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TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

赵克学 许淑娟 马瑞仙 耿金静 刘杨 李琼毅 冯若飞

赵克学, 许淑娟, 马瑞仙, 耿金静, 刘杨, 李琼毅, 冯若飞. TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 热带生物学报, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
引用本文: 赵克学, 许淑娟, 马瑞仙, 耿金静, 刘杨, 李琼毅, 冯若飞. TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 热带生物学报, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
ZHAO Kexue, XU Shujuan, MA Ruixian, GENG Jinjing, LIU Yang, LI Qiongyi, FENG Ruofei. Establishment of SYBR Green I Real-time PCR for Quantitative Detection of TRIM21 Gene[J]. Journal of Tropical Biology, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
Citation: ZHAO Kexue, XU Shujuan, MA Ruixian, GENG Jinjing, LIU Yang, LI Qiongyi, FENG Ruofei. Establishment of SYBR Green I Real-time PCR for Quantitative Detection of TRIM21 Gene[J]. Journal of Tropical Biology, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017

TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
基金项目: 国家自然科学基金项目(31702234,31460665);中央专项研究生科研创新项目(Yxm2018146);教育部“创新团队发展计划”项目(IRT_17R88);引进人才科研启动项目(xbmuyjrc201627);中央高校项目(31920180123)
详细信息
    第一作者:

    赵克学(1993−),女,西北民族大学2017级硕士研究生. E-mail:2577470084@qq.com

    通信作者:

    李琼毅(1980−),女,博士,副教授. 研究方向:分子病原生物学. E-mail:lqy@xbmu.edu.cn

    冯若飞(1978−),男,博士,副教授. 研究方向:动物疫苗与分子免疫学. E-mail:fengruofei@xbmu.edu.cn

  • 中图分类号: R 446

Establishment of SYBR Green I Real-time PCR for Quantitative Detection of TRIM21 Gene

  • 摘要: 三基序蛋白21(TRIM21)与癌症、肿瘤及固有免疫等密切相关。为了快速检测TRIM21基因的表达,根据Genbank中公布的TRIM21基因序列设计引物,通过常规PCR扩增该基因后克隆至pMD-18T载体上,测序并鉴定正确后制备重组质粒,以pMD-18T-TRIM21重组质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。采用重复性、特异性及灵敏性等试验,成功建立了检测TRIM21基因的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法灵敏度高,最低检测下限为37.7 copies·μL−1,比普通PCR高出10倍。在3次独立的试验中,组内和组间变异系数较小,具有较高的可重复性,同时,还能检出不同细胞中TRIM21的表达。因此,该荧光定量方法可为TRIM21的检测及临床研究提供技术支持。
  • 图  2  TRIM21 SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增曲线(A)及溶解曲线(B)

    1. TRIM21-standard 标准质粒;2. 阴性对照。

    Fig.  2  TRIM21 SYBR GreenI real-time PCR amplification curve (A) and dissolution curve (B)

    1. TRIM21-standardplasmid; 2. Negative control.

    图  3  TRIM21 SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增曲线(A)、溶解曲线(B)及标准曲线(C)

    1~5:3.77×107~3.77×103 copies·µL−1

    Fig.  3  TRIM21 SYBR Green I real-time PCR amplification curve (A), dissolution curve (B) and standard curve (C)

    1−5: 3.77×107−3.77×103 copies·µL−1.

    图  4  TRIM21实时荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)灵敏性试验

    1~8:3.77×108,3.77×107,3.77×106,3.77×105,3.77×104,3.77×103,3.77×102,3.77×101拷贝·µL−1;9:阴性对照;M:100 bp DNA Marker。

    Fig.  4  TRIM21 real-time PCR (A) and routine PCR (B) sensitivity test

    1−8: 3.77×108, 3.77×107, 3.77×106, 3.77×105, 3.77×104, 3.77×103, 3.77×102, 3.77×101copies·µL−1; 9: Negative control; M: 100 bp DNA Marker.

    图  5  TRIM21实时荧光定量PCR特异性试验

    1:pMD-18T-TRIM21;2:pMD-18T-TRIM13;3:pMD-18T-IFITM1;4:pMD-18T-Viperin。

    Fig.  5  TRIM21 real-time PCR specificity test

    表  1  引物序列

    Table  1  Sequence of primers

    引物名称 Primer引物序列 Primer sequence 5′-3′扩增长度 Length/bp
    Universal primer TRIM21-F 5′-GGAATTCATGGCTTCAGCAGCACGCTTGACAATGAT-3′ 1 428
    TRIM21-R 5′-GCTCTAGATCAATAGTCAGTGGATCCTTGTGATCCAATA-3′
    SYBR Green ⅠPCR Primer TRIM21-qF 5′- CAGCAGCACGCTTGACAATGATG-3′ 80
    TRIM21-qR 5′-GATGCTCACAGGCTCCACGAAG-3′
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    表  2  SYBR Green I 实时荧光定量PCR重复性试验

    Table  2  SYBR Green I real-time PCR repeatability test

    质粒浓度/
    (copies·µL−1
    Plasmids
    重复次数
    Repetitions
    组内重复(Intra-assay repetition)组间重复(Inter-assay repetition)
    Mean CtSDCV/%Mean CtSDCV/%
    3.77×10−7 3 17.442 0.044 0.252 17.548 0.075 0.427
    3.77×10−6 3 21.450 0.027 0.125 21.406 0.055 0.257
    3.77×10−5 3 24.723 0.020 0.080 24.656 0.097 0.393
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    表  3  SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测不同种属细胞中的TRIM21基因

    Table  3  Detection of TRIM21gene in different cells by using SYBR Green I real-time PCR

    细胞名称
    Cell name
    Ct
    Ct value
    拷贝数
    Copy number/(copies·µL−1
    PK15 35.34 63.99
    HepG2 26.72 1.80×104
    C2C12 31.15 9.88×102
    BHK21 34.97 81.57
    ISBR-2 36.50 29.93
    Hela 24.99 5.58×104
    HEK293 26.58 1.96×104
    Huh7 27.32 1.22×104
    PANC-1 25.87 3.13×104
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-09-12
  • 修回日期:  2019-10-28
  • 网络出版日期:  2020-07-03
  • 刊出日期:  2019-11-01

TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
    基金项目:  国家自然科学基金项目(31702234,31460665);中央专项研究生科研创新项目(Yxm2018146);教育部“创新团队发展计划”项目(IRT_17R88);引进人才科研启动项目(xbmuyjrc201627);中央高校项目(31920180123)
    作者简介:

    赵克学(1993−),女,西北民族大学2017级硕士研究生. E-mail:2577470084@qq.com

    通讯作者: 李琼毅(1980−),女,博士,副教授. 研究方向:分子病原生物学. E-mail:lqy@xbmu.edu.cn冯若飞(1978−),男,博士,副教授. 研究方向:动物疫苗与分子免疫学. E-mail:fengruofei@xbmu.edu.cn
  • 中图分类号: R 446

摘要: 三基序蛋白21(TRIM21)与癌症、肿瘤及固有免疫等密切相关。为了快速检测TRIM21基因的表达,根据Genbank中公布的TRIM21基因序列设计引物,通过常规PCR扩增该基因后克隆至pMD-18T载体上,测序并鉴定正确后制备重组质粒,以pMD-18T-TRIM21重组质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。采用重复性、特异性及灵敏性等试验,成功建立了检测TRIM21基因的荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法灵敏度高,最低检测下限为37.7 copies·μL−1,比普通PCR高出10倍。在3次独立的试验中,组内和组间变异系数较小,具有较高的可重复性,同时,还能检出不同细胞中TRIM21的表达。因此,该荧光定量方法可为TRIM21的检测及临床研究提供技术支持。

English Abstract

赵克学, 许淑娟, 马瑞仙, 耿金静, 刘杨, 李琼毅, 冯若飞. TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 热带生物学报, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
引用本文: 赵克学, 许淑娟, 马瑞仙, 耿金静, 刘杨, 李琼毅, 冯若飞. TRIM21基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 热带生物学报, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
ZHAO Kexue, XU Shujuan, MA Ruixian, GENG Jinjing, LIU Yang, LI Qiongyi, FENG Ruofei. Establishment of SYBR Green I Real-time PCR for Quantitative Detection of TRIM21 Gene[J]. Journal of Tropical Biology, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
Citation: ZHAO Kexue, XU Shujuan, MA Ruixian, GENG Jinjing, LIU Yang, LI Qiongyi, FENG Ruofei. Establishment of SYBR Green I Real-time PCR for Quantitative Detection of TRIM21 Gene[J]. Journal of Tropical Biology, 2020, 11(1): 111-117. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.017
  • 三基序蛋白21(Tripartite motif-containing protein 21, TRIM21)又称Ro52或SS-A,广泛表达于各种细胞中[1]。TRIM21属于TRIM大家族的一员,它由N端的RING结构域、B-box结构域以及卷曲螺旋结构域(Coiled-coil)组成,其中,卷曲螺旋结构域构成了N端尾部。此外,它还有1个可变的C末端,所以TRIM家族也被称为RBCC家族[2-4]。TRIM 家族最显著的结构特征是RBCC结构域在顺序和空间上的高度保守性。目前发现TRIM超家族共有80多个成员,主要在细胞质及细胞核中表达,它参与细胞增殖、分化、凋亡以及细胞信号转导等多种生物学过程[5-6]。研究表明,E3泛素连接酶TRIM21与人类疾病密切相关,如TRIM21对血管内皮功能紊乱和急性肺损伤具有重要的作用,在一定程度上TRIM21减轻了肺部炎症的复发[7]。此外,在患有系统性红斑狼疮的外周血单核细胞中TRIM21的表达量明显升高,因此,TRIM21还与系统性红斑狼具有相关性[8]。除了与人类疾病的关系之外,TRIM21还参与固有免疫相关的生物学过程,具有抗病毒功能,尤其抑制逆转录病毒的复制增殖[9]。可见,TRIM21基因mRNA表达的定量检测是研究者深入挖掘TRIM21功能的基础。因此,本研究通过TRIM21基因序列设计引物,常规PCR扩增后将其与pMD-18T载体连接,以该重组质粒为模板,建立了SYBR Green ⅠPCR检测方法,为更深入研究TRIM21在疾病及病毒增殖中的功能提供技术支持。

    • 本实验所用人胚肾细胞(HEK293)、人宫颈癌细胞(Hela)、金仓鼠肾细胞(BHK-21)、小鼠成肌细胞(C2C12)、猪肾细胞(PK15和IBRS-2)、人胰腺癌细胞(PANC-1)、人肝癌细胞(Huh7和PANC-1)等均由西北民族大学生物工程与技术重点实验室保存及提供。细胞培养基为10% FBS DMEM,所有细胞均在37 ℃,5%CO2培养箱中进行培养。

    • 胰蛋白酶、新生牛血清和DMEM培养基购自兰州民海生物工程有限公司;细胞总RNA提取试剂盒RNAiso plus、LA-Taq聚合酶、M-MLV反转录酶、pMD-18T vector,EcoR I,Xba I购自TaKaRa有限公司;随机引物、DEPC水购自上海生工;质粒小提试剂盒及胶回收试剂盒购自全式金有限公司;SYBR Green购自美国ABI有限公司;大肠杆菌感受态细胞BL21,pcDNA3.1,pMD-18T-TRIM13,pMD-18T-IFITM1,pMD-18T-Vipron载体均由西北民族大学生物工程与技术重点实验室提供。

    • 根据Genbank上公布的TRIM21基因序列(GenBank号:BC010861.1),运用Primer3.0设计1对常规引物(即TRIM21-F,TRIM21-R),在TRIM21的上游和下游分别加入限制性酶切位点,EcoRI和Xba I,该引物预扩增片段长度为1 428 bp。同时,在不同种属保守区域设计了1对荧光定量的引物 (即TRIM21-qF和TRIM21-qR),引物由上海生工合成(表1)。

      表 1  引物序列

      Table 1.  Sequence of primers

      引物名称 Primer引物序列 Primer sequence 5′-3′扩增长度 Length/bp
      Universal primer TRIM21-F 5′-GGAATTCATGGCTTCAGCAGCACGCTTGACAATGAT-3′ 1 428
      TRIM21-R 5′-GCTCTAGATCAATAGTCAGTGGATCCTTGTGATCCAATA-3′
      SYBR Green ⅠPCR Primer TRIM21-qF 5′- CAGCAGCACGCTTGACAATGATG-3′ 80
      TRIM21-qR 5′-GATGCTCACAGGCTCCACGAAG-3′
    • 根据RNAiso Plus 试剂盒说明书提取Hela细胞中的RNA,反转录获得cDNA。反转录采用两步法进行,以得到的cDNA为模板扩增TRIM21基因。PCR反应体系为:TRIM21-F/R各1 µL(20 µmol·L−1),10×LA PCR buffer(含Mg2+)5 µL,dNTP(10 mmol·L−1) 8 µL,LA TaqDNA聚合酶0.5 µL,cDNA5 µL,DEPC水29.5 µL,总体系50 µL。反应条件:95 ℃变性5 min;55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共35个循环。将获得的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

      PCR产物回收后连接至克隆载体pMD-18T。将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞BL21中,37 ℃,220 r·min−1摇1 h后将其均匀涂布于含氨苄青霉素的固体平板上,在37 ℃培养箱培养10 h左右,随机挑取单个菌斑扩增,菌液PCR验证阳性菌液送西安擎科生物测序部进行测序鉴定,将该重组质粒标准品命名为TRIM21-Standard。

    • 通过应用SYBR Green 染料法,以构建好的TRIM21-Standard为模板,用荧光定量引物TRIM21qF/qR在ABI PCR仪上进行扩增反应及分析。以出现荧光的Ct值最小,荧光阈值最高且溶解曲线为单峰,即没有非特异性扩增产物作为标准,对引物浓度及温度等条件进行优化。

    • 以优化好的条件建立标准曲线确保检测方法能检测到最小拷贝数。测定TRIM21-Standard的浓度,用DEPC水进行10倍倍比稀释,分别以3.77×107,3.77×106,3.77×105,3.77×104,3.77×103 copies·µL−1 5个梯度作为模板,进行荧光定量PCR反应。反应结束后,用ABI PCR扩增仪软件自行计算并建立标准曲线。

    • 选择本实验室已构建的pMD-18T-TRIM13,pMD-18T-IFITM1,pMD-18T-Vipron和TRIM21-Standard以105拷贝数作为模板,进行荧光定量PCR反应,验证其特异性。

    • 将TRIM21-Standard标准品进行倍比稀释,共稀释8个浓度梯度,即3.77×108~3.77×101 copies·µL−1,然后进行qPCR和普通PCR反应,检测2种方法能检测到的最低拷贝数,进而比较2种方法的灵敏性。

    • 选取3.77×107,3.77×106,3.77×105 copies·µL−1的TRIM21-Standard作为模板,每个拷贝数做3个重复孔,分别做3次独立的试验,然后对组内和组间的重复性进行评价。

    • 选几种人源、猪源及鼠源等的9种细胞,提取RNA后进行定量反转录,然后利用建立的荧光定量PCR方法检测细胞中TRIM21的mRNA表达水平,明确该方法在细胞间的通用性和可靠性。

    • 提取Hela细胞RNA后测定浓度,细胞的OD260/280的比值在1.8~2.0之间,说明提取的RNA纯度较高。通过PCR扩增细胞中的TRIM21后,用1%核酸胶进行检测,目的大小符合预期,约1 428 bp,即PCR扩增成功(图1A)。回收该目的条带后连接pMD-18T克隆载体并双酶切及测序验证(图1B)。将验证合适的质粒命名为TRIM21-Standard,测定浓度并计算拷贝数。

      图  1  TRIM21基因的扩增(A)及双酶切验证(B)

      Figure 1.  Amplification of TRIM21 gene (A) and double digestion validation (B)

    • 最终优选的SYBR Green荧光定量PCR的最佳反应体系为:SYBR® Select Master Mix 10 µL,无菌DEPC水6 µL,TRIM21-qF/qR(10 µmol·L−1)各1 µL,模板2 µL,即总体系为20 µL。反应条件为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 34 s,共40个循环。在该条件下得到PCR扩增曲线及有单一峰的溶解曲线(图2),说明在该条件下,TRIM21荧光定量引物在扩增时无非特异性产物及引物二聚体的产生。

      图  2  TRIM21 SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增曲线(A)及溶解曲线(B)

      Figure 2.  TRIM21 SYBR GreenI real-time PCR amplification curve (A) and dissolution curve (B)

    • 取TRIM21-Standard质粒标准品,浓度为590 ng·µL−1,用拷贝数计算公式:拷贝数(copies·µL−1)=[6.02×1023×(质粒浓度ng·µL−1×10−9)]/DNA length×660得出该标准品拷贝数约为3.77×1011copies·µL−1,以3.77×107,3.77×106,3.77×105,3.77×104,3.77×103稀释度为模板进行荧光定量PCR,得到标准曲线方程为Y=−3.522logX+41.703,相关系数R2为0.999,扩增效率(Eff)为92.289%,满足R2>0.99。且质粒标准品与Ct值之间具有良好的线性关系(图3),在该条件下溶解曲线无非特异性扩增及引物二聚体出现,说明标准曲线建立成功。

      图  3  TRIM21 SYBR Green I 实时荧光定量PCR扩增曲线(A)、溶解曲线(B)及标准曲线(C)

      Figure 3.  TRIM21 SYBR Green I real-time PCR amplification curve (A), dissolution curve (B) and standard curve (C)

    • 取从101~108稀释的TRIM21-Standard标准质粒,每个稀释度3个重复,然后进行荧光定量和普通PCR反应,结果表明(图4),荧光定量PCR检测到的最小质粒拷贝数为3.77×101 copies·µL−1,而普通PCR的检测下限为3.77×102 copies·µL−1,因此,建立的SYBR Green I 荧光定量的方法灵敏性较高,比普通PCR高出10倍。

      图  4  TRIM21实时荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)灵敏性试验

      Figure 4.  TRIM21 real-time PCR (A) and routine PCR (B) sensitivity test

    • 选实验室已构建好的几种质粒进行特异性验证,分别以pMD-18T-TRIM21,pMD-18T-TRIM13,pMD-18T-IFITM1,pMD-18T-Vipron为模板,通过本试验建立的TRIM21 SYBR Green I 荧光定量PCR扩增的方法,检测这几种重组质粒的表达情况。从图5可知,只有pMD-18T-TRIM21出现特异性扩增、其他基因都没有扩增,说明本实验建立的方法具有良好的特异性。

      图  5  TRIM21实时荧光定量PCR特异性试验

      Figure 5.  TRIM21 real-time PCR specificity test

    • 以107,106,105 copies·µL−13个稀释度分别为模板,进行重复性验证,然后通过Ct值分析组内和组间的差异。结果表明(表2),组内、组间变异系数分别为0.08%~0.252%,0.257%~0.427%,即组内和组间拷贝数的变异系数都<5%,说明本实验建立的方法重复性好,具有较高的稳定性。

      表 2  SYBR Green I 实时荧光定量PCR重复性试验

      Table 2.  SYBR Green I real-time PCR repeatability test

      质粒浓度/
      (copies·µL−1
      Plasmids
      重复次数
      Repetitions
      组内重复(Intra-assay repetition)组间重复(Inter-assay repetition)
      Mean CtSDCV/%Mean CtSDCV/%
      3.77×10−7 3 17.442 0.044 0.252 17.548 0.075 0.427
      3.77×10−6 3 21.450 0.027 0.125 21.406 0.055 0.257
      3.77×10−5 3 24.723 0.020 0.080 24.656 0.097 0.393
    • 使用已建立的TRIM21 SYBR Green I 荧光定量PCR方法,检测人源、鼠源和猪源等9种细胞中TRIM21的表达。结果显示(表3),该方法能检测出不同种属细胞中TRIM21基因的表达,各个细胞中TRIM21的表达量有所差异,在Hela细胞中TRIM21的表达量较高,在ISBR-2细胞中比较低。因此,本实验建立的方法具有种属通用性和稳定性,可以用来检测不同细胞中TRIM21基因。

      表 3  SYBR Green I 实时荧光定量PCR检测不同种属细胞中的TRIM21基因

      Table 3.  Detection of TRIM21gene in different cells by using SYBR Green I real-time PCR

      细胞名称
      Cell name
      Ct
      Ct value
      拷贝数
      Copy number/(copies·µL−1
      PK15 35.34 63.99
      HepG2 26.72 1.80×104
      C2C12 31.15 9.88×102
      BHK21 34.97 81.57
      ISBR-2 36.50 29.93
      Hela 24.99 5.58×104
      HEK293 26.58 1.96×104
      Huh7 27.32 1.22×104
      PANC-1 25.87 3.13×104
    • 近年来,研究发现TRIM家族蛋白具有多种生物学功能,包括转录调控、细胞分化、凋亡和肿瘤发生等多种细胞过程[9]。起初,TRIM21主要集中在自身免疫性疾病的研究中,被认为TRIM21是导致干燥综合征和系统性红斑狼疮的自身抗原[10]。随着对TRIM21蛋白的深入研究,发现TRIM21与人类疾病如癌症、肿瘤等密切相关。JUDITH M等人研究发现,TRIM21与LFG具有一定的相互作用,LFG作为跨膜蛋白保护神经细胞抑制Fas诱导的凋亡,而TRIM21对LFG进行负调节,促进肿瘤细胞的凋亡[11]。在一项淋巴瘤的研究中发现,TRIM21在淋巴瘤组织中的表达比正常组织中的要少[12]。说明TRIM21在人类疾病中扮演着重要的作用。但是,TRIM21在不同组织中的表达及机制的研究还存在一定的局限,因此,本实验建立了一种SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可为TRIM21的研究提供一定的参考和技术支持。

      目前,常规PCR、荧光定量PCR,Northern blot及基因芯片是检测基因mRNA的主要方法[13-16]。荧光定量PCR作为分子生物学研究中定量检测的经典方法,被广泛应用于兽医学、医学、病理学等各个领域中[17]。笔者以TRIM21为研究对象,建立一种快速检测的方法。经过条件的优化,该方法扩增的溶解曲线为单峰,且Tm值比较平均,避免了非特异性的扩增。另外,此方法灵敏度较高,最低检测拷贝数达到了37.7 copies·µL−1。建立的标准曲线方程R2的值为0.999,扩增效率较高,进而通过检测不同样品的Ct值推算出基因的拷贝数。本实验建立的TRIM21 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法简单、敏感性高、具有可重复性、检测结果准确,可用于TRIM21基因表达的检测。

参考文献 (17)

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