inhibited）streaking bacteria.
图 6 共生菌组菌根真菌与内生细菌之间拮抗关系
注：观察拮抗关系通过是否存在抑菌圈，其中G2和G17有很明显抑菌圈，G8无抑菌圈。
Fig. 6 Antagonistic relationship between mycorrhizal fungi and endophytic bacteria in symbiotic groups
Note: Observe whether there is bacteriostatic circle through the antagonistic relationship, in which G2 and G17 have obvious bacteriostatic circle, while G8 has no bacteriostatic circle.
图 7 茄病镰刀菌形态结构图
注：a：菌落形态 b：分生孢子梗及小分生孢子 c：菌丝及厚垣孢子
Fig. 7 Morphological structure of Fusarium solani
Note: a: Colony morphology; b: Conidiophore and microspore; c: Hypha and chlamydospore
图 8 G2和G8共生菌组的显微镜观察
注：a：G2真菌菌丝 b：G2游离态细菌 c：真菌孢子 d：G8游离态细菌 e：G8真菌菌丝
Fig. 8 Microscopic observation of G2 and G8 symbiotic bacteria
Note: a: G2 fungal mycelium; b: G2 free bacteria; c: Fungal spores; d: G8 free bacteria e: G8 fungal mycelium
图 14 功能相关性分析
注: SZ：单细菌（真菌）生长速度；JL：解磷能力；GD：固氮能力；JZ：解钾能力；JQ：解纤维素能力
Fig. 14 Functional correlation analysis
Note: SZ: Growth rate of single bacteria（fungi）; JL: Phosphorus dissolving ability; GD: Nitrogen fixation capacity; JZ: Potassium dissolving ability; JQ: Cellulolytic ability
表 1 培养基配方
Table 1 Culture medium formula
功能
Function培养基
Culture medium配方（1 L）
Formula（1 L）pH 细菌 NA 胰蛋白胨10 g、氯化钠5 g、牛肉膏3 g、琼脂20 g 7.4 ± 0.1 NB 胰蛋白胨10 g、氯化钠5 g、牛肉膏3 g 7.4 ± 0.1 真菌 PDA 马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g 自然 PD 马铃薯200 g、葡萄糖20 g 自然 固氮能力测定 Ashby[14] KH2PO40.2 g、NaCl 0.2 g、MgSO4 0.2 g、CaCO3 5 g、K2SO4 0.1 g、葡萄糖10 g、琼脂粉15 g 自然 解钾能力测定 钾长石[15]
培养基蔗糖5 g、（NH4）2SO4 0.5 g、钾长石1 g、NaH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeCl3 0.005 g、CaCO3 0.1 g、琼脂20 g 自然 解磷能力测定 NBRIP[16] 葡萄糖10.0 g、Ca2（PO4）3 5.0 g、MgCl2 5.0 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、KCl 0.2 g、（NH4）2SO4 0.1g g、琼脂15.0 g 自然 解纤维素能力测定 纤维素[17]
刚果红纤维素5 g、NANO3 1.2 g、KH2PO4 0.9 g、MgSO4 0.5 g、KCl 0.5 g、酵母膏0.5 g、水解酪素0.5 g、 自然 
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表 2 引物信息
Table 2 Primer information
微生物类型
Microbial type检测位点
Detection site引物编号
Primer number引物名称
Primer引物序列
Primer sequence细菌 16S 1492R 1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT 27F 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG P80287 27F-SEQ AGGAACACCAGTGGCGAAGG P80288 1492R-SEQ GTTTACGRCGTGGACTACCA 真菌 ITS ITS1 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG P83811 P83811 TCTCCCACCCTTTGTGAACG P83812 P83812 ACCTTGAGAAAAGTTCAG
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表 3 细菌菌株鉴定信息
Table 3 Information about identification of bacterial strains
菌株
StrainGenBank登录号
GenBank accession No属名
Genus name最相近的参考菌种
Nearest reference taxon鉴定值（%）
Per. ident（%）G1B OP796350 Bacillus Bacillus thuringiensis 100.00% G2B OP798002 Bacillus Bacillus safensis 100.00% G3B OP798003 Bacillus Bacillus safensis 100.00% G4B OP798008 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.93% G5B OP798009 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.58% G6B OP798010 Bacillus Bacillus subtilis 99.57% G7B OP798005 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.93% G8B OP798006 Bacillus Bacillus cereus 99.65% G9B OP798007 Lysinibacillus Lysinibacillus fusiformis 99.93% G10B PP024249 Bacillus Bacillus subtilis 100.00% G11B OQ092446 Peniophora Phytobacter diazotrophicus 99.36% G12B OQ092454 Bacillus Bacillus altitudinis 100.00% G13B OQ092447 Bacillus Bacillus subtilis 99.86% G14B PP024250 Bacillus Bacillus subtilis 100.00% G15B OQ092448 Bacillus Bacillus subtilis 99.93% G16B OQ092432 Bacillus Bacillus altitudinis 100.00% G17B PP024251 Bacillus Bacillus altitudinis 100.00% G18B PP024252 Bacillus Bacillus subtilis 100.00% 注：G1B-G18B代表G1-G18共生组合中的细菌编号。 Note: G1B-G18B represent bacterial numbers in symbiotic combinations G1-G18.
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表 4 真菌菌株鉴定信息
Table 4 Information about identification of fungal strains
菌株
StrainGenBank登录号
GenBank accession No属名
Genus name最相近的参考菌种
Nearest reference taxon鉴定值（%）
Per. ident（%）G1F PP990699 / / / G2F PP990700 Fusarium Fusarium solani 100.00% G3F PP990701 Fusarium Fusarium solani 100.00% G4F PP990702 Fusarium Fusarium solani 99.83% G5F PP990703 / / / G6F PP990704 / / / G7F PP990705 Fusarium Fusarium solani 99.64% G8F PP990706 Fusarium Fusarium solani 100.00% G9F PP990707 / / / G10F PP990708 Fusarium Fusarium oxysporum 100.00% G11F PP990709 Peniophora Peniophora sp. 99.38% G12F PP990710 / / / G13F PP990711 Botrytis Botrytis cinerea 99.82% G14F PP990712 Diaporthe Diaporthe phaseolorum 99.14% G15F PP990713 Phomopsis Phomopsis sp. 99.65% G16F PP990714 / / / G17F PP990715 Diaporthe Diaporthe phaseolorum 99.29% G18F PP990716 Diaporthe Diaporthe sp. 99.46% 注：G1F-G18F代表G1-G18共生组合中的真菌编号，“/”代表双峰的真菌种。 Note: G1F-G18F represent the fungal numbers in the symbiotic combinations G1-G18. "/" stands for a true strain with two peaks.
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