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诺丽(Morinda citrifolia Linn.)原产于南太平洋群岛,在我国主要分布于海南岛、台湾岛、西沙群岛和西双版纳等地[1]。在传统医学中,诺丽植物的不同部位,如果实、叶子和根,被用来治疗肠道不正常、经期抽筋和尿路感染[2],还被用来治疗感冒和流感。诺丽植物提取物被证明具有清除自由基、抗菌、抗分解、抗癌、抗突变和抗炎的作用,并具有抑制低密度脂蛋白氧化、刺激免疫、净化血液、调节胆固醇和调节细胞功能的能力[3-6]。1956年Atkinson等[7]报道了诺丽叶能有效抑制沙门氏菌、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、草分枝杆菌等细菌的生长,并指出可能是诺丽中一些酚类物质(如:珊瑚木苷、L-天门冬氨酸、茜素和莨菪亭)和其他蒽醌类化合物在起作用,这些成分对细菌引起的皮肤感染、感冒、发热等疾病具有显著疗效。West B J等[8]发现大溪地诺丽果的甲醇和正丁醇提取物对大肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,抑制效果与大溪地诺丽果果内的环烯醚萜含量有关,特别是与去乙酚基车叶草甙酸和车叶草甙酸有关[8]。
自然状态下,植物与其内生真菌长期的协同进化,可能导致内生真菌与寄主植物有基因和信息的交流,致使内生真菌产生与寄主植物相同或类似的代谢途径,也可能会产生与寄主植物相同或类似的具有生物活性的次生代谢产物[9-10],因此,利用植物内生真菌发酵可能会得到具有药理作用的化合物。此途径可避免直接从植物提取药用化学成分,起到保护植物资源和提升经济效益的作用。因此,本实验室在研究前期对诺丽内生真菌多样性和抑菌性展开探索,筛选出1株具有较强抑菌性的内生真菌M2,初步鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)。诺丽果汁的发酵与其内生真菌有极大的关联性。内生真菌在发酵过程中,不同的营养物质和发酵条件可影响其代谢产物的产出。在诺丽果汁的发酵生产中不仅要考虑菌丝体增殖条件,还要考虑原料的成本,以及是否有利于代谢产物的积累,本研究中部分氮源就极大地抑制内生真菌M2的生长和减弱其抑菌性。真菌在发酵过程中,生长量与具有生物活性的代谢产物并不成正相关,在发酵过程中,若菌丝体过多会造成营养物质消耗过快,造成菌株的衰弱;菌株营养生长过快时会抑制代谢产物的生成。发酵条件对菌株M2的生长和具有生物活性的代谢产物的产出起关键作用,优化发酵条件可为提高诺丽发酵果汁的生产效率提供理论基础。
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诺丽内生真菌M2保存于海南大学园艺学院药用植物团队实验室。病原细菌:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella spp.)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基、营养琼脂(NA)固体培养基、马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基、真菌基因组DNA提取试剂盒、PCR相关试剂,均购自北京索莱宝Solarbio科技有限公司。PCR引物序列由海南光威科技有限公司合成。
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用接种环挑取内生真菌M2的菌丝于载玻片上,棉蓝染色剂制成玻片,光学显微镜观察菌丝和孢子。根据真菌鉴定手册,从形态上初步鉴定该内生真菌的所属种类[11]。根据Solarbio真菌基因组DNA提取试剂盒方法提取内生真菌M2的DNA,以其DNA作为反应的模板,基于核糖体ITS区域的序列ITS1f(ITS1f:5′-CTTGGTCATTTAGAGGA AGTAA-3′)和ITS4(ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)作为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系(25 μL):ddH2O 9.5 μL、Premix Taq 12.5 μL、引物各1.0 μL,DNA模板1.0 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性40 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸55 s,共35个循环,最后72 ℃延伸10 min,于4 ℃冰箱保存,将PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。将PCR扩增产物送到北京六合华大基因科技有限公司广州分公司进行测序,测得的序列在NCBI数据库中进行Blast比对,确定种属关系,选取相似性较高的序列,用MEGA5.0软件构建系统进化树。
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将病原细菌配成106 cfu·mL−1的菌悬液。吸取106 cfu·mL−1菌悬液0.1 mL于NA平板上涂匀,即得含供试病原细菌平板。把内生真菌M2发酵液减压抽滤,得菌丝与菌液。菌液用等体积乙酸乙酯萃取3次,得菌液乙酸乙酯萃取液。菌丝用2倍体积的乙酸乙酯超声提取30 min,过滤得滤液。合并萃取液和滤液,减压浓缩,水域温度为45 ℃,得到浸膏。分析天平定量分析,配成20 g·L−1二甲基亚砜溶液。抑菌性测定处理:在直径6 mm滤纸片上加20 μL内生真菌次生代谢产物二甲基亚砜溶液,放入含供试病原细菌平板中,做3个重复。空白对照:在直径6 mm滤纸片加20 μL二甲基亚砜,放入含供试病原细菌平板中,做3个重复。处理和对照于37 ℃恒温培养箱中培养1 d,观测抑菌圈的大小。
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将发酵完成的内生真菌M2的菌丝进行减压抽滤,将菌丝于45 ℃烘箱烘干至恒重,用分析天平进行定量分析。
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内生真菌M2发酵条件优化以PDB为基础培养基,培养条件为发酵条件,150 mL锥形瓶装液50 mL、温度25 ℃、培养基初始pH值自然、转速150 r·min−1、发酵5 d。优化结果主要以发酵液和菌丝乙酸乙酯粗提物抑菌性为主要依据,菌丝质量为次要依据。
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供试碳源:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉和玉米粉。每千克培养基添加20 g供试碳源,每处理3次重复,试验值取3次平均值。
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供试氮源:氯化铵、硝酸钠、尿素、牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、鱼粉和豆饼粉。每千克培养基氮源的添加量见表1,每处理3次重复,试验值取3次平均值。
表 1 每千克培养基氮源的添加量
Table 1. Medium supplemented with nitrogen source per kg
氮源
Nitrogen含氮量/%
Nitrogen content添加量/g
Supplement氮源
Nitrogen source含氮量/%
Nitrogen content添加量/g
Supplement尿素 Carbamide 46.67 3.26 酵母提取物 Yeast Extract 9.00 16.9 硝酸钠 NaNO3 16.5 9.22 大豆蛋白胨 Soya Peptone 9.00 16.9 氯化铵 NH4Cl 26.67 5.7 牛肉浸膏 Beef Extract 12.00 12.68 硝酸铵 NH4NO3 16.47 9.23 豆粕粉 Mora Meal 5.23 29.07 胰蛋白胨 Tryptone 12.00 12.68 鱼粉 Fishmeal 8.59 17.71 -
供试无机盐:磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钾、七水合硫酸镁和七水合硫酸亚铁。每千克培养基添加1 g,每个处理3次重复,试验值取3次平均值。
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根据单因素试验结果,选择最佳碳源(葡萄糖)、氮源(硝酸钠)、无机盐(七水合硫酸镁、磷酸二氢钾)共3个因素,设置3个水平,进行正交试验(表2,3)。每个处理进行3次重复,试验值取3次平均值。
表 2 营养元素正交设计
Table 2. Orthogonal design of nutrient elements
水平 Level 葡萄糖 Glucose 硝酸钠 NaNO3 无机盐 Inorganic salt 七水合硫酸镁 MgSO4·7H2O 磷酸二氢钾 KH2PO4 1 2% 0.50% 0.02% 0.02% 2 3% 1.00% 0.06% 0.06% 3 4% 1.50% 0.10% 0.10% 表 3 营养元素浓度配比
Table 3. Ratio of nutrient concentration
试验号 Code 葡萄糖 Glucose 硝酸钠 NaNO3 无机盐 Inorganic salt 七水合硫酸镁 MgSO4·7H2O 磷酸二氢钾 KH2PO4 1 1(2%) 1(0.50%) 1(0.02%) 1(0.02%) 2 1(2%) 2(1.00%) 2(0.06%) 2(0.06%) 3 1(2%) 3(1.50%) 3(0.10%) 3(0.10%) 4 2(3%) 1(0.50%) 2(0.06%) 3(0.10%) 5 2(3%) 2(1.00%) 3(0.10%) 1(0.02%) 6 2(3%) 3(1.50%) 1(0.02%) 2(0.06%) 7 3(4%) 1(0.50%) 3(0.10%) 2(0.06%) 8 3(4%) 2(1.00%) 1(0.02%) 3(0.10%) 9 3(4%) 3(1.50%) 2(0.06%) 1(0.02%) -
以筛选出来的碳源(葡萄糖)、氮源(硝酸钠)、无机盐(七水合硫酸镁和磷酸二氢钾)为基础,分别以装液量40,50,60,70,80,90 mL进行发酵培养,每个处理3次重复,试验值取3次平均值。
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以筛选出来的碳源(葡萄糖)、氮源(硝酸钠)、无机盐(七水合硫酸镁和磷酸二氢钾)和装液量为基础,分别以温度23,25,27,29,31 ℃进行发酵培养,每个处理3次重复,试验值取3次平均值。
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以筛选出来的碳源(葡萄糖)、氮源(硝酸钠)、无机盐(七水合硫酸镁和磷酸二氢钾)、装液量和温度为基础,将培养基的初始pH值为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0。每个处理进行3次重复,试验值取3次平均值。
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在筛选出来的碳源(葡萄糖)、氮源(硝酸钠)、无机盐(七水合硫酸镁和磷酸二氢钾)、装液量、温度和pH值为基础,将摇床的转速调为90,110,130,150,170,190 r·min−1,每个处理3次重复,试验值取3次平均值。
Identification of Bacteriostatic Activity of Noni Endophytic Fungus M2 and Optimization of Its Fermentation Conditions
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摘要: 为了研究发酵条件对诺丽内生真菌M2抑菌性的影响,笔者采用传统方法和ITS rDNA测序方法相结合,将本实验室筛选出的抑菌效果突出的诺丽内生真菌M2初步鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus),在NCBI数据库中登录号为MK560191。通过单因素试验和正交设计对内生真菌M2进行发酵优化,筛选出最优发酵条件:(1)内生真菌M2优化后的培养基方案为200 g土豆煮沸30 min浸出液、葡萄糖20 g、硝酸钠5 g、磷酸二氢钾0.2 g、七水合硫酸镁0.2 g、1 000 mL双蒸水;(2)发酵条件为150 mL锥形瓶装液50 mL、温度25 ℃、培养基初始pH8、转速170 r·min−1。Abstract: An attempt was made to study the effect of fermentation conditions on the bacteriostasis of endophytic fungus M2 extracted from Noni (Morinda citrifolia Linn.). A combination of traditional methods and ITS rDNA sequencing was used to identify the Noni endophytic fungus M2 with outstanding bacteriostatic effect. The endophytic fungus M2 was cultured and fermented under different conditions by using single factor experiment and orthogonal design to optimize its fermentation conditions. The Noni endophytic fungus M2 was initially identified as Aspergillus aculeatus, and its accession number was MK560191 in the NCBI database. The optimum medium for the endophytic fungus M2 was potato infusion 200 g from potato boiled for 30 min, glucose 20 g, sodium nitrate 5 g, potassium dihydrogen phosphate 0.2 g, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g, 1000 mL double distilled water. The optimum fermentation conditions were solution 60 mL in a 150 mL conical flask, temperature 25 ℃, initial culture medium pH 8 and rotation speed 170 r·min−1.
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Key words:
- Noni /
- endophytic fungi /
- bacteriostatic effect /
- fermentation
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表 1 每千克培养基氮源的添加量
Table 1 Medium supplemented with nitrogen source per kg
氮源
Nitrogen含氮量/%
Nitrogen content添加量/g
Supplement氮源
Nitrogen source含氮量/%
Nitrogen content添加量/g
Supplement尿素 Carbamide 46.67 3.26 酵母提取物 Yeast Extract 9.00 16.9 硝酸钠 NaNO3 16.5 9.22 大豆蛋白胨 Soya Peptone 9.00 16.9 氯化铵 NH4Cl 26.67 5.7 牛肉浸膏 Beef Extract 12.00 12.68 硝酸铵 NH4NO3 16.47 9.23 豆粕粉 Mora Meal 5.23 29.07 胰蛋白胨 Tryptone 12.00 12.68 鱼粉 Fishmeal 8.59 17.71 表 2 营养元素正交设计
Table 2 Orthogonal design of nutrient elements
水平 Level 葡萄糖 Glucose 硝酸钠 NaNO3 无机盐 Inorganic salt 七水合硫酸镁 MgSO4·7H2O 磷酸二氢钾 KH2PO4 1 2% 0.50% 0.02% 0.02% 2 3% 1.00% 0.06% 0.06% 3 4% 1.50% 0.10% 0.10% 表 3 营养元素浓度配比
Table 3 Ratio of nutrient concentration
试验号 Code 葡萄糖 Glucose 硝酸钠 NaNO3 无机盐 Inorganic salt 七水合硫酸镁 MgSO4·7H2O 磷酸二氢钾 KH2PO4 1 1(2%) 1(0.50%) 1(0.02%) 1(0.02%) 2 1(2%) 2(1.00%) 2(0.06%) 2(0.06%) 3 1(2%) 3(1.50%) 3(0.10%) 3(0.10%) 4 2(3%) 1(0.50%) 2(0.06%) 3(0.10%) 5 2(3%) 2(1.00%) 3(0.10%) 1(0.02%) 6 2(3%) 3(1.50%) 1(0.02%) 2(0.06%) 7 3(4%) 1(0.50%) 3(0.10%) 2(0.06%) 8 3(4%) 2(1.00%) 1(0.02%) 3(0.10%) 9 3(4%) 3(1.50%) 2(0.06%) 1(0.02%) -
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