留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

α−芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性

李浩楠 杨奕帅 长孙东亭 朱晓鹏 罗素兰

李浩楠,杨奕帅,长孙东亭,等. α−芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性[J]. 热带生物学报,2023, 14(1):1−7. DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
引用本文: 李浩楠,杨奕帅,长孙东亭,等. α−芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性[J]. 热带生物学报,2023, 14(1):1−7. DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
LI Haonan, YANG Yishuai, ZHANG SUN Dongting, ZHU Xiaopeng, LUO Sulan. Synthesis of new analogs of α-conotoxin LvIA mutated at the position 11 residue and their target activity[J]. Journal of Tropical Biology, 2023, 14(1): 1-7. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
Citation: LI Haonan, YANG Yishuai, ZHANG SUN Dongting, ZHU Xiaopeng, LUO Sulan. Synthesis of new analogs of α-conotoxin LvIA mutated at the position 11 residue and their target activity[J]. Journal of Tropical Biology, 2023, 14(1): 1-7. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004

α−芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
基金项目: 三亚市科技计划项目(2021GXYL42);国家自然科学基金项目(81872794)
详细信息
    第一作者:

    李浩楠(1995−),女,临床药师. 研究方向:药学. E-mail:370217142@qq.com

    通信作者:

    罗素兰(1969−),女,教授,博士生导师. 研究方向:海洋药物. E-mail:luosulan2003@163.com

  • 中图分类号: R 969.3

Synthesis of new analogs of α-conotoxin LvIA mutated at the position 11 residue and their target activity

  • 摘要: 为了进一步探究第11位氨基酸的性质对LvIA靶点结合活性的影响,设计了LvIA的2个新型突变体[D11R]LvIA和[D11H]LvIA,即用2个碱性氨基酸−精氨酸(R)和组氨酸(H)分别替换原来的酸性氨基酸D。先人工合成了这2个新突变体的线性肽,然后采用2步氧化法进行折叠,以获得在第1位和第3位半胱氨酸(Cys 1~3)、第2位和第4位半胱氨酸(Cys 2~4)之间定点连接形成二硫键。经高效液相色谱分离纯化和质谱鉴定,合成了含有Cys(1~3, 2~4)二硫键连接方式的多肽,其分子质量正确,纯度在95%以上。利用双电极电压钳电生理学技术对这2种突变体与α3β2 nAChR的结合活性进行了检测。结果发现,当该位点的氨基酸性质由酸性转换为碱性后,对LvIA的活性影响巨大,直接导致对α3β2 nAChR的阻断活性丧失。[D11R]LvIA和[D11H]LvIA的活性与野生型LvIA相比分别降低了574.38%和408.62%。由此表明,第11位氨基酸的酸碱性对LvIA的活性至关重要。
  • 图  2  α3β2 nAChR模型的建立

    A.α3和β2 包含2种亚基的质粒琼脂糖凝胶电泳图;B.α3和β2 包含2种亚基的质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图;C.α3和β2 2种亚基的cRNA琼脂糖凝胶电泳图;D.非洲爪蟾卵母细胞;E.ACh激动下 α3β2 nAChR 电流轨迹图。

    图  3  LvIA及突变体对于α3β2 nAChR的电流轨迹图

    图  4  LvIA及其突变体对于α3β2 nAChR的浓度反应曲线

    表  1  LvIA 及11位突变体在α3β2 nAChR上的IC50

    多肽α3β2 nAChR参考文献
    IC50 /(nmol·L−1)
    (95% C.I.)
    Hill Slope
    (95% C.I.)
    LvIA15.6 (12.8~19.1)0.71(0.59~0.85)[23]
    [D11A]LvIA12 (9.7~14.8)0.84(0.59~0.96)[23]
    [D11R]LvIA8 976 (414~1050)0.47(0.34~0.78)本研究
    [D11H]LvIA6 390 (2 961~13 820)0.60(0.48~0.79)本研究
     注:置信区间95%。
    下载: 导出CSV
  • [1] BRUNZELL D H, BOSCHEN K E, HENDRICK E S, et al. Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic acetylcholine receptors in the nucleus accumbens shell regulate progressive ratio responding maintained by nicotine [J]. Neuropsychopharmacology, 2010, 35(3): 665 − 673. doi:  10.1038/npp.2009.171
    [2] PRASHANTH J R. , HASABALLAH N, VETTER I. Pharmacological screening technologies for venom peptide discovery [J]. Neuropharmacology, 2017, 127: 4 − 19. doi:  10.1016/j.neuropharm.2017.03.038
    [3] ALBUQUERQUE E X, PEREIRA E, ALKONDON M, et al. Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function [J]. Physiological Reviews, 2009, 89(1): 73 − 120. doi:  10.1152/physrev.00015.2008
    [4] SALMINEN O, DRAPEAU J A, MCINTOSH J M, et al. Pharmacology of α-conotoxin MII-sensitive subtypes of nicotinic acetylcholine receptors isolated by breeding of null mutant mice [J]. Molecular Pharmacology, 2007, 71(6): 1563 − 1571. doi:  10.1124/mol.106.031492
    [5] LUO S L, ZHU X P, WU Y, et al. Conotoxins and drug discovery with special reference to Hainan species [J]. Toxins and Drug Discovery, 2017(1): 149 − 187.
    [6] ZHANGSUN D T, ZHU X, WU Y, et al. Key residues in the nicotinic acetylcholine receptor β2 subunit contribute to α-Conotoxin LvIA binding [J]. Journal of Biological Chemistry, 2015, 290(15): 9855 − 9862. doi:  10.1074/jbc.M114.632646
    [7] LUO S L, ZHANGSUN D T, SCHROEDER C I, et al. A novel α4/7‐conotoxin LvIA from Conus lividus that selectively blocks α3β2 vs. α6/α3β2β3 nicotinic acetylcholine receptors [J]. The FASEB Journal, 2014, 28(4): 1842 − 1853. doi:  10.1096/fj.13-244103
    [8] LIN B, BING H, ZHANGSUN D T, et al. Efficient expression of acetylcholine-binding protein from Aplysia californica in Bac-to-Bac system [J]. Biotechnology Bulletin, 2014, 19(10): 1183 − 1193(11).
    [9] BORDIA T, MCGREGOR M, MCINTOSH J M, et al. Evidence for a role for α6∗ nAChR in l-dopa-induced dyskinesias using parkinsonian α6∗ nAChR gain-of-function mice [J]. Neuroscience, 2015, 295: 187 − 197. doi:  10.1016/j.neuroscience.2015.03.040
    [10] AKONDI K B, MUTTENTHALER M, DUTERTRE S, et al. Discovery, synthesis, and structure–activity relationships of conotoxins [J]. Chemical Reviews, 2014, 114(11): 5815 − 5847. doi:  10.1021/cr400401e
    [11] CHANGEUX J P. The Nicotinic acetylcholine receptor: The founding father of the pentameric ligand-gated ion channel superfamily [J]. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(48): 40207 − 40215. doi:  10.1074/jbc.R112.407668
    [12] JENSEN A A, FROELUND B, LILJEFORS T, et al. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors: Structural revelations, target identifications, and therapeutic inspirations [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48(15): 4705 − 4745. doi:  10.1021/jm040219e
    [13] LIU C, WU P X, ZHU H, et al. Rationally designed α-Conotoxin analogues maintained analgesia activity and weakened side effects [J]. Molecules, 2019, 24(2): 337. doi:  10.3390/molecules24020337
    [14] MCINTOSH J M. DOWELL C, WATKINS M, et al. Alpha-conotoxin GIC from Conus geographus, a novel peptide antagonist of nicotinic acetylcholine receptors [J]. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(37): 33610 − 33615. doi:  10.1074/jbc.M205102200
    [15] CUNY H, YU R, TAE H S, et al. α-Conotoxins active at α3-containing nicotinic acetylcholine receptors and their molecular determinants for selective inhibition [J]. British Journal of Pharmacology, 2018, 175(11): 1855 − 1868. doi:  10.1111/bph.13852
    [16] KALAMIDA D, POULAS K, AVRAMOPOULOU V, et al. Muscle and neuronal nicotinic acetylcholine receptors structure, function and pathogenicity [J]. FEBS Journal, 2007, 273: 3799 − 3845.
    [17] DONG X, HUANG W, BIAN Y, et al. Remediation and mechanisms of cadmium biosorption by a cadmium-binding protein from Lentinula edodes [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(41): 11373 − 11379. doi:  10.1021/acs.jafc.9b04741
    [18] DRENAN R M, MACKEY E, GRADY S R, et al. α6* nAChR expression and function in brain areas influencing DA transmission probed with α6-GFP transgenic mice [J]. Biochemical Pharmacology, 2011, 82(8): 1035 − 1036.
    [19] DUTERTRE S, NICKE A, TSETLIN V I. Nicotinic acetylcholine receptor inhibitors derived from snake and snail venoms [J]. Neuropharmacology, 2017, 127: 196 − 223. doi:  10.1016/j.neuropharm.2017.06.011
    [20] DUTTON J L, BANSAL P S, HOGG R C, et al. A new level of conotoxin diversity, a non-native disulfide bond connectivity in alpha-conotoxin AuIB reduces structural definition but increases biological activity [J]. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(50): 48849 − 48857. doi:  10.1074/jbc.M208842200
    [21] LEBBE E K M, STEVE P, WIJESEKARA I, et al. Conotoxins targeting nicotinic acetylcholine receptors: An overview [J]. Marine Drugs, 2014(12): 2970 − 3004.
    [22] ELLISON M, FENG Z P, PARK A J, et al. α-RgIA, a novel conotoxin that blocks the α9α10 nAChR: Structure and identification of key receptor-binding residues [J]. Journal of Molecular Biology, 2008, 377(4): 1216 − 1227. doi:  10.1016/j.jmb.2008.01.082
    [23] ZHU X, PAN S, XU M, et al. High selectivity of an α-conotoxin LvIA analogue for α3β2 nicotinic acetylcholine receptors is mediated by β2 functionally important residues [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63(22): 13656 − 13668. doi:  10.1021/acs.jmedchem.0c00975
    [24] LÓPEZ-VERA E, JACOBSEN R B, ELLISON M, et al. A novel alpha conotoxin (α-PIB) isolated from C. purpurascens is selective for skeletal muscle nicotinic acetylcholine receptors [J]. Toxicon, 2007, 49(8): 1193 − 1199. doi:  10.1016/j.toxicon.2007.02.007
    [25] FANG G M, CHEN X X, YANG Q Q, et al. Discovery, structure, and chemical synthesis of disulfide-rich peptide toxins and their analogs [J]. Chinese Chemical Letters, 2018, 29(7): 1033 − 1042. doi:  10.1016/j.cclet.2018.02.002
    [26] GAO F, CHEN D, MA X, et al. Alpha6-containing nicotinic acetylcholine receptor is a highly sensitive target of alcohol [J]. Neuropharmacology, 2019, 149: 45 − 54. doi:  10.1016/j.neuropharm.2019.01.021
    [27] JULIEN G, SEBASTIEN D. alpha-conotoxins to explore the molecular, physiological and pathophysiological functions of neuronal nicotinic acetylcholine receptors [J]. Neuroscience Letters, 2018, 679: 24 − 34. doi:  10.1016/j.neulet.2017.11.063
  • [1] 刘子岭, 石耀华, 郑兴, 顾志峰.  不同养殖密度对方斑东风螺循环水中间培育效果的影响 . 热带生物学报, 2023, 14(6): 675-680. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230058
    [2] 金柳, 李萌晗, 郑育声, 李东栋.  油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶EgFATA基因的克隆与功能分析 . 热带生物学报, 2023, 14(4): 357-363. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.04.002
    [3] 黄晓欣, 谈嘉莉, 杨永星, 顾哲铭, 李雪珽, 雷晓凌.  耐热真菌HS1-1的生理特性和抗菌活性 . 热带生物学报, 2023, 14(5): 552-559. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20220047
    [4] 林德鑫, 衣雪松.  FeCl3改性活性炭的制备、表征与吸附性能研究 . 热带生物学报, 2023, 14(4): 371-378. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.04.004
    [5] 张亚杰, 陈升孛, 杨静, 张明洁, 张京红.  琼中绿橙气候品质认证技术研究 . 热带生物学报, 2022, 13(4): 391-396. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.04.010
    [6] 云莉, 倪雅丽.  茴香醛对变异链球菌的抗菌活性和抗生物被膜活性 . 热带生物学报, 2022, 13(6): 614-621. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.06.011
    [7] 袁新生, 赵炎, 唐瑞杰, 胡天怡, 朱启林, 汤水荣, 伍延正, 孟磊.  生物炭及与秸秆联用对我国热带地区稻田土壤CH4和N2O的影响 . 热带生物学报, 2022, 13(3): 300-308. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.03.014
    [8] 宋波, 董豪, 全飞, 符庆茂, 杨川, 杨思琪, 谭正洪, 吴志祥.  橡胶树干CO2释放速率垂直变化及其与树干液流和木质部结构间的关系 . 热带生物学报, 2022, 13(1): 1-6. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.01.001
    [9] 杨杰, 蔡泽坪, 吴繁花, 罗佳佳, 肖娴, 于旭东.  乔木矮化技术的研究进展 . 热带生物学报, 2022, 13(6): 644-650. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.06.015
    [10] 张悦, 陈燕丽, 黄滢, 许文龙, 陶艳成, 刘文爱.  防城港 2 种红树林虫害与气象条件的关系 . 热带生物学报, 2022, 13(6): 634-643. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.06.014
    [11] 雷健, 吴远航, 赵兴坤, 蒋凌雁, 刘攀道, 罗丽娟.  炭疽菌侵染对柱花草叶片生理生化的影响 . 热带生物学报, 2021, 12(3): 305-311. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.03.005
    [12] 徐航, 刘贤青, 袁弘伦, 罗杰.  槟榔碱合成前体物质的空间分布及槟榔碱合成通路解析 . 热带生物学报, 2021, 12(3): 271-278. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.03.001
    [13] 李旭扬, 陈舒苗, 于津鹏, 罗素兰, 长孙东亭.  α6/α3β4烟碱型乙酰胆碱受体β4亚基双点突变体的制备及其功能研究 . 热带生物学报, 2021, 12(4): 403-411. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.04.001
    [14] 陈明洋, 卓小垒, 代佳妮, 于靖, 戚华沙, 吴友根.  产地和果形对槟榔主要活性成分及抗氧化活性的影响 . 热带生物学报, 2020, 11(1): 31-41. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.01.006
    [15] 胡娴, 刘贝宁, 唐凌菲, 宋思涵, 刘建福, 杜建新.  陨石水对豌豆种子萌发和幼苗生理特性的影响 . 热带生物学报, 2020, 11(3): 1-7.
    [16] 肖珂, 周双清, 许云, 吴文嫱, 夏薇, 张荣萍, 黄东益, 黄小龙.  海绵共附生放线菌的分离鉴定与抑菌活性分析 . 热带生物学报, 2020, 11(2): 156-162. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.005
    [17] 宋娜, 张刘宁颖, 曹敏, 郭文雅, 洪雨慧, 吴金山, 陈银华, 于晓惠.  木薯ERF转录因子调控的靶基因筛选与表达分析 . 热带生物学报, 2020, 11(2): 177-189. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.008
    [18] 陈婉姨, 李新佳, 罗素兰, 长孙东亭.  信号芋螺基因组DNA提取方法的优化 . 热带生物学报, 2020, 11(2): 238-244, 250. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.00.015
    [19] 熊洋, 朱晓鹏, 吴勇, 长孙东亭, 罗素兰.  α6/α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达 . 热带生物学报, 2020, 11(4): 391-398. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.04.001
    [20] 李丞, 张雨, 罗安, 鞠双, 符影, 罗素兰.  芋螺毒素Lv68的一步氧化及其对乙酰胆碱受体的阻断活性 . 热带生物学报, 2020, 11(2): 125-131. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.001
  • 加载中
图(4) / 表 (1)
计量
  • 文章访问数:  488
  • HTML全文浏览量:  127
  • PDF下载量:  22
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2022-06-02
  • 录用日期:  2022-03-25
  • 修回日期:  2022-06-28
  • 网络出版日期:  2022-04-08
  • 刊出日期:  2023-01-25

α−芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
    基金项目:  三亚市科技计划项目(2021GXYL42);国家自然科学基金项目(81872794)
    作者简介:

    李浩楠(1995−),女,临床药师. 研究方向:药学. E-mail:370217142@qq.com

    通讯作者: 罗素兰(1969−),女,教授,博士生导师. 研究方向:海洋药物. E-mail:luosulan2003@163.com
  • 中图分类号: R 969.3

摘要: 为了进一步探究第11位氨基酸的性质对LvIA靶点结合活性的影响,设计了LvIA的2个新型突变体[D11R]LvIA和[D11H]LvIA,即用2个碱性氨基酸−精氨酸(R)和组氨酸(H)分别替换原来的酸性氨基酸D。先人工合成了这2个新突变体的线性肽,然后采用2步氧化法进行折叠,以获得在第1位和第3位半胱氨酸(Cys 1~3)、第2位和第4位半胱氨酸(Cys 2~4)之间定点连接形成二硫键。经高效液相色谱分离纯化和质谱鉴定,合成了含有Cys(1~3, 2~4)二硫键连接方式的多肽,其分子质量正确,纯度在95%以上。利用双电极电压钳电生理学技术对这2种突变体与α3β2 nAChR的结合活性进行了检测。结果发现,当该位点的氨基酸性质由酸性转换为碱性后,对LvIA的活性影响巨大,直接导致对α3β2 nAChR的阻断活性丧失。[D11R]LvIA和[D11H]LvIA的活性与野生型LvIA相比分别降低了574.38%和408.62%。由此表明,第11位氨基酸的酸碱性对LvIA的活性至关重要。

English Abstract

李浩楠,杨奕帅,长孙东亭,等. α−芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性[J]. 热带生物学报,2023, 14(1):1−7. DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
引用本文: 李浩楠,杨奕帅,长孙东亭,等. α−芋螺毒素LvIA第11位氨基酸的新突变体合成及其靶点活性[J]. 热带生物学报,2023, 14(1):1−7. DOI:10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
LI Haonan, YANG Yishuai, ZHANG SUN Dongting, ZHU Xiaopeng, LUO Sulan. Synthesis of new analogs of α-conotoxin LvIA mutated at the position 11 residue and their target activity[J]. Journal of Tropical Biology, 2023, 14(1): 1-7. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
Citation: LI Haonan, YANG Yishuai, ZHANG SUN Dongting, ZHU Xiaopeng, LUO Sulan. Synthesis of new analogs of α-conotoxin LvIA mutated at the position 11 residue and their target activity[J]. Journal of Tropical Biology, 2023, 14(1): 1-7. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.004
  • 芋螺(Cone snail)是一种肉食性海洋软体动物[1],其分泌的芋螺毒液包含许多不同化合物的混合物,包括小分子、肽和酶。其中,含有很多种不同成分的神经活性毒素肽−芋螺毒素(Conotoxin, CTx)具有广泛的多样性,这些具有高活性和靶点选择性的神经小肽大多由6~50个氨基酸残基构成,富含二硫键,以特定的离子通道和受体为靶标,作为药理学工具和探针,具有较好的开发前景[2-4]α−芋螺毒素 (α-conotoxin, α-CTx) 是目前研究最广泛和深入的CTxs。α-CTx分子质量较小,由12~20个氨基酸残基连接构成,是各种乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)亚型的选择性拮抗剂[5-6]α-CTx一般含有4个半胱氨酸(Cys),根据二硫键的不同连接方式,可组成3种异构体,其中,大部分α-CTxs的活性形式为球型。另外,根据α-CTx半胱氨酸间氨基酸数量的不同将α-CTx分为:α-3/5、α-4/4、α-4/6、α-4/7等多种亚家族。α-CTx不仅作为分子探针,用以鉴别不同亚型的nAChR,在治疗与nAChR相关疾病时有着至关重要的作用[7-9],并且在成瘾、镇痛等神经生理、药理研究方面也扮演重要角色[10]

    罗素兰研究团队从疣缟芋螺中分离得到了一种 α-4/7型CTx LvIA,它由15个氨基酸残基组成,能够作用于nAChRs,对α3β2 nAChR具有较好的的活性(IC50为8.7 nmol·L−1),但是LvIA对α6/α3β2β3,α3β4和α6/α3β4 3种nAChRs亚型保持一定的高亲和力[11-13]。为了提高LvIA的选择专一性,前期实验室基于LvIA进行了设计和改造,获得了对应的共晶结构,同时也利用受体突变技术解析了它与α3β2 nAChR相互作用的分子机制[14-15]。研究发现,当第11位天冬氨酸(Asp, D)突变成丙氨酸(Ala, A)后对α3β2 nAChR的活性保持不变,共晶实验表明,第11位氨基酸影响着LvIA与α3β2 nAChR的结合作用[16-19]。第11位是否是LvIA的关键氨基酸位点,今后能否基于该位点对LvIA进行改造,有待深入研究。

    本研究基于LvIA前期研究发现的关键氨基酸信息[20-22],主要是针对第11位氨基酸,对LvIA进行进一步设计改造,分别用精氨酸(Arg, R)和组氨酸(His, H)对Asp进行取代,设计了2种新型突变体,考察第11位氨基酸电性和侧链基团对LvIA活性的影响,旨在为LvIA的设计和开发提供依据。

    • α-CTx LvIA及其所有突变体线性肽粗品(吉尔生化上海有限公司),色谱级三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司),色谱级乙腈(Acetonitrile, ACN)(ThermoFisher Scientific公司),N,N−二甲基甲酰胺(DMF)、碘(I2)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、甲酸等分析纯试剂(广州化学试剂厂),质粒提取试剂盒(Omega),胶原酶(Collagenase)、乙酰胆碱(ACh)、阿托品(Atropine)(Sigma公司),DNA纯化试剂盒(TaKaRa大连有限公司),体外转录试剂盒(Fisher Scientific公司),胶原蛋白酶 A(美国 Sigma-Aldrich 公司),圆二色谱检测涉及的试剂由华中科技大学分析测试中心提供;Waters 2695制备型高效液相色谱仪,Waters e2695分析型高效液相色谱仪(美国Waters公司),岛津电喷雾电离质谱(Electrospray ionization-mass spectrometer,ESI-MS)(美国格雷斯公司),双电极电压钳系统Axon 900A 和Digidata 1550B数模转换器(美国Molecular Device公司),ELGA超纯水系统(英国ELGA公司);分光光度计(Smart SpecTM plus)(美国Bio-RAD公司),AlphaImager HP凝胶成像系统(美国Protein Simple公司);实验用非洲爪蟾(美国Nasco公司)。

    • 设计2种LvIA第11位突变体序列送至上海吉尔生化有限公司,使用固相合成法(Fmoc法)进行合成(纯度为80%~85%)。然后使用制备型RP-HPLC对合成好的线性肽进行纯化,使产物的纯度达到95%以上。纯化得到的线形肽采用两步法氧化的方法进行氧化折叠,保证形成I-III, II-IV的二硫键连接结构。第1步氧化,将纯化后的线性肽冻干粉溶于B60(60%乙腈),缓慢地滴加到铁氰化钾反应液(K3[Fe(CN)6] 10 mmol·L−1, Tris 0.1 mol·L−1, pH7.5)中,室温充分反应45 min,促使其形成第1对二硫键(Cys-2和Cys-8),线性肽浓度不高于50 g·L−1。利用RP-HPLC纯化反应后得到单环产物。将第1步纯化后的多肽进行第2步氧化。在氮气保护的条件下,逐滴加入到碘(I2)反应液中(7.5 mmol·L−1 I2溶液;VVTFAVACN= 73∶3∶24),反应时间8~12 min, 促使其连接Cys-3和Cys-16形成第 2 对二硫键,反应完毕滴加VC饱和溶液至溶液颜色从紫黑色变成无色,终止I2氧化反应,至此,得到包含2对二硫键的 LvIA突变体的最终产物。使用RP-HPLC对氧化折叠产物进行纯化(溶剂 A 为 0.075% TFA水溶液,溶剂 B为0.05% TFA、90% ACN, 梯度洗脱条件:5%~35%),使其纯度大于95%,纯化得到的氧化折叠产物利用ESI-MS鉴定其分子质量,确定LvIA及其突变体是否形成正确的二硫键连接方式。冻干保存,用于后续电生理活性实验。

    • 从载入了含(rat,r)α3、β2 2种亚基基因质粒的DH5α感受态细胞中提质粒,将获取的质粒酶切成线性质粒,然后纯化此线性化DNA模板,利用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验纯度,并使用Nanodrop 测定浓度。使用T7 RNA polymerase体外转录试剂盒将DNA模板转录,转录后的RNA使用纯化试剂盒进行纯化,纯化的产物cRNA,再使用分光光度计测定浓度,并使用0.8%的琼脂糖凝胶进行纯度鉴定。选取1只腹部没有斑点的非洲爪蟾,冰冻1 h麻醉,使用手术刀将爪蟾的腹部下侧切开,用剪刀将肌肉剪开,取2片蛙卵置于OR-2溶液中,再用胰蛋白酶酶解成单个蛙卵,至大部分卵母细胞表面无膜,挑选其中个体均匀,无血丝,黑白分明的爪蟾卵母细胞。按照1∶1的比例混合成所需的亚型,保证每个细胞的注射量为50.6 nL,注射后的蛙卵置于含抗生素的ND96培养液中(96 mmol·L−1 NaCl,2 mmol·L−1 KCl,1.8 mmol·L−1 CaCl2,1 mmol·L−1 MgCl2,5 mmol·L−1 HEPES,pH7.1~7.7;抗生素:青霉素、10 mg·L−1链霉素和100 mg·L−1庆大霉素),17 ℃培养2~3 d,表达α3β2受体亚型。

    • 将表达了特定受体的卵母细胞放置于细胞槽内,将双电极电压钳装好holder,再把灌注约1/2 3 mol·L−1 KCl溶液的电极针安装到holder上,将电极针浸入液面,调零,使其钳制电压为70 V, 基准电流低于100 nA,将电压膜片钳打开到ON的模式,钳住细胞,调节程序,每个Sweep(1 min)的第2秒的时候灌流系统给予蛙卵细胞100 μmol·L−1浓度的ACh刺激,其余时刻持续使用ND96溶液灌流。使用双电极电压钳系统检测和记录蛙卵细胞的电流,待电流大小稳定以后,逐次加入经过梯度稀释的待测定活性的LvIA突变体,孵育时间为5 min,再一次开启程序,比较蛙卵细胞加药前后2次产生电流的的大小差异,计算反应率(Response)。通过非线性拟合方程:Response=100/[1+([toxin]/IC50)nH]×100% 进行拟合分析,获取药物作用的剂量反应曲线(IC50值),其中,nH代表Hill系数。

    • 纯化线性肽,使其纯度高于95%,用于后续的氧化折叠反应,连接2对二硫键,将所得产物通过HPLC和MS鉴定,具体结果见图1-A、B。[D11H]LvIA在乙腈浓度23%时洗脱,洗脱时间为14.8 min;而[D11R]LvIA在乙腈浓度为25%时洗脱,洗脱时间是14.9 min。通过质谱确定了[D11H]LvIA和[D11R]LvIA的相对分子质量,分别为1 702.95 和1 721.99 Du,与理论值一致,且均比其线性肽的相对分子量少了4 Du,说明成功连接了2对二硫键并且末端酰胺化,见图1-C、图1-D。

      图  1  LvIA突变体的HPLC和MS结果

    • 提取包含鼠源α3、β2这2种亚基的质粒,使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行纯度检测。从图2-A可知,质粒条带清晰,未发生拖尾情况,超螺旋结构大小在2 500 bp左右,符合理论值大小。从图2-B可知,条带清晰可见,无弥散现象,超螺旋结构的大小在5 000~7 500 bp范围内。使用紫外分光光度计测定线性质粒的质量浓度,质量浓度皆大于0.2 g·L−1,可以保证后续试验的浓度要求。制备α3、β2这2种亚基的cRNA,所得RNA的凝胶电泳结果如图2-C,图中有1条明显的亮带,大小在750~1 000 bp之间,符合理论值,α3亚基的浓度为0.4 g·L−1β2亚基的浓度为0.49 g·L−1。将2种亚基按照1∶1的比例混合,显微注射到酶解好的爪蟾卵母细胞中(图2-D),表达2~3 d,使用激动剂ACh刺激,可以在细胞膜上检测到内向电流,电流大小在200~2 000 nA范围内,如图2-E。

      图  2  α3β2 nAChR模型的建立

    • 分别将LvIA和2种11位的LvIA突变体在表达α3β2 nAChR的非洲爪蟾卵母细胞上进行电生理活性检测。在终浓度为10 μmol·L−1的孵育条件下,LvIA、 [D11R]LvIA和[D11H]LvIA对α3β2nAChR的阻断率分别为(95.8±2.8)%(n=6)、(9.8±2.5)%(n=7)和(12.4±3.1)%(n=5)(图3),与野生型LvIA相比,2种11位突变体对α3β2 nAChR活性几乎完全丧失。

      图  3  LvIA及突变体对于α3β2 nAChR的电流轨迹图

      为了进一步确定2种LvIA 的11位突变体对于α3β2 nAChR的阻断活性,笔者做了剂量反应曲线(图4),分别测定了[D11R]LvIA和[D11H]LvIA对α3β2 nAChR的IC50值,2种突变体对于α3β2 nAChR的IC50值分别为8 976 nmol·L−1和6 390 nmol·L−1表1),活性与比本体的活性相比,分别降低了574.38%和408.62%。证明当第11位的Asp变化后,LvIA的活性大大降低。

      图  4  LvIA及其突变体对于α3β2 nAChR的浓度反应曲线

      表 1  LvIA 及11位突变体在α3β2 nAChR上的IC50

      多肽α3β2 nAChR参考文献
      IC50 /(nmol·L−1)
      (95% C.I.)
      Hill Slope
      (95% C.I.)
      LvIA15.6 (12.8~19.1)0.71(0.59~0.85)[23]
      [D11A]LvIA12 (9.7~14.8)0.84(0.59~0.96)[23]
      [D11R]LvIA8 976 (414~1050)0.47(0.34~0.78)本研究
      [D11H]LvIA6 390 (2 961~13 820)0.60(0.48~0.79)本研究
       注:置信区间95%。
    • α3β2 nAChR 是一种十分重要的受体,与疼痛、成瘾等生理学作用密切相关。LvIA是一种十分重要的α-CTx,作用于α3β2 nAChR,是从疣缟芋螺中发现并且克隆得到的,对LvIA构效关系的研究将有益于获得靶向α3β2 nAChR的相关分子探针,有助于对与α3β2 nAChR相关的药理学研究。目前,发现能够作用于α3β2 nAChR的α-CTx的有很多,其中,GIC、MII、OmIA和PeIA等具有较强的靶向作用,针对这些芋螺毒素的突变改造对于本实验具有借鉴作用[24-23]。如:在对α-CTx MII的研究中发现,MII第11位的谷氨酸(Glu)与α3-β2亚基上带正电荷的残基如:(+) K153和(-)K163形成相互作用,促进MII与α3β2 nAChR的结合,11位对保证MII的活性至关重要[25]。利用共结晶技术对α-CTx GIC的研究发现其第7位的Ala、11位的Asn和12位的Asn对于GIC与受体的结合具有十分重要的作用,特别是11位的Asn可以通过形成氢键与Ac-AChBP相互作用,如果改变11位的氨基酸,会影响GIC与受体的结合,11位氨基酸对于α-4/7型CTxs与受体的结合起到至关重要的作用[26];在PeIA的相关研究中,也发现11位氨基酸分别突变为Arg和Lys之后,对α3β2 nAChRs的IC50分别变为30.9 µmol·L−1和45.4 µmol·L−1,基本丧失了活性[27],上述结果都证明了11位氨基酸对于α-4/7型CTx活性影响显著。

      根据前期研究,发现β2亚基上的3个位点:T59K、V111I、F119Q对α-CTx LvIA的敏感性有显著影响,受体突变加电生理结果表明受体上59、111和119的3个位置,是与LvIA结合的关键位点。罗素兰研究团队对LvIA前期研究中,获得了LvIA与Ac-AChBP的共晶结构。借助共晶结构和分子动力学模拟发现α3亚基中的Lys-155可以与LvIA中带负电荷的Asp-11形成盐桥,增加相互作用,说明第11位的Asp对于LvIA与α3β2 nAChRs的相互作用影响较大,但是将第11位突变成Ala之后活性保持不变,所以本研究希望在前期基础上进一步深入探究第11位如何影响LvIA对于α3β2 nAChRs的活性,针对11位所设计的两个突变体[D11R]LvIA和[D11H]LvIA,当第11位氨基酸突变成碱性氨基酸Arg和His之后,2个突变体的活性都极大的降低。结合前期共晶结构和分子动力学模拟分析,当11位突变为碱性氨基酸后,与α3亚基中的Lys-155都为碱性氨基酸,同性相斥,结合力减弱,造成了LvIA活性的降低。该研究探究了11位的重要作用,为今后基于LvIA的分子设计和改造提供了基础。

参考文献 (27)

目录

    /

    返回文章
    返回