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牛大力，一般是指豆科植物美丽鸡血藤Callerya speciosa （Champion ex Bentham） Schot，以根部入药[1 − 2]。牛大力药食两用的历史由来已久，早在明末清初时期就有收录[3 − 4]。据记载，传统中药学认为其味甘性平，具有强筋活络、补虚润肺等诸多功效[5]。现牛大力多作为壮腰健肾丸、强力健身胶囊等众多中成药以及保健酒、茶饮的原材料[4]。而在食用方面，民间常用牛大力制作产后体虚以及强身健体的药膳进行煲汤进补[6]。现代科学研究认为牛大力含有多种营养成分与药理活性成分，具有多种药理作用，是一种有较高医疗保健价值以及经济价值的中药材。
皂苷（Saponin）是指糖或糖醛酸等与不同苷元缩合而成的一类化合物，其苷元结构一般为三萜或甾体[7]。皂苷大部分存在于高等植物中，也少量存在于一些海洋生物中[8]。众多药用植物中都含有皂苷成分，如人参（Panax ginseng）、女贞（Ligustrum lucidum）、三七（Panax notoginseng）、积雪草（Centella asiatica）[7]等。天然皂苷同样具有多种药理作用，如抗氧化、降血糖、对冠心病和阿尔茨海默病有明显改善效果[9 − 10]等，在实际生产和临床应用多领域中潜力巨大，前景广阔。
人体在受到如紫外线照射、化学污染、烟酒等外界因素影响时，体内细胞的自由基会明显增多。自由基因会与其他分子发生反应，将电子进行转移，导致原来的分子结构和性质发生改变。在生物体内，自由基的过度活跃会导致细胞氧化应激，对细胞和组织造成损伤，加速其衰老与凋亡，进而诱导多种疾病的发生[11]。为降低氧化损伤导致疾病的可能性，抗氧化药物和抗氧化剂的开发利用也因此成为了研究热点。对比起人工合成的抗氧化药物，天然抗氧化剂如植物活性成分黄酮、多糖、皂苷等更加安全可靠，无明显毒副作用[12]。目前植物皂苷的抗氧化性研究多有报道，结果均表明植物皂苷具有一定的抗氧化能力[13 − 16]。
皂苷也是牛大力的药理活性成分之一。已有文献表明，在牛大力根的乙醇提取物中分离鉴定出三萜皂苷类成分，且为齐墩果烷型[17]。冯梦莹[18]在牛大力根部乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3种萃取相中均检测到一定量的皂苷成分。但目前对牛大力皂苷相关药理作用方面的研究尚欠缺，提取优化工艺未见报道。李荣宇等[19]研究结果表明，不同产地牛大力总皂苷含量存在一定差异，但不同生长年份牛大力总皂苷含量是否存在差异还未知。莫宏辉等[20]研究发现，牛大力叶中的皂苷成分在体外具有良好的抗氧化活性，但牛大力根部总皂苷的抗氧化研究未见报道。因此，本研究采用单因素结合正交实验法优化牛大力根部总皂苷的超声提取工艺，并用比色法测定不同生长年份（3年生，6年生，10年生，15年生）牛大力根部的总皂苷含量，最后对其抗氧化活性进行评价，以期为进一步开发利用牛大力总皂苷提供理论和试验依据。
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样品材料集中采集于海南省儋州市儋州热带药用植物种质资源圃并经专业鉴定。样品采收后根据不同生长年限进行分类处理，用水清洗材料表面污渍后进行切片或切段操作，并放置烘箱内60 ℃烘干。将烘干后的牛大力粉碎、过60目筛处理后备用。
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精密称取齐墩果酸标准品适量，加入80%乙醇制成质量浓度为0.2 mg·mL−1的标准品溶液。参考李云行等人实验方案[21]，分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准品溶液，60 ℃水浴下挥干溶剂。加入0.2 mL 5%的香草醛冰醋酸溶液使其溶解，再加入0.8 mL高氯酸充分混匀。水浴20 min后，放于冰水处冷却5 min，加入5.0 mL冰醋酸混匀，设定波长为545 nm，最后测吸光值。以吸光值（Y，Abs）为纵坐标、齐墩果酸质量浓度（X，μg·mL−1） 为横坐标，绘制得到标准曲线（图1），其中线性回归方程为Y = 0.053 6X + 0.039 2，相关系数R2 = 0.997 3。标品溶液在质量浓度为0.000 0～26.667 0 μg·mL−1内呈现良好的线性关系。
图 1 齐墩果酸标准曲线
Figure 1. Standard curve of oleanolic acid
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吸取0.1 mL待测样品溶液，按照“1.2.1”项显色步骤测定吸光度值，代入“1.2.1”项的线性方程和以下公式计算牛大力根部总皂苷含量。总皂苷含量（mg·g−1）=总皂苷质量浓度C（mg·mL−1）×总皂苷萃取液体积V（mL）×稀释倍数N/牛大力原料质量M（g）
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称取10 g左右经预处理的牛大力样品，采用超声辅助醇提法考察不同乙醇浓度（60%、70%、80%、90%、100%）、不同超声时间（30、40、50、60、70 min）、不同料液比即样品重量（g）与乙醇体积（mL）的比例（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）以及不同提取次数（1、2、3、4、5）对牛大力根部总皂苷提取的影响。该超声波清洗机型号为SB25-12D 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），功率为600 W（功率大小不可调节）。合并提取液，过滤后将滤液进行减压浓缩、除杂操作得牛大力总皂苷。
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选取提取时间（A） 、料液比（B） 、乙醇浓度（C） 、提取次数（D） 作为考察因素，以总皂苷含量（mg·g−1）为检测指标进一步优化牛大力根部总皂苷提取工艺，具体水平见表1。
表 1 因素水平表
Table 1. Factor level table
水平
Level因素Factor 提取时间
Extract time（A）/min料液比
Solid-liquid ratio（B）/（g·mL−1）乙醇浓度
Ethanol concentration（C）/%提取次数
Number of extractions（D）1 30 1∶30 70 1 2 40 1∶40 80 2 3 50 1∶50 90 3 -
采用正交试验结果中的最佳提取条件组合提取牛大力根部总皂苷，验证牛大力根部总皂苷的优化提取工艺条件。
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准确称取经过预处理的不同年份（3年生，6年生，10年生，15年生）牛大力样品各10 g，采用正交试验中的最佳提取条件组合提取牛大力根部总皂苷。合并提取液，过滤后除杂质和溶剂，经多次萃取后得牛大力根部总皂苷。
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参照文献[22]方法配制DPPH溶液和待测溶液，并将待测液按梯度质量浓度稀释备用。取3支试管，1号试管中2.0 mL的DPPH溶液+2.0 mL待测样品溶液，2号试管做空白对照，3号试管做本底对照。将3组溶液混匀后避光条件下反应0.5 h，选定波长为517 nm测定吸光值A值。阳性对照组为VC。按公式计算：
DPPH自由基清除率=[1−（A样品−A本底）/A空白]×100%。
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根据文献所述方法[23]进行测定。在试管中加入1.0 mL样液+ 2.0 mL FeSO4溶液+ 2.0 mL H2O2溶液，充分摇匀后静置10 min。加入2.0 mL水杨酸乙醇溶液，摇匀后置于37 ℃水浴锅中反应30 min，最后于510 nm波长下测定吸光值A样品。本底对照组用蒸馏水代替水杨酸乙醇溶液，记录吸光值A本底。空白对照组用蒸馏水代替样品溶液，记录吸光值A空白。VC同样作为阳性对照组。计算公式同“1.5.1”项的计算公式。
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所有试验均进行3次平行试验，使用Excel 2010进行数据统计和制图，使用SPSS 22.0软件进行差异显著性分析。
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总皂苷含量随着乙醇浓度的增加呈现出先上升后降低的趋势（图2）。当乙醇浓度提高至80%时，此时牛大力根部总皂苷含量最高，为6.12 mg·g−1。继续增加乙醇浓度，皂苷的溶出率却明显降低。在100%乙醇条件下提取牛大力根部总皂苷的含量最低，为3.58 mg·g−1。综上可知，提取牛大力根部总皂苷的乙醇浓度为80%较为合适。
图 2 不同乙醇浓度对牛大力根部总皂苷提取的影响
Figure 2. The effect of different ethanol concentration on extraction of total saponins from Callerya speciosa roots
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不同超声时间牛大力根部总皂苷的含量见图3。由图3可知，总皂苷含量随着超声时间的增加而增加，但增长趋势并不明显。在超声时间为70 min时牛大力根部总皂苷含量最高，为6.48 mg·g−1；超声时间为30 min时含量最低，为5.98 mg·g−1。选定超声时间为70 min较为合适。
图 3 不同超声时间对牛大力根部总皂苷提取的影响
Figure 3. The effect of different ultrasound time on extraction of total saponins from Callerya speciosa root
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从图4中可知，在料液比为1∶10时，牛大力根部总皂苷含量为最低，为4.24 mg·g−1；而料液比为1∶40时，总皂苷含量最高，为6.52 mg·g−1。因此根据图4结果，选定料液比为1∶40时比较合适。
图 4 不同料液比对牛大力根部总皂苷提取的影响
Figure 4. The effect of different solid-liquid ratio on extraction of total saponins from Callerya speciosa roots
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从图5可以看出，牛大力根部总皂苷含量与提取次数呈现量效关系，提取次数越多，总皂苷的含量就越高。但当提取次数为3～5次时，总皂苷含量增长趋势并不明显，说明牛大力根部的总皂苷成分在提取3次后已接近全部溶出。实际应用中提取3次即可。
图 5 不同超声次数对牛大力根部总皂苷提取的影响
Figure 5. The effect of different extraction times on extraction of total saponins from Callerya speciosa roots
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正交试验结果见表2。根据表2极差结果R值可知，因素的主次顺序为D∶提取次数>C∶乙醇浓度>B∶料液比>A∶提取时间。以总皂苷含量为试验指标时，首先需要考虑超声次数对提取牛大力根部总皂苷的影响，其次是乙醇浓度。超声辅助醇提牛大力根部总皂苷的最佳条件是A2B2C2D3 ，即超声提取时间为40 min，料液比为1∶40，乙醇浓度为80%，提取次数为3次。
表 2 L9（34）正交试验结果
Table 2. L9（34） orthogonal test design table
编号
Code因素 Factor 总皂苷含量
TS content（mg·g−1）A：提取时间
Extracting
time/minB：料液比
Solid-liquid
ratio/（g·mL−1）C：乙醇浓度
Ethanol
concentration/%D：提取次数
Extraction
frequency1 1 1 1 1 5.92 2 1 2 2 2 6.64 3 1 3 3 3 6.22 4 2 1 2 3 6.78 5 2 2 3 1 6.08 6 2 3 1 2 6.32 7 3 1 3 2 6.11 8 3 2 1 3 6.51 9 3 3 2 1 5.98 k1 6.26 6.27 6.25 5.99 k2 6.39 6.41 6.47 6.36 k3 6.20 6.17 6.14 6.50 R 0.19 0.24 0.33 0.51 主次顺序
Priority orderD>C>B>A 最佳组合
Best combinationA2B2C2D3 -
由表3可知，3次验证试验提取得到牛大力根部总皂苷含量分别为7.36、7.18、7.22 mg·g−1，平均含量为7.25 mg·g−1，RSD为1.30%，结果稳定可行。
表 3 最佳提取条件组合实验
Table 3. Combination test of optimal extraction conditions
编号
Code1 2 3 平均值
Mean相对标准偏差
RSD/%总皂苷含量
TS content（mg·g−1）7.36 7.18 7.22 7.25 1.30 -
由图6中可知，4个生长年份的牛大力根部总皂苷含量由高到低依此为6年生、3年生、10年生、15年生。其中6年生的牛大力根部总皂苷含量最高，平均含量为7.83 mg·g−1；15年生的总皂苷含量最低，平均含量为5.33 mg·g−1。由此可推测，在3～6年植株生长期间，牛大力根部总皂苷处于合成累积的阶段，6年后牛大力根部总皂苷含量开始明显下降，可能与根部多糖类物质淀粉的不断聚集有关[24]。对不同生长年份牛大力根部总皂苷含量进行显著性分析时可知，3年生、6年生和15年牛大力根部总皂苷含量均表现出差异显著性（P<0.05）。10年生与3年生、15年生牛大力根部总皂苷含量均未表现出明显差异，仅与6年生牛大力根部总皂苷含量差异显著（P<0.05）。
图 6 不同生长年份牛大力根部总皂苷含量
Figure 6. The total saponins content of Callerya speciosa roots at different ages
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不同生长年份牛大力根部总皂苷的抗氧化能力见图7。从图7中可知，4个生长年份牛大力根部总皂苷对DPPH自由基和羟基自由基均有一定清除活性，且与其质量浓度呈量效关系。在相同质量浓度下，不同生长年份牛大力根部总皂苷对DPPH·的清除率能力由大到小依此为：VC（阳性对照）、3年生、6年生、15年生、10年生。除VC外，3年生牛大力根部总皂苷清除DPPH·的能力最强，IC50值为1.58 mg·mL−1；10年生牛大力根部总皂苷清除DPPH·的能力最弱，IC50值为3.15 mg·mL−1。不同生长年份牛大力根部总皂苷对OH·的清除率能力由大到小依此为：VC、6年生、10年生、3年生、15年生。4个生长年份牛大力中，6年生牛大力根部总皂苷清除OH·的能力最强，IC50值为1.19 mg·mL−1；15年生牛大力根部总皂苷清除OH·的能力最弱，IC50值为2.79 mg·mL−1。在质量浓度达到4 mg·mL−1时，4个生长年份牛大力根部总皂苷对羟基自由基的清除能力相差较小。
图 7 不同生长年份牛大力根部总皂苷对DPPH自由基和OH自由基的清除能力
Figure 7. The scavenging ability of total saponins from Callerya speciosa roots at different ages on DPPH free radicals and OH free radicals
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牛大力作为药食同源的传统南药之一，一直以来备受岭南两广、香港等地区的青睐。有研究表明，牛大力中存在如蛋白质、淀粉、维生素、微量元素等多种对人体有益的营养成分，具有较高的营养价值和保健价值[4]。因此在21世纪之后，商家逐渐将牛大力应用于保健食品的开发利用，研发出多款保健食品，如牛大力酒、速溶茶、饼干等[25]。再加上近些年来人们生活水平有所提高，越来越重视健康养生，牛大力相关产品也日益受到关注。然而，目前市面上牛大力产品仍处于粗加工阶段，深层次地精细加工以及更加合理地开发利用牛大力尚未体现。现代药理研究发现，牛大力具有多种药理作用如增强免疫力、抗氧化、抗炎消炎、降血糖、抗疲劳、降尿酸等，其有效成分主要是黄酮类、多糖类、萜类和生物碱类化合物[17]。其中以牛大力黄酮、多糖类物质的相关研究居多，牛大力总皂苷的相关研究较少。本研究采用超声辅助醇提法优化了牛大力根部总皂苷的提取工艺，同时从不同生长年限出发探索了牛大力根部总皂苷含量和抗氧化活性的差异，可为牛大力总皂苷的后续试验研究提供参考依据。
根据试验结果，牛大力根部总皂苷的最佳提取工艺条件为： 乙醇浓度为80%，料液比为1∶40，提取时间为40 min，提取次数为3次。4个试验因素中，需优先考虑提取次数及乙醇浓度对提取牛大力根部总皂苷的影响。4个生长年份牛大力根部总皂苷含量由高到低依此为：6年生、3年生、10年生、15年生，其中6年生牛大力根部总皂苷含量最高，15年生牛大力根部总皂苷含量最低。随着生长年份的增加，总皂苷含量呈现出先升高后降低的趋势，这一现象与牛大力总皂苷的合成积累机制有关。生长年限的变化，会导致植物体内部分组分出现一定幅度的动态变化，如金刚藤的总黄酮[26]、白鲜的白鲜碱[27]以及桔梗皂苷[28]等皆有文献证实。根据上述结果可知，牛大力根部总皂苷也具有明显的动态变化规律，对其进行加以研究利用，对牛大力的种植、采收以及加工阶段均具有重要指导意义。
抗氧化剂或抗氧化药物的抗氧化能力大小通常用以下方法进行检测，如总还原力法、ABTS法、DPPH法和OH法等[29]，本文采用DPPH法和OH法。抗氧化能力测试发现，不同生长年份牛大力根部总皂苷对两种自由基均有一定清除活性。这一研究结果与莫宏辉等[20]研究结果相似，两者均证明了牛大力的皂苷成分存在抗氧化活性。结合图7和IC50值来看，除对照品Vc外，3年生牛大力根部总皂苷对DPPH自由基的清除效果最佳，6年生牛大力根部总皂苷则对羟基自由基的清除效果最佳。导致这一结果的原因可能是牛大力根部总皂苷中的不同组分对两种自由基的清除效果不一致，有也可能与皂苷粗提物中还含有黄酮化合物有关。有文献表明，牛大力根部总黄酮也具有一定的抗氧化能力[30]。这一猜测有待今后牛大力根部皂苷类成分的分离纯化以及抗氧化机制的进一步研究。
综上可知，不同生长年份牛大力根部总皂苷含量存在一定差异，其中以6年生牛大力根部总皂苷含量最高，15年生总皂苷含量最低。不同生长年份牛大力根部总皂苷均具有一定的抗氧化活性，将其开发成天然抗氧化剂具有可行性。结合总皂苷含量以及抗氧化活性研究结果，考虑到时间以及人工成本、土地利用率的问题，选择3年生或者6年生牛大力进行皂苷方面的开发利用较为合适。这一结论可为牛大力的种植管理与综合利用提供参考价值和研究方向。
The total saponin content and antioxidant activity of Callerya speciosa roots at different ages
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摘要: 为了探究不同生长年份牛大力Callerya speciosa 根部总皂苷含量以及抗氧化活性的差异，为牛大力的综合开发利用提供科学依据，采用超声辅助提取法优化牛大力根部总皂苷提取工艺，再用紫外分光光度计测定4个生长年份（3年生、6年生、10年生、15年生）牛大力根部总皂苷含量，最后用DPPH自由基法和羟基自由基法进行抗氧化活性研究。结果表明：牛大力根部总皂苷超声辅提法的最佳提取条件是乙醇浓度为80%，料液比为1∶40，提取时间为40 min，提取次数为3次。4个生长年份牛大力中，6年生牛大力根部总皂苷含量最高，15年生牛大力根部总皂苷含量最低。牛大力根部总皂苷含量随着生长年份的增长呈现出先升高后下降的趋势。抗氧化活性测试发现，不同生长年份牛大力根部总皂苷均具有一定的体外抗氧化能力。牛大力总皂苷可作为一种潜在的天然抗氧化剂进行开发利用。Abstract: An attempt was made to determine the content of total saponins and antioxidant activity in the roots of Callerya speciosa (Champion ex Bentham) Schot at different ages, and provide reference for their rational development and utilization. The roots of C. speciosa were collected and extracted by using an ultrasonic-assisted extraction method, and the extraction process of total saponins from C. speciosa roots were optimized. Furthermore, the content of total saponins from the extracts of the C. speciosa roots at different ages (3-year-old, 6-year-old, 10-year-old and 15-year-old) was determined by using UV photometer.. The antioxidant activity of total saponins from the C. speciosa roots was determined by using the DPPH free radical method and hydroxyl free radical method. The results showed that the best extraction conditions for total saponins of the C. speciosa roots are 80% ethanol, 1∶ 40 solid-liquid ratio, 40 min ultrasound time, and 3 extraction times. Among the four materials, the 6-year-old C. speciosa roots had the highest total saponin content, while the 15-year-old C. speciosa had the lowest. The total saponin content of the C. speciosa roots tended to increase and then decrease with the ages of C. speciosa. The antioxidant activity test found that total saponins of the C. speciosa roots at different ages all possessed a certain level of antioxidant capacity in vitro, which can be developed and utilized as a potential natural antioxidant.
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Key words:
- Callerya speciosa /
- total saponins /
- age /
- extraction process /
- antioxidant activity
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图 2 不同乙醇浓度对牛大力根部总皂苷提取的影响
Fig. 2 The effect of different ethanol concentration on extraction of total saponins from Callerya speciosa roots
图 3 不同超声时间对牛大力根部总皂苷提取的影响
Fig. 3 The effect of different ultrasound time on extraction of total saponins from Callerya speciosa root
图 4 不同料液比对牛大力根部总皂苷提取的影响
Fig. 4 The effect of different solid-liquid ratio on extraction of total saponins from Callerya speciosa roots
图 5 不同超声次数对牛大力根部总皂苷提取的影响
Fig. 5 The effect of different extraction times on extraction of total saponins from Callerya speciosa roots
图 6 不同生长年份牛大力根部总皂苷含量
注：不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Fig. 6 The total saponins content of Callerya speciosa roots at different ages
Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).
图 7 不同生长年份牛大力根部总皂苷对DPPH自由基和OH自由基的清除能力
Fig. 7 The scavenging ability of total saponins from Callerya speciosa roots at different ages on DPPH free radicals and OH free radicals
表 1 因素水平表
Table 1 Factor level table
水平
Level因素Factor 提取时间
Extract time（A）/min料液比
Solid-liquid ratio（B）/（g·mL−1）乙醇浓度
Ethanol concentration（C）/%提取次数
Number of extractions（D）1 30 1∶30 70 1 2 40 1∶40 80 2 3 50 1∶50 90 3 
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表 2 L9（34）正交试验结果
Table 2 L9（34） orthogonal test design table
编号
Code因素 Factor 总皂苷含量
TS content（mg·g−1）A：提取时间
Extracting
time/minB：料液比
Solid-liquid
ratio/（g·mL−1）C：乙醇浓度
Ethanol
concentration/%D：提取次数
Extraction
frequency1 1 1 1 1 5.92 2 1 2 2 2 6.64 3 1 3 3 3 6.22 4 2 1 2 3 6.78 5 2 2 3 1 6.08 6 2 3 1 2 6.32 7 3 1 3 2 6.11 8 3 2 1 3 6.51 9 3 3 2 1 5.98 k1 6.26 6.27 6.25 5.99 k2 6.39 6.41 6.47 6.36 k3 6.20 6.17 6.14 6.50 R 0.19 0.24 0.33 0.51 主次顺序
Priority orderD>C>B>A 最佳组合
Best combinationA2B2C2D3
下载: 导出CSV
表 3 最佳提取条件组合实验
Table 3 Combination test of optimal extraction conditions
编号
Code1 2 3 平均值
Mean相对标准偏差
RSD/%总皂苷含量
TS content（mg·g−1）7.36 7.18 7.22 7.25 1.30
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