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烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)属于配体门控阳离子通道蛋白成员之一,在哺乳动物体内广泛存在且具有重要生理功能和临床意义。nAChRs存在于整个中枢(CNS)和外周神经系统(PNS),以及血液和免疫细胞上[1-3]。这些离子通道蛋白主要位于突触前膜和突触后膜上,具有调节神经递质释放和介导快速突触传递的生理作用。按其分布主要分为神经型乙酰胆碱受体和肌肉型乙酰胆碱受体两大类。根据亚基组成的不同,nAChRs可以分为由5个相同亚基构成的同源五聚体(如α7)或者由至少两种亚基共同组成的异源五聚体(如α6β4,α3β4,α6β2等),其中α与β亚基的交界面是受体与配体相互作用的关键部位[4-5]。nAChRs不同亚型的结构非常相似,但它们的生理学和药理学功能却截然不同,它们是许多重大疾病的潜在药物靶点,如癫痫、尼古丁或酒精成瘾、慢性疼痛综合症、帕金森病、阿尔茨海默病和癌症等[6-7]。含α6亚基的乙酰胆碱受体亚型(α6* nAChRs),主要分布于儿茶酚胺能神经元、海马体、背根神经节和中脑多巴胺能区域,介导生物体的生理调节功能,如情绪、疼痛、抑郁等[1, 8-9]。其中,位于海马脑区中的α6β4* nAChRs可调节去甲肾上腺素的分泌,且与学习、记忆等生理活动密切相关。α6β4* nAChRs在控制人源肾上腺嗜铬细胞外分泌的过程中发挥了重要作用,主要控制肾上腺素向血液的释放,以及在交感神经的支配下负责机体对压力调控的应答[10-11]。α6β4* nAChRs也分布于背根神经节神经元上,共表达α6β4* nAChRs和P2X受体会导致延长P2X受体的脱敏时间,激动α6β4* nAChRs可通过抑制P2X受体而发挥镇痛作用[12-13]。天然的α6亚基与β4亚基组合形成的受体在体外很难表达、不稳定。α6亚基与其他亚基的组装形式复杂多变,且与α3亚基的跨膜区域和胞内区域同源性较高,为了增加其功能性表达,研究者利用α6/α3嵌合亚基代替α6亚基,即由α6亚基的N端胞外配体结合区域与α3亚基的跨膜区嵌合而成,与β4亚基共表达所形成的α6/α3β4受体与天然α6β4受体具有相似的结合活性,可以作为体外药物筛选的模型[14]。α6β4* nAChRs在大脑区域中常常以低水平表达,且α6β4* nAChRs的表达往往伴随α6β2*,α3β4 nAChRs等相似亚型的表达并被遮盖而很难区分,导致其结构和参与的生理功能难以研究,至今仍不清楚[1],如位于背根神经节上的α4β2,α7,α9α10,α6β4 nAChRs都与神经型疼痛和炎症相关,但各亚型起什么作用不得而知。若能发现专一地作用于α6β4 nAChR的新型配体,将有助于解析该受体亚型的结构、与配体之间的相互作用关系以及生理药理功能和开发分子探针进一步研究疼痛等相关疾病的病理分子机制,而这些研究的前提是需有效地表达出各种亚型,以此为模型去发现相应的配体。
非洲爪蟾卵母细胞作为分析膜蛋白功能的表达系统具有2大优势:第一,卵母细胞具有丰富的rRNA和tRNA,因此可以将外源引入的mRNA表达为功能受体蛋白;第二,卵母细胞具有多种内源性信号转导组件,如腺苷酸环化酶、phospholipace C,Ca2+激活的氯离子通道等。目前,卵母细胞表达体系广泛运用于离子通道学领域,由于其卵母细胞体积大(直径约为1 mm),通常以全细胞灌流方法给药研究配体与受体之间的相互作用关系。在卵母细胞膜上表达nAChRs、G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCRs)、谷氨酸受体(Glutamate Receptor)、Na+,K+,Ca2+阳离子通道蛋白模型,对于研究阐明离子通道的功能多样性和构型提供理论基础[15]。因此,本研究针对难表达的α6/α3β4乙酰胆碱受体亚型,建立并优化了其在非洲爪蟾卵母细胞中的表达体系,旨在为α6β4* nAChRs的配体筛选提供实验模型和研究基础。
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通过w=0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测α6/α3、β4亚基基因质粒和酶切后的纯度。从图1可知,第1和第3泳道分别为α6/α3、β4亚基基因质粒,条带清晰明亮,完整性好,且质量浓度都高于0.5 g·L−1(表1),适合进一步进行酶切形成线性质粒。根据目的基因3′-非翻译区下游的酶切位点,用SalⅠ酶切α6/α3质粒、NheⅠ酶切β4质粒,形成线性化质粒,检测纯度。第2和第4泳道分别为α6/α3、β4亚基基因质粒的酶切产物(图1),环状质粒已完全线性化,DNA条带单一明亮,无明显杂质,且与环状质粒相比具有明显滞后性,线性化产物质量浓度约为0.5 g·L−1(表1)。
图 1 含有r α6/α3、r β4亚基基因的质粒及其酶切线性化后产物的电泳图
Figure 1. Agarose gel electrophoresis of plasmid and linearized DNA containing r α6/α3 or r β4 subunit gene
表 1 包含r α6/α3和r β4亚基基因的质粒、线性化DNA和cRNA浓度
Table 1. The concentrations of plasmid, linearized DNA and cRNA containing r α6/α3 or r β4 subunit gene
名称
Subunit质粒DNA/
(g·L−1)
Plasmid DNA线性DNA/
(g·L−1)
Linearized DNAcRNA/
(g·L−1)A260/
A280r α6/α3 0.68 0.46 0.62 2.11 r β4 0.79 0.51 0.58 2.12 通过w=2%的琼脂糖凝胶电泳检测转录完后获得cRNA的纯度。第1和第2泳道分别为α6/α3,β4的cRNA(图2),条带单一明亮,测定α6/α3的质量浓度为0.62 g·L−1,β4为0.58 g·L−1,按需分装,−80 ℃保存备用。
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为了研究每个蛙卵cRNA的不同配比和培养时间对α6/α3β4 nAChR亚型表达的影响,用3~6个卵母细胞检测其电流大小取平均值进行比较,注射后第2天检测3种不用配比形成的α6/α3β4亚型均无明显大小的电流;在第3天检测10︰1,1︰1,1︰10形成的α6/α3β4亚型表达电流大小,取平均值分别对应359 nA,2421 nA,1 810 nA。1︰1和1︰10配比条件下形成的α6/α3β4亚型针对ACh诱导产生的电流差异无明显变化,与10︰1配比条件下形成的α6/α3β4亚型相比具有统计学显著性差异;第4天经过检测与第3天无明显差异;第5天检测3种不用配比形成的α6/α3β4亚型的电流比第4天稍许下降,可能由于蛙卵质量下降或敏感性减弱所致(图3A)。
图 3 cRNA不同配比和注射量对α6/α3β4受体表达的影响
Figure 3. Effect of different ratios and injection volume of cRNA on the expression of α6/α3β4 nAChR
从图3B中可知,当以1∶1配比的cRNA注射量为5 ng时,检测多个蛙卵均无明显电流,即蛙卵均不能表达受体;当注射量为10或15 ng时,均可检测到较大电流且稳定,说明表达受体的情况较佳。
在任何浓度ACh的刺激下,单独注射α6/α3 cRNA、β4 cRNA、ddH2O以及空白蛙卵都不能产生明显的电流,说明单独的α6/α3或β4亚基不能组装形成功能性α6/α3β4 nAChR,空白蛙卵细胞膜上不存在nAChRs。只有同时注射以一定比例混合的α6/α3和β4亚基cRNA才能形成功能受体并在ACh刺激下通道开放而产生内向电流,说明α6/α3和β4亚基以一定比例组合形成的功能受体是α6/α3β4 nAChR表达的必备条件。
通过在不同浓度5,10,50,100,200,500,1 000 μmol·L−1的ACh刺激下,1︰1配比形成的α6/α3β4 nAChR通道开放产生的电流具有浓度依赖性,随着浓度的依次增加,电流持续增大。从图4A中可知,当ACh浓度为5 μmol·L−1时,能检测到微弱的电流,约200 nA;当ACh浓度高达1 000 μmol·L−1时,α6/α3β4 nAChR通道开放产生的电流达到最大,约4 800 nA;ACh的浓度与激发电流的大小呈非线性相关(图4B),ACh的半数有效浓度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)为101.7 μmol·L−1。由于ACh浓度太高电流过大易导致受体过度开放而脱敏,ACh浓度太低电流过小易造成数据误差,而ACh的浓度在50~200 μmol·L−1的范围内较好,其电流较大且稳定。因此,选择ACh配体浓度为100 μmol·L−1时,α6/α3β4 nAChR通道开放可产生明显的电流。
图 4 ACh浓度对α6/α3β4受体表达的影响
Figure 4. Effect of ACh concentrations on the expression of α6/α3β4 nAChR receptor
在ACh浓度为100 μmol·L−1、α6/α3和β4亚基以1∶1配比且注射量为10 ng·个−1的情况下,检测α6/α3β4 nAChR表达活性和敏感性。从图5中可知,10 μmol·L−1 α−芋螺毒素TxID几乎能完全阻断α6/α3β4 nAChR的电流,较易洗脱,其IC50值为125.5 nmol·L−1,与文献[16]的结果一致,说明受体具有良好的生理功能与敏感性。
Expression of α6/α3β4 Nicotinic Acetylcholine Receptor in Xenopus Oocytes
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摘要: α6/α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(α6β4* nAChRs,*代表其他亚基)主要分布于大脑海马区、外周神经节和人源肾上腺嗜铬细胞等,与神经性疼痛和炎症反应、情绪等生理疾病密切相关。本研究拟对大鼠α6/α3β4 nAChR在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞膜上进行重组表达,并利用双电极电压钳电生理学技术检测该重组受体的功能。在不同浓度的激动剂乙酰胆碱的刺激下,比较了α6/α3和β4亚基的不同配比形成的受体通道开放而产生的电流大小,并用其拮抗剂α−芋螺毒素TxID验证了该受体的敏感性。结果表明,亚基不同配比的α6/α3β4 nAChR均可在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,并具有较好的配体门控敏感性。
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关键词:
- α6/α3β4烟碱型乙酰胆碱受体 /
- 非洲爪蟾卵母细胞 /
- 双电极电压钳 /
- 重组表达
Abstract: α6/α3β4 nicotinic acetylcholine receptors (α6β4*nAChRs, the asterisk denotes the possible presence of additional subunits) are mainly distributed in the hippocampus, peripheral ganglia and human adrenal chromaffin cells, and are closely related to neuropathic and inflammatory pain, stress, etc. Recombinant expression of rat α6/α3β4 nAChR on Xenopus laevis oocytes was detected by using the two-electrode voltage clamp to record inward currents elicited by acetylcholine at different concentrations in light of α and β subunits at different ratios, and the sensitivity of this receptor was verified by its antagonist α-conotoxin TxID. The results showed that α6β4 nAChR subtypes with different ratios of subunits were successfully expressed in the oocyte membrane, and had good sensitivity of ligand-gated ion channel function.-
Key words:
- α6/α3β4 nAChR /
- Xenopus oocytes /
- two-electrode voltage clamp /
- recombinant expression
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图 3 cRNA不同配比和注射量对α6/α3β4受体表达的影响
A:不同配比形成α6/α3β4在100 μmol·L−1 ACh诱导下产生的电流;B:不同注射剂量形成的α6/α3β4在100 μmol·L−1 ACh诱导下产生的电流。Mean±SEM. n=3~6。
Fig. 3 Effect of different ratios and injection volume of cRNA on the expression of α6/α3β4 nAChR
A: Inward current amplitudes of α6/α3β4 nAChR with different ratios evoked by perfusion with 100 μmol·L−1 ACh; B: Inward current amplitudes of α6/α3β4 nAChR with different injection volumes evoked by perfusion with 100 μmol·L−1 ACh.
图 4 ACh浓度对α6/α3β4受体表达的影响
A:不同浓度配体ACh诱发α6/α3β4 nAChR产生的电流;B:ACh激活α6/α3β4 nAChR的浓度反应曲线。Mean±SEM. n=3~6。
Fig. 4 Effect of ACh concentrations on the expression of α6/α3β4 nAChR receptor
A: Currents evoked by ACh at different concentrations at α6/α3β4 nAChR. B: ACh concentration-response curve for α6/α3β4 nAChR.
图 5 α−芋螺毒素TxID阻断α6/α3β4 nAChR的效果图
A:TxID阻断大鼠α6/α3β4 nAChR的电流轨迹图;B:TxID对大鼠α6/α3β4 nAChR的浓度−反应曲线图。Mean±SEM. n=3~6。
Fig. 5 Blocking of α6/α3β4 nAChR with α-CTx TxID
A: Current trace of inhibition of α6/α3β4 nAChR by α-CTx TxID; B: Concentration-response analysis for inhibition of rat α6/α3β4 by α-CTx TxID.
表 1 包含r α6/α3和r β4亚基基因的质粒、线性化DNA和cRNA浓度
Table 1 The concentrations of plasmid, linearized DNA and cRNA containing r α6/α3 or r β4 subunit gene
名称
Subunit质粒DNA/
(g·L−1)
Plasmid DNA线性DNA/
(g·L−1)
Linearized DNAcRNA/
(g·L−1)A260/
A280r α6/α3 0.68 0.46 0.62 2.11 r β4 0.79 0.51 0.58 2.12 -
[1] HONE A J, MEYER E L, MCINTYRE M, et al. Nicotinic acetylcholine receptors in dorsal root ganglion neurons include the alpha6beta4* subtype [J]. FASEB Journal, 2012, 26(2): 917 − 926. doi: 10.1096/fj.11-195883 [2] MACKEY E D, ENGLE S E, KIM M R, et al. alpha6* nicotinic acetylcholine receptor expression and function in a visual salience circuit [J]. Journal of Neuroscience, 2012, 32(30): 10226 − 10237. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0007-12.2012 [3] GIRIBALDI J, DUTERTRE S. alpha-Conotoxins to explore the molecular, physiological and pathophysiological functions of neuronal nicotinic acetylcholine receptors [J]. Neuroscience Letters, 2018, 679: 24 − 34. doi: 10.1016/j.neulet.2017.11.063 [4] KRASHIA P, MORONI M, BROADBENT S, et al. Human α3β4 neuronal nicotinic receptors show different stoichiometry if they are expressed in Xenopus oocytes or mammalian HEK293 cells [J]. PLoS One, 2010, 5(10): e13611. doi: 10.1371/journal.pone.0013611 [5] CECCHINI M, CHANGEUX J P. The nicotinic acetylcholine receptor and its prokaryotic homologues: Structure, conformational transitions & allosteric modulation [J]. Neuropharmacology, 2015, 96(Pt B): 137 − 149. [6] EGLETON R D, BROWN K C, DASGUPTA P. Nicotinic acetylcholine receptors in cancer: multiple roles in proliferation and inhibition of apoptosis [J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2008, 29(3): 151 − 158. doi: 10.1016/j.tips.2007.12.006 [7] GAO F, CHEN D, MA X, et al. Alpha6-containing nicotinic acetylcholine receptor is a highly sensitive target of alcohol [J]. Neuropharmacology, 2019, 149: 45 − 54. doi: 10.1016/j.neuropharm.2019.01.021 [8] LUO S, ZHANGSUN D, WU Y, et al. Characterization of a novel alpha-conotoxin from conus textile that selectively targets alpha6/alpha3beta2beta3 nicotinic acetylcholine receptors [J]. The Journal of Biological Chemistry, 2013, 288(2): 894 − 902. doi: 10.1074/jbc.M112.427898 [9] LEINO S, KOSKI S K, RANNANPAA S, et al. 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