橡胶树暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）CS23菌株由本实验室分离鉴定并保存。

99.99%苯并烯氟菌唑原药由德国Dr. Ehrenstorfer公司提供，丙酮溶解并配制成10000 μg·mL⁻¹的储备液，于4 ℃保存。96.4%麦角甾醇标准品和99.7%角鲨烯标准品由坛墨质检科技股份有限公司提供。90%羊毛甾醇、99%胆固醇由上海源叶生物科技有限公司提供。

PDB培养基由马铃薯200 g煮沸滤取的浸出液和葡萄糖20 g组成；PDA培养基在PDB基础上加入琼脂粉20 g以用于平板培养。YCS培养基包括上层、下层及液体培养基：上层培养基含酵母提取物1 g、酸水解酪蛋白1 g、葡萄糖10 g和琼脂粉10 g；下层培养基含酸水解酪蛋白1 g、酵母提取物1 g、蔗糖342 g和琼脂粉12 g；YCS液体培养基由蔗糖342 g和酸水解酪蛋白1 g组成，三者均定容至1000 mL。所有培养基均在121 ℃高压灭菌20 min后使用。

药剂处理：将CS23菌株于PDA平板上28 ℃活化培养3 d后，取直径5 mm的菌饼置于100 mL PDB液体培养基中，以28 ℃和180 rpm条件下摇床培养36 h。根据前期研究，选择 5 μg·mL⁻¹ 苯并烯氟菌唑作为处理浓度，加入后继续培养 36 h^[15]。使用无菌水作为空白对照。滤干菌丝多余水分，称取等量菌丝置真空冷冻干燥器干燥备用。

皂化法提取甾类化合物：参考黄慧等^[18]醇碱皂化法提取米曲霉麦角甾醇，并在此基础上改进。称取300 mg冻干菌丝，加入皂化剂氢氧化钾-甲醇溶液（60 g/L），在70 ℃皂化2 h。用3倍的正己烷萃取3次，合并提取液，旋转蒸发正己烷浓缩得到不可皂化脂质，加入二氯甲烷使溶液体积为1 mL，−20 ℃保存。

定性方法：采用美国国家标准与技术研究院（National institute of standards and technology, NIST）谱库检索并结合甾醇类化合物的质谱裂解规律进行定性分析。

定量方法：采用胆固醇内标法进行定量。将与麦角甾醇具有相似结构的外源物质胆固醇溶解于二氯甲烷中，配制成12.5、25、50、100、200 μg·mL⁻¹的胆固醇标准液。然后，将胆固醇标准液加入提取液中，作为内标物质。通过GC-MS/MS对样品进行检测，建立标准曲线为y=461.95x−7856.1，R²=0.9916，最低检出限为0.01 μg·mL⁻¹，用于其他甾醇类化合物的定量分析。

色谱条件：TG-5ILMS型气相色谱柱（30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm）；进样口温度230 ℃；恒流模式；不分流进样；进样体积1 μL。程序升温：初始温度为80 ℃（保持2 min），以30 ℃/min升至250 ℃（保持5 min），以35 ℃/min升至300 ℃（保持2 min）。载气为高纯氦气（99.999%）。

质谱条件：电子轰击离子源（EI）；离子源温度300 ℃；传输线温度250 ℃；溶剂延迟时间3 min；Full Scan 模式扫描，质子数/电荷数（m/z）比值监测范围50～500。

将活化好的CS23菌株挑取5个菌饼转入终浓度为1 μg·mL⁻¹苯并烯氟菌唑PDB培养基中，恒温摇床28 ℃、140 rpm培养3 d，以无添加药剂为空白对照。用滤纸过滤菌丝并用无菌水清洗，将吸干水分的菌丝体转移至研钵中加入液氮速冷，并迅速研磨至粉末状，取500 mg磨碎后的菌丝样品至2.0 mL无酶离心管中采用Trizol法提取RNA，方法参考天根总RNA提取试剂盒说明书。核酸浓度分析仪检测RNA合格后寄样送转录组测序。RNA-seq数据已上传至NCBI数据库，登录号为PRJNA744009^[15]。使用倍数变化 ≥ 2 且 p 值 < 0.05 作为筛选标准，以识别不同组别之间的差异表达基因。

采取同源重组的策略，将目的基因 cDNA 序列引入pCAMBIA1303过表达载体中。从CS23菌株中提取总RNA，经反转录合成cDNA文库，以cDNA为模板使用表1中特异性引物分别PCR扩增ERG1、ERG7、cyp51a 和 cyp51b基因。采用ClonExpres无缝克隆技术，将纯化得到的目的基因片段连入酶切线性pCAMBIA1303载体质粒。连接体系为：线性化载体4.5 μL，目的基因片段0.5 μL，2 × ClonExpress Mix 5 μL，ddH₂O补足 10 μL PCR仪50 ℃反应15 min。重组转化步骤参考ClonExpress® Ultra One Step Cloning Kit试剂盒说明书（诺唯赞）。菌落PCR扩增并测序以验证阳性单克隆，阳性转化子加入甘油后置于−80 ℃保存。

将CS23菌株和过表达菌株ERG1-OE1、ERG7-OE1、cyp51a-OE1、cyp51b-OE1在PDA平板上于28 ℃活化培养3 d后取直径5 mm菌饼置于含有100 mL PDB液体培养基锥形瓶中28 ℃和180 rpm下振荡培养。每个菌株设置3个生物学重复。药剂处理：摇培36 h后向培养基中加入苯并烯氟菌唑使其终浓度为5 μg·mL⁻¹，继续摇培36 h。滤干菌丝多余水分，采用Trizol法提取RNA以β2-tubulin基因为内参基因比较不同条件下的基因表达式，使2^−ΔΔCt方法计算每个基因的相对表达水平。基因表达量的相对标准偏差（RSD）均小于15%，数据以均值±SD形式呈现。

采用菌丝生长速率法测定菌株的药敏性^[19]。向灭菌后的PDA培养基中加入苯并烯氟菌唑储备液，使其终浓度为0.1 μg·mL⁻¹和0.05 μg·mL⁻¹。将暹罗炭疽菌基因过表达菌株ERG1-OE1、ERG7-OE1、cyp51a-OE1、cyp51b-OE1在PDA平板上于28 ℃活化培养3 d后，从菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，分别接种于含不同浓度苯并烯氟菌唑的PDA平板中央，每浓度设3个重复，于28 ℃培养5 d后，采用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算菌丝生长抑制率并使用SPSS 22.0进行统计分析，确保结果可靠性。每个处理3次重复。

方法参考Cao 等^[20]稍作修改，PDA培养基中加入苯并烯氟菌唑储备液，使其终浓度为0.1 μg·mL⁻¹。同时，加入适量麦角甾醇和角鲨烯母液形成不同浓度的药剂外源物质组合。将CS23菌株及过表达菌株分别接种于PDA平板正中央28 ℃培养5 d后，采用十字交叉法测量各处理的菌落直径，同1.2.5计算不同外源组合物质对过表达菌株的菌丝生长抑制率。每个处理3次重复。

为了探究苯并烯氟菌唑对破坏暹罗炭疽菌的细胞膜完整性的分子作用机制，本研究对苯并烯氟菌唑处理条件下的CS23菌株进行转录组分析。以药剂未处理的CS23菌株转录组为对照，使用倍数变化≥ 2 且 p 值 < 0.05 为显著差异分析GO途径和KEGG富集通路（表2），发现在苯并烯氟菌唑处理组的差异基因显著富集在细胞膜相关途径（0031224; 0044425; 0016020）和甾类化合物合成通路（ko00100）中。尤其是在麦角甾醇合成通路中，有6个关键基因表达显著下调，相对表达量在0.11～0.43之间。另外，通过荧光定量PCR技术分析了这些基因的表达量，发现表达趋势与转录组数据一致，相对表达量在0.16～0.48之间（表3）。上述结果表明，苯并烯氟菌唑可能通过抑制麦角甾醇的生物合成来破坏暹罗炭疽菌的细胞膜完整性。

为了进一步明确苯并烯氟菌唑对麦角甾醇生物合成通路的作用机制，本研究利用GC-MS/MS技术分析了暹罗炭疽菌的麦角甾醇生物合成途径中的中间体组成，根据甾醇类化合物的代谢规律以及NIST质谱库检索分析，鉴定出10种甾醇类化合物，按照麦角甾醇合成路线顺序依次是角鲨烯、羊毛甾醇、4,4-二甲基胆甾-8, 14,24-三烯醇、4,4-二甲基酵母甾醇、酵母甾醇、4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯、粪甾醇、表甾醇、麦角甾烯醇、麦角甾醇（表4）。以未处理组为对照，本研究分析了苯并烯氟菌唑对暹罗炭疽菌中10种甾醇类化合物含量的影响。定量结果显示，在两组处理的菌丝中均检测到10种甾醇类化合物，其中角鲨烯、羊毛甾醇、4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯和麦角甾醇的含量在两组之间存在显著差异。苯并烯氟菌唑处理后，4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯和麦角甾醇的含量显著降低，而羊毛甾醇的含量则显著升高（图1）。结果表明，苯并烯氟菌唑可影响暹罗炭疽菌体内麦角甾醇生物合成中间体的含量，最终影响麦角甾醇的生物合成

图  1  苯并烯氟菌唑处理后菌株体内10种甾醇中间体的含量

Figure 1.  The content of 10 sterol intermediates in the strain after treatment with benzovindiflupyr

参考真菌麦角甾醇合成途径^[21]，结合苯并烯氟菌唑对麦角甾醇合成中间体及编码基因的抑制作用，我们筛选出可能受药剂作用的四个催化酶基因，分别为ERG1、ERG7、cyp51a和cyp51b。本研究成功构建了这四个基因的暹罗炭疽菌过表达菌株，并与野生型菌株CS23进行了荧光定量分析。结果表明，过表达菌株的基因表达量均显著高于CS23菌株，表达水平提高了1.7至3.1倍（图2A）。此外，我们进一步测定了这些过表达菌株对苯并烯氟菌唑的药敏性。结果显示，与CS23菌株相比，ERG1基因的过表达菌株ERG1-OE1对苯并烯氟菌唑的敏感性降低了7.6～8.9%，而其他过表达菌株与CS23菌株无显著差异（图2B）。这表明，苯并烯氟菌唑可能通过抑制CS23菌株中ERG1基因的表达，从而影响麦角甾醇的生物合成。

图  2  过表达菌株的基因相对表达量（A）和对苯并烯氟菌唑的药敏性（B）

Figure 2.  The relative gene expression of the overexpression strains（A）and their sensitivity to benzovindiflupyr（B）

以未添加组为对照，研究外源添加角鲨烯和麦角甾醇条件下，苯并烯氟菌唑对CS23菌株及ERG1-OE1菌株菌丝生长抑制率的影响。结果表明，0.1 μg·mL⁻¹苯并烯氟菌唑处理后2～5 d内，菌丝生长抑制率逐渐降低，外源添加不同浓度角鲨烯和麦角甾醇显著降低了药剂对两个菌株的抑制率，尤其在第5天时，100 μg·mL⁻¹麦角甾醇处理下，苯并烯氟菌唑对CS23菌株的抑制率仅为25.18%，对ERG1-OE1则无抑制效果（图3）。由此可见，外源添加角鲨烯和麦角甾醇能显著降低苯并烯氟菌唑对暹罗炭疽菌的生长抑制作用。

图  3  外源添加角鲨烯和麦角甾醇条件下苯并烯氟菌唑的抑菌效果

Figure 3.  The inhibitory effect of benzovindiflupyr under the conditions of exogenous addition of squalene and ergosterol

酰胺类杀菌剂苯并烯氟菌唑在防治多种作物炭疽病方面展现出独特优势，能够有效抑制炭疽菌的菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长^{[11 − 13]}。因此，Ishii等^[12]人提出，除了SDH酶靶标结合机制外，可能还存在其他作用机制，导致苯并烯氟菌唑等SDHI类杀菌剂对炭疽菌的毒力差异。然而，该现象背后的具体作用机制尚未完全阐明。本研究对苯并烯氟菌唑处理下的暹罗炭疽菌进行转录组分析，发现差异基因显著富集细胞膜相关途径和甾类化合物合成通路。尤其是在麦角甾醇合成通路中，有6个关键基因表达差异显著，相对表达量在0.11～0.43之间。经荧光定量PCR技术验证，这些基因表达趋势与转录组数据一致。

麦角甾醇又称麦角固醇，是一种类异戊二烯的准平面分子，是真菌细胞膜上特有的甾醇类组分。麦角甾醇是真菌细胞膜的关键成分，参与质膜融合、胞间运输等多种生物过程^{[22 − 24]}。此外，麦角甾醇还存在于线粒体、液泡、内质网等多种内膜结构中，对胞内信号传递、物质运输、遗传等生物学过程意义重大^{[25 − 27]}。本研究建立了GC-MS/MS技术，用于分析麦角甾醇生物合成途径中的甾醇组分及其含量，并推测苯并烯氟菌唑可能作用的关键合成酶。在真菌甾醇组分的分析中，尽管已有多项研究采用GC-MS进行定性和定量分析并取得了良好效果，但该方法仍需进行衍生化处理^{[28 − 30]}。本研究中提取的不可皂化脂质无需衍生化处理，可直接通过GC-MS/MS进行分离，获得更精确的母离子分子量，对甾醇组分进行定性和定量分析。在检测的十种甾醇组分中，角鲨烯、羊毛甾醇、4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯和麦角甾醇的含量在不同处理间显著变化。结果表明，苯并烯氟菌唑显著作用于暹罗炭疽菌的麦角甾醇生物合成通路，这与转录组分析及GO和KEGG富集分析的结果一致。

多项研究表明，阻断或破坏麦角甾醇合成途径中的任意一步，都会导致中间代谢产物增加或最终麦角甾醇合成量减少^{[31 − 33]}。苯并烯氟菌唑可能抑制炭疽菌中的角鲨烯环氧化酶，且其作用靶标有别于麦角甾醇类杀菌剂^{[34 −35]}。为进一步验证角鲨烯环氧化酶的作用，本研究通过基因过表达技术构建了过表达菌株。结果显示，与CS23菌株相比，编码角鲨烯环氧化酶的ERG1基因过表达菌株ERG1-OE1对苯并烯氟菌唑的敏感性显著降低，说明苯并烯氟菌唑可能会抑制角鲨烯环氧化酶的活性。此外，外源添加角鲨烯和麦角甾醇后，暹罗炭疽菌对苯并烯氟菌唑的药敏性显著降低，表明外源角鲨烯和麦角甾醇的添加增加了菌体内麦角甾醇的含量，可能通过减弱药剂对细胞膜完整性的破坏作用，降低了其抑制效果^[36]。

综上所述，苯并烯氟菌唑不仅通过靶向SDH酶发挥作用，还能够抑制麦角甾醇合成酶相关基因的表达，从而阻断麦角甾醇合成途径，展现出多重作用机制。其中，ERG1基因的显著变化与中间代谢产物的积累及药敏性的改变密切相关，可能是苯并烯氟菌唑的关键作用靶标之一。本项研究的意义在于初步揭示了苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌的分子机制，为炭疽病防治新药剂的筛选与应用提供了重要的理论依据。然而，本研究虽然利用基因过表达技术验证了关键合成酶的功能，但仍存在一定的实验局限性，尤其是药剂与靶标酶的直接结合尚需进一步实验证据。为克服上述局限，后续研究将通过酶活性测定、分子对接和基因敲除等实验方法，进一步验证和完善本研究的预测结果。这将有助于进一步揭示苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇合成的分子机制，为新型酰胺类杀菌剂的研发提供理论依据。