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苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇生物合成的机制初探

简沙沙 蒙亚玲 邱煜荣 王萌 张宇 杨叶 梁晓宇

简沙沙,蒙亚玲,邱煜荣,等. 苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇生物合成的机制初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−10. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
引用本文: 简沙沙,蒙亚玲,邱煜荣,等. 苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇生物合成的机制初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−10. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
JIAN Shasha, MENG Yaling, QIU Yurong, WANG Meng, ZHANG Yu, YANG Ye, LIANG Xiaoyu. Molecular Mechanism of Benzovindiflupyr Inhibiting Ergosterol Biosynthesis in Colletotrichum siamense[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
Citation: JIAN Shasha, MENG Yaling, QIU Yurong, WANG Meng, ZHANG Yu, YANG Ye, LIANG Xiaoyu. Molecular Mechanism of Benzovindiflupyr Inhibiting Ergosterol Biosynthesis in Colletotrichum siamense[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052

苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇生物合成的机制初探

doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
基金项目: 海南省“南海新星”科技创新人才平台项目(NHXXRCXM202310);“崖州湾”菁英人才科技专项项目(SCKJ-JYRC-2023-22);国家自然科学基金地区基金(32160654)。
详细信息
    第一作者:

    简沙沙(1998—),女,海南大学热带农林学院2022级硕士研究生。Email:shashajian666@163.com

    通信作者:

    梁晓宇(1989—),男,副教授,博士生导师,主要研究方向:热带作物病害防治。Email:liang2017@hainanu.edu.cn

Molecular Mechanism of Benzovindiflupyr Inhibiting Ergosterol Biosynthesis in Colletotrichum siamense

  • 摘要: 酰胺类杀菌剂凭借多样的化学结构和广泛的靶点,已成为农药研发的关键领域。然而,不同酰胺类杀菌剂在同一病原菌上的毒力差异尚未充分阐明,限制了其优化和应用。其中,苯并烯氟菌唑作为一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂(Succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI),表现出对炭疽菌的显著抑制效果,尤其是通过显著破坏细胞膜完整性展现了不同于传统SDHI类杀菌剂的机制。本研究旨在进一步探讨苯并烯氟菌唑的分子机制,揭示其对暹罗炭疽菌的多重抑制途径。通过转录组KEGG富集分析,发现苯并烯氟菌唑显著抑制了暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)的甾类化合物合成途径。荧光定量PCR进一步验证了麦角甾醇合成途径中ERG1、cyp51a等关键基因表达显著下降。气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)分析显示,苯并烯氟菌唑处理后,暹罗炭疽菌的角鲨烯和麦角甾醇含量显著降低,羊毛甾醇含量增加。构建ERG1等5个麦角甾醇合成基因过表达菌株后,发现ERG1过表达菌株对苯并烯氟菌唑的敏感性显著降低,其他过表达菌株与野生型CS23菌株的药敏性一致。此外,外源添加角鲨烯和麦角甾醇显著降低了苯并烯氟菌唑的抑菌效果,尤其是在添加100 μg·mL−1麦角甾醇时,苯并烯氟菌唑对CS23菌株的抑制率降至25.18%,对ERG1-OE1菌株则无抑制作用。综上所述,苯并烯氟菌唑可能通过抑制ERG1基因的表达,阻碍麦角甾醇的合成,从而破坏暹罗炭疽菌的细胞膜,最终抑制其菌丝生长。本研究初步揭示了苯并烯氟菌唑对炭疽菌的分子作用机制,为新型酰胺类杀菌剂的研发提供了理论依据。
  • 图  2  过表达菌株的基因相对表达量(A)和对苯并烯氟菌唑的药敏性(B)

    注:柱上的*代表在0.05水平差异显著。

    Fig.  2  The relative gene expression of the overexpression strains(A)and their sensitivity to benzovindiflupyr(B)

    Note: An asterisk on the bars indicates a significant difference at the 0.05 level.

    图  3  外源添加角鲨烯和麦角甾醇条件下苯并烯氟菌唑的抑菌效果

    Be代表0.1 μg·mL−1苯并烯氟菌唑,squ100、200分别代表100、200 μg·mL−1角鲨烯,erg25、50、100分别代表25、50、100 μg·mL−1麦角甾醇。

    Fig.  3  The inhibitory effect of benzovindiflupyr under the conditions of exogenous addition of squalene and ergosterol

    Be represents 0.1 μg·mL−1 of benzovindiflupyr, squ100 and squ200 represent 100 μg·mL−1 and 200 μμg·mL−1 of squalene, respectively, while erg25, erg50, and erg100 represent 25 μg·mL−1, 50 μg·mL−1, and 100 μg·mL−1 of ergosterol, respectively.

    表  1  本研究使用的引物

    Table  1  Primer used in this study

    引物名称
    Primer name
    引物序列
    Primer sequences
    KL-CDS-cyp51b-F1 ATGGGTCTCCTGCAGGAGGT
    KL-CDS-cyp51b-R1 TTACGCCTCACGCTTCTCCC
    KL-CDS-cyp51a-F1 ATGAGCCCTCTCGTTGTCTATGG
    KL-CDS-cyp51a-R1 TCAATCACGTCGGGTCCACC
    KL-CDS-ERG1-F1 ATGATTGAGAGTCCGACAGCAGC
    KL-CDS- ERG1-R1 CTAGTTCAATTCGCGCCACAT
    KL-CDS-ERG7-F1 ATGGTCGTCGAGAAGAAAGCG
    KL-CDS-ERG7-R1 TTACTCCTTGCCGCTGATGC
    qp-cyp51a-F ACGTCGCAAGAACGGTGATA
    qp-cyp51a-R CTGACCTCCCATGAGAAGCG
    qp-cyp51b-F TGGAACAAGAAGCGCGATCA
    qp-cyp51b-R GTGCCGTTCTTGTAGGTGGA
    qp- ERG1-F GGCAAGACGAAGGACGACTA
    qp- ERG1-R GGAGGTACTCCTTGCGGAAC
    qp-ERG7-F TGCAAGGACTCGGACAAGTG
    qp-ERG7-R TGAGCGCCTCCGAAATACAG
    qp-β2-tubulin-F AGCCCTACAACGCCACTCTCT
    qp-β2-tubulin-R GTGGTTCAGGTCGCCGTAAG
    qp-ERG5-3F TCACGCCGAACTACACTGTCC
    qp-ERG5-3R ACATATCTTCGCGCAAGGCAA
    qp-ERG5-2F AATTCGTCGTTCTTGCATCCG
    qp-ERG5-2R CTTCGATACTCTGCGTGGTC
    qp-ERG6-2-F ATCAGACAGGCTCGTACAGCA
    qp -ERG6-2-R TGCCACCCTTGAGTCCCAT
    1303-F TTTGAACCTTTCAGTTCGAGCTTT
    1303-R CTGAATGCCCACAGGCC
    cz-cyp51b-F agacatcaccatggtagatct
    ATGGGTCTCCTGCAGGAGGT
    cz-cyp51b-R ttctacaggacgtaaactagt
    TTACGCCTCACGCTTCTCCC
    cz-cyp51a-F agacatcaccatggtagatct
    ATGAGCCCTCTCGTTGTCTATGG
    cz-cyp51a-R ttctacaggacgtaaactagt
    TCAATCACGTCGGGTCCACC
    cz-ERG1-F agacatcaccatggtagatct
    ATGATTGAGAGTCCGACAGCAGC
    cz-ERG1-R ttctacaggacgtaaactagt
    CTAGTTCAATTCGCGCCACAT
    cz-ERG7-F agacatcaccatggtagatct
    ATGGTCGTCGAGAAGAAAGCG
    cz-ERG7-R ttctacaggacgtaaactagt
    TTACTCCTTGCCGCTGATGC
      注:小写字母代表线性化载体重叠序列。
      Note:The lowercase letters represent an overlapping sequence of linearized vector.
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    表  2  苯并烯氟菌唑处理条件下的CS23菌株转录组GO和KEGG分析

    Table  2  GO and KEGG analysis of differential genes of CS23 treated with benzovindiflupyr

    ID 描述
    Description
    q
    q-value
    GO terms
    GO:0031224 膜内在成分
    intrinsic component of membrane
    0.000089
    GO:0044425 膜部分
    membrane part
    0.009700
    GO:0016020
    Membrane
    0.010000
    GO:0071944 胞外
    cell periphery
    0.049000
    GO:0036387 Pre-RC 复合体
    pre-replicative complex
    0.049000
    GO:0003824 催化活性
    catalytic activity
    0.013000
    KEGG pathway
    ko00100 甾类化合物合成
    steroid biosynthesis
    0.000560
    ko00360 苯丙氨酸代谢
    phenylalanine metabolism
    0.001100
    ko01110 次级生物合成代谢
    biosynthesis of secondary
    metabolites
    0.002200
    ko00380 色氨酸代谢
    tryptophan metabolism
    0.002200
    ko00500 淀粉和蔗糖代谢
    starch and sucrose metabolism
    0.004000
    ko00040 戊糖和葡萄糖醛酸酯途径
    pentose and glucuronate
    interconversions
    0.022000
    ko02010 ABC 转运
    ABC transporters
    0.022000
    ko00052 半乳糖代谢
    galactose metabolism
    0.045000
      注:q值小于0.05代表显著富集。
      Note: The q-value < 0.05 indicates significant enrichment.
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    表  3  苯并烯氟菌唑处理条件下的CS23菌株麦角甾醇生物合成基因相对表达量

    Table  3  Relative expression of ergosterol biosynthesis gene in CS23 strain treated with benzovindiflupyr

    基因ID
    Gene ID
    基因名称
    Gene name
    转录组结果
    Transcriptome result
    荧光定量PCR结果
    qRT-PCR result
    ncbi_
    59275084
    ERG50.110.22±0.11
    ncbi_
    59276216
    cyp51a0.170.17±0.06
    ncbi_
    59275085
    ERG50.180.16±0.06
    ncbi_
    59266665
    ERG60.220.19±0.03
    ncbi_
    59271246
    ERG10.430.48±0.02
    ncbi_
    59267068
    cyp51b0.360.36±0.02
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    表  4  CS23菌株的10种甾醇类化合物GC-MS/MS鉴定结果

    Table  4  Identification results of 10 sterol compounds by GC-MS/MS

    序号
    No.
    中文名称
    Chinese name
    英文名称
    English name
    保留时间(min)
    Retention time(min)
    分子量
    Molecular weight
    分子式
    Molecular formula
    1 角鲨烯 Squalene 17.04 410.7180 C30H50
    2 羊毛甾醇 Lanosterol 24.23 426.7174 C30H50O
    3 4,4-二甲基胆甾-8,14,
    24-三烯醇
    4,4-dimethyl-cholesta-8,
    14,24-trienol
    25.21 410.6749 C29H46O
    4 4,4-二甲基酵母甾醇 4,4-dimethylzymosterol 22.74 412.6908 C29H48O
    5 4α-甲基酵母甾醇-
    4-羧酸酯
    4α-Methylzymosterol-4-
    carboxylate
    24.95 442.6737 C29H46O3
    6 酵母甾醇 Zymosterol 23.72 384.6377 C27H44O
    7 粪甾醇 Fecosterol 23.20 398.6642 C28H46O
    8 表甾醇 Episterol 23.40 398.6642 C28H46O
    9 麦角甾烯醇 Ergosta-5,7,24(28)-trienol 21.99 396.6484 C28H44O
    10 麦角甾醇 Ergosterol 22.60 396.6484 C28H44O
      注:甾醇类化合物的排序依据麦角甾醇生物合成通路的先后顺序,从1至10依次排列。
      Note: The sterol compounds are listed in the order of the ergosterol biosynthesis pathway, from 1 to 10.
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  • [1] 刘欢庆, 周双针, 高菁, 等. 暹罗炭疽菌同源异型盒转录因子CsHtf1的生物学功能[J]. 微生物学通报, 2023, 50(12): 5350 − 5362. doi:  10.13344/j.microbiol.china.230323
    [2] 芦志成, 张鹏飞, 李慧超, 等. 中国农药创制概述与展望[J]. 农药学学报, 2019, 21(5/6): 551 − 579. doi:  10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0086
    [3] 路粉, 王文桥. 我国蔬菜杀菌剂及其应用状况[J]. 中国蔬菜, 2017(10): 6 − 13. doi:  10.19928/j.cnki.1000-6346.2017.10.002
    [4] 马云云, 吴灿, 王兰芬, 等. 滇黄精炭疽病菌的初步鉴定及其对3种杀菌剂的敏感性[J]. 农药学学报, 2020, 22(5): 742 − 751. doi:  10.16801/j.issn.1008-7303.2020.0102
    [5] 毛玉帅, 段亚冰, 周明国. 琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂抗性研究进展[J]. 农药学学报, 2022, 24(5): 937 − 948. doi:  10.16801/j.issn.1008-7303.2022.0062
    [6] 魏阁, 高梦琪, 朱晓磊, 等. 靶向琥珀酸脱氢酶的酰胺类杀菌剂的研究进展[J]. 农药学学报, 2019, 21(5/6): 673 − 680. doi:  10.16801/j.issn.1008-7303.2019.0095
    [7] WANG Q, MAO Y S, LI S X, et al. Molecular mechanism of Sclerotinia sclerotiorum resistance to succinate dehydrogenase inhibitor fungicides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2022, 70(23): 7039 − 7048. doi:  10.1021/acs.jafc.2c02056
    [8] 仇是胜, 柏亚罗. 琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的研发进展(Ⅰ)[J]. 现代农药, 2014, 13(6): 1 − 7. doi:  10.3969/j.issn.1671-5284.2014.06.001
    [9] 柏亚罗. 琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)类杀菌剂研发进展及其重点产品评析[J]. 世界农药, 2022, 44(12): 6 − 25. doi:  10.16201/j.cnki.cn10-1660/tq.2022.12.02
    [10] REBELLO C S, BAGGIO J S, FORCELINI B B, et al. Sensitivity of Colletotrichum acutatum species complex from strawberry to fungicide alternatives to quinone-outside inhibitors[J]. Plant Disease, 2022, 106(8): 2053 − 2059. doi:  10.1094/PDIS-09-21-1934-RE
    [11] OLIVEIRA M S, CORDOVA L G, PERES N A. Efficacy and baseline sensitivity of succinate-dehydrogenase-inhibitor fungicides for management of Colletotrichum crown rot of strawberry[J]. Plant Disease, 2020, 104(11): 2860 − 2865. doi:  10.1094/PDIS-01-20-0083-RE
    [12] ISHII H, ZHEN F, HU M J, et al. Efficacy of SDHI fungicides, including benzovindiflupyr, against Colletotrichum species[J]. Pest Management Science, 2016, 72(10): 1844 − 1853. doi:  10.1002/ps.4216
    [13] ISHII H, WATANABE H, YAMAOKA Y, et al. Sensitivity to fungicides in isolates of Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum species complexes and efficacy against anthracnose diseases[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2022, 182: 105049. doi:  10.1016/j.pestbp.2022.105049
    [14] FRAAIJE B A, BAYON C, ATKINS S, et al. Risk assessment studies on succinate dehydrogenase inhibitors, the new weapons in the battle to control Septoria leaf blotch in wheat[J]. Molecular Plant Pathology, 2012, 13(3): 263 − 275. doi:  10.1111/j.1364-3703.2011.00746.x
    [15] LIANG X Y, ZOU L J, LIAN W X, et al. Comparative transcriptome analyses reveal conserved and distinct mechanisms of the SDHI fungicide benzovindiflupyr inhibiting Colletotrichum[J]. Phytopathology® , 2022, 112(6): 1255 − 1263. doi:  10.1094/PHYTO-10-21-0420-R
    [16] HOU Y P, CHEN Y L, WU L Y, et al. Baseline sensitivity of Bipolaris maydis to the novel succinate dehydrogenase inhibitor benzovindiflupyr and its efficacy[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2018, 149: 81 − 88. doi:  10.1016/j.pestbp.2018.06.002
    [17] 高杨杨. 琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂对炭疽病菌的毒力差异机制[D]. 泰安: 山东农业大学, 2021. doi: 10.27277/d.cnki.gsdnu.2021.000053
    [18] 黄慧, 王立, 胡志宏, 等. 培养基组分及培养条件对米曲霉麦角甾醇含量的影响[J]. 江西科技师范大学学报, 2021(6): 87 − 92. doi:  10.3969/j.issn.1007-3558.2021.06.017
    [19] 陈雨, 张文芝, 周明国. 氰烯菌酯对禾谷镰孢菌分生孢子萌发及菌丝生长的影响[J]. 农药学学报, 2007, 9(3): 235 − 239. doi:  10.3321/j.issn:1008-7303.2007.03.006
    [20] CAO Y X, SONG X N, XU G Y, et al. Study on the antifungal activity and potential mechanism of Natamycin against Colletotrichum fructicola[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2023, 71(46): 17713 − 17722. doi:  10.1021/acs.jafc.3c05154
    [21] JORDÁ T, PUIG S. Regulation of ergosterol biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae[J]. Genes, 2020, 11(7): 795. doi:  10.3390/genes11070795
    [22] UMEBAYASHI K, NAKANO A. Ergosterol is required for targeting of tryptophan permease to the yeast plasma membrane[J]. The Journal of Cell Biology, 2003, 161(6): 1117 − 1131. doi:  10.1083/jcb.200303088
    [23] MOURITSEN O G, JØRGENSEN K. Small-scale lipid-membrane structure: simulation versus experiment[J]. Current Opinion in Structural Biology, 1997, 7(4): 518 − 527. doi:  10.1016/S0959-440X(97)80116-9
    [24] HEESE-PECK A, PICHLER H, ZANOLARI B, et al. Multiple functions of sterols in yeast endocytosis[J]. Molecular Biology of the Cell, 2002, 13(8): 2664 − 2680. doi:  10.1091/mbc.e02-04-0186
    [25] SCHNEITER R, BRÜGGER B, SANDHOFF R, et al. Electrospray ionization tandem mass spectrometry (Esi-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species En route to the plasma membrane[J]. The Journal of Cell Biology, 1999, 146(4): 741 − 754. doi:  10.1083/jcb.146.4.741
    [26] NÜRNBERGER T, BRUNNER F, KEMMERLING B, et al. Innate immunity in plants and animals: striking similarities and obvious differences[J]. Immunological Reviews, 2004, 198(1): 249 − 266. doi:  10.1111/j.0105-2896.2004.0119.x
    [27] LAQUITAINE L, GOMÈS E, FRANÇOIS J, et al. Molecular basis of ergosterol-induced protection of grape against Botrytis cinerea: induction of type I LTP promoter activity, WRKY, and stilbene synthase gene expression[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions® , 2006, 19(10): 1103 − 1112. doi:  10.1094/MPMI-19-1103
    [28] 刘洪涛, 高平挥, 曹永兵, 等. 气-质联用研究氟康唑对白念珠菌甾醇生物合成的抑制作用[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 2002, 16(5): 368 − 371. doi:  10.3321/j.issn:1000-3002.2002.05.011
    [29] 王添琦, 李祥, 李玲, 等. 气质联用法定量分析白念珠菌中甾醇含量[J]. 药学实践杂志, 2013, 31(4): 277 − 279. doi:  10.3969/j.issn.1006-0111.2013.04.010
    [30] OUYANG Q L, TAO N G, JING G X. Transcriptional profiling analysis of Penicillium digitatum, the causal agent of citrus green mold, unravels an inhibited ergosterol biosynthesis pathway in response to citral[J]. BMC Genomics, 2016, 17(1): 599. doi:  10.1186/s12864-016-2943-4
    [31] 刘雪, 关丽杰. 苯丙烯菌酮对水稻稻瘟病病原真菌细胞壁膜的作用[J]. 江苏农业科学, 2019, 47(22): 117 − 121. doi:  10.15889/j.issn.1002-1302.2019.22.026
    [32] HU Z H, HE B, MA L, et al. Recent advances in ergosterol biosynthesis and regulation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae[J]. Indian Journal of Microbiology, 2017, 57(3): 270 − 277. doi:  10.1007/s12088-017-0657-1
    [33] HAYAKAWA H, SOBUE F, MOTOYAMA K, et al. Identification of enzymes involved in the mevalonate pathway of Flavobacterium johnsoniae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017, 487(3): 702 − 708. doi:  10.1016/j.bbrc.2017.04.120
    [34] 刘凤华, 马迪成, 张晓敏, 等. 植物病原真菌对甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂抗性分子机制研究进展[J]. 农药学学报, 2022, 24(3): 452 − 464. doi:  10.16801/j.issn.1008-7303.2022.0008
    [35] HOFFMEISTER M, ZITO R, BÖHM J, et al. Mutations in Cyp51 of Venturia inaequalis and their effects on DMI sensitivity[J]. Journal of Plant Diseases and Protection, 2021, 128(6): 1467 − 1478. doi:  10.1007/s41348-021-00516-0
    [36] TURK M, PLEMENITAŠ A, GUNDE-CIMERMAN N. Extremophilic yeasts: plasma-membrane fluidity as determinant of stress tolerance[J]. Fungal Biology, 2011, 115(10): 950 − 958. doi:  10.1016/j.funbio.2011.04.006
  • [1] 李鹏声, 刘锦霖, 杨叶.  芒果蒂腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)对苯醚甲环唑代谢抗性生化机制的研究 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240023
    [2] 赵志浩, 王倩男.  胶孢炭疽菌羧肽酶Y抑制蛋白CgPEB的功能初探 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250016
    [3] 刘良旺, 臧彧伟, 冉方芳, 闵义, 王大勇.  FtsZ靶向多肽抑制剂的分子对接、分子动力学分析及抗菌活性评价 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.03.004
    [4] 于燕燕, 夏影影, 吴可建, 占昭宏, 陶均.  XppI调控水稻白叶枯病菌致病力的潜在机制 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230024
    [5] 徐鑫泽, 施泽坤, 纪晓贝, 李志刚, 李潇, 刘文波, 林春花, 缪卫国.  橡胶树炭疽菌孢子的拉曼光谱特征及其在聚类分析中的应用 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.014
    [6] 董林朋, 殷金瑶, 赵文渊, 林春花, 刘文波, 缪卫国, 李潇.  启动子WY172和WY195在暹罗炭疽菌中的活性研究 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20220074
    [7] 贺竞锋, 刘先宝, 李博勋, 蔡吉苗, 冯艳丽, 黄贵修.  橡胶树不同种群炭疽菌对杀菌剂的敏感性 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.06.007
    [8] 陈帅, 裴跃斌, 王康欣, 周海龙, 李元超.  苯并[a]芘胁迫对3种石珊瑚虫黄藻密度及叶绿素a含量的影响 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.002
    [9] 汪玉玲, 宋希强, 郭向阳, 王洪星, 郭梨锦.  文心兰炭疽病生防潜力菌的鉴定及其抑菌性的测定 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.013
    [10] 雷健, 吴远航, 赵兴坤, 蒋凌雁, 刘攀道, 罗丽娟.  炭疽菌侵染对柱花草叶片生理生化的影响 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.03.005
    [11] 段灵涛, 祝一鸣, 何九卿, 舒灿伟, 周而勋.  真菌细胞自噬的研究进展 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.015
    [12] 林春花, 张宇, 刘文波, 李潇, 缪卫国.  我国巴西橡胶树炭疽病的研究进展 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.03.018
    [13] 张晓凯, 刘剑南, 徐成滨, 张业扬, 孙明凯, 范咏梅.  氟硅唑对丰年虫急性毒性及氧化应激的影响 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2019.02.007
    [14] 曾纪锋, 蒲文渊, 郭桂英, 杨诺, 侯国锋, 郑继平.  暹罗鳄致病性嗜水气单胞菌嗜水亚种的分离鉴定 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.02.002
    [15] 李森楠, 刁晓平, 王海花, 龚莹.  赤子爱胜蚓肠道中苯并[a]芘降解菌BJ-1的分离鉴定及其降解能力的测定 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.02.005
    [16] 李秀竹, 陈婷婷, 刘佳怡, 宋海超, 史学群.  肉桂精油主要活性成分对芒果胶孢炭疽菌的抑制 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.01.011
    [17] 杨鑫鑫, 潘秋红.  油菜素甾醇分析方法概述及其在果实中的应用 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2016.01.024
    [18] 万正平, 王梅芳, 李双波, 余祥勇.  苯佐卡因和乙二醇苯醚对企鹅珍珠贝麻醉效果的研究 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2012.01.018
    [19] 邱晓聪, 李松刚, 谢艺贤, 占魏, 张贺, 陆英.  不同杀菌剂对荔枝胶孢炭疽菌的室内抑菌效果测定 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2012.03.006
    [20] 李传代.  女贞ISSR分子标记的引物筛选 . 热带生物学报, doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2010.02.013
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    出版历程
    • 收稿日期:  2025-03-26
    • 录用日期:  2025-06-06
    • 修回日期:  2025-06-05

    苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇生物合成的机制初探

    doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
      基金项目:  海南省“南海新星”科技创新人才平台项目(NHXXRCXM202310);“崖州湾”菁英人才科技专项项目(SCKJ-JYRC-2023-22);国家自然科学基金地区基金(32160654)。
      作者简介:

      简沙沙(1998—),女,海南大学热带农林学院2022级硕士研究生。Email:shashajian666@163.com

      通讯作者: 梁晓宇(1989—),男,副教授,博士生导师,主要研究方向:热带作物病害防治。Email:liang2017@hainanu.edu.cn

    摘要: 酰胺类杀菌剂凭借多样的化学结构和广泛的靶点,已成为农药研发的关键领域。然而,不同酰胺类杀菌剂在同一病原菌上的毒力差异尚未充分阐明,限制了其优化和应用。其中,苯并烯氟菌唑作为一种新型琥珀酸脱氢酶抑制剂(Succinate dehydrogenase inhibitor,SDHI),表现出对炭疽菌的显著抑制效果,尤其是通过显著破坏细胞膜完整性展现了不同于传统SDHI类杀菌剂的机制。本研究旨在进一步探讨苯并烯氟菌唑的分子机制,揭示其对暹罗炭疽菌的多重抑制途径。通过转录组KEGG富集分析,发现苯并烯氟菌唑显著抑制了暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)的甾类化合物合成途径。荧光定量PCR进一步验证了麦角甾醇合成途径中ERG1、cyp51a等关键基因表达显著下降。气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)分析显示,苯并烯氟菌唑处理后,暹罗炭疽菌的角鲨烯和麦角甾醇含量显著降低,羊毛甾醇含量增加。构建ERG1等5个麦角甾醇合成基因过表达菌株后,发现ERG1过表达菌株对苯并烯氟菌唑的敏感性显著降低,其他过表达菌株与野生型CS23菌株的药敏性一致。此外,外源添加角鲨烯和麦角甾醇显著降低了苯并烯氟菌唑的抑菌效果,尤其是在添加100 μg·mL−1麦角甾醇时,苯并烯氟菌唑对CS23菌株的抑制率降至25.18%,对ERG1-OE1菌株则无抑制作用。综上所述,苯并烯氟菌唑可能通过抑制ERG1基因的表达,阻碍麦角甾醇的合成,从而破坏暹罗炭疽菌的细胞膜,最终抑制其菌丝生长。本研究初步揭示了苯并烯氟菌唑对炭疽菌的分子作用机制,为新型酰胺类杀菌剂的研发提供了理论依据。

    English Abstract

    简沙沙,蒙亚玲,邱煜荣,等. 苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇生物合成的机制初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−10. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
    引用本文: 简沙沙,蒙亚玲,邱煜荣,等. 苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇生物合成的机制初探[J]. 热带生物学报,2025, 16(0):1−10. doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052 doi:  10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
    JIAN Shasha, MENG Yaling, QIU Yurong, WANG Meng, ZHANG Yu, YANG Ye, LIANG Xiaoyu. Molecular Mechanism of Benzovindiflupyr Inhibiting Ergosterol Biosynthesis in Colletotrichum siamense[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
    Citation: JIAN Shasha, MENG Yaling, QIU Yurong, WANG Meng, ZHANG Yu, YANG Ye, LIANG Xiaoyu. Molecular Mechanism of Benzovindiflupyr Inhibiting Ergosterol Biosynthesis in Colletotrichum siamense[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250052
    • 炭疽菌是具有重要经济价值的植物病原体,危害包括林木、蔬菜和花卉等多种植物。炭疽菌种类繁多,遗传多态性丰富,其中胶孢炭疽菌是最为常见的致病种之一。暹罗炭疽菌是胶胞炭疽菌复合群下的一个种,是我国多种作物炭疽病的田间优势病原种[1]。目前化学防治是控制该类病害最常用的方法,常用药剂以主要是由代森类杀菌剂、麦角甾醇生物合成抑制剂(DMI 类)、甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂(QoI 类)组成的单剂或混剂产品[24]。但长期单一药剂的使用导致抗性问题愈加突出,寻找新途径防治炭疽病势在必行。

      酰胺类杀菌剂是一类古老的杀菌剂,已有近半个世纪的使用历史,数量约占杀菌剂总数的四分之一,且不断有新产品上市。酰胺类杀菌剂包含苯基酰胺、羧酸酰胺、吡啶酰胺和吡唑酰胺等多种类型的化合物,其作用靶标涵盖了RNA聚合酶、纤维素合成酶、琥珀酸脱氢酶和麦角甾醇合成酶等关键催化酶,是杀菌剂研发的焦点。2000年后上市的酰胺类杀菌剂结构新颖、活性高,已被广泛用于大田作物和经济作物病害的防治[5]。其中以吡唑酰胺类杀菌剂最多,主要包括苯并烯氟菌唑、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺、联苯吡菌胺和氟唑菌酰胺等;其次是吡啶酰胺类杀菌剂,主要包括啶酰菌胺和氟吡菌酰胺等[6]。这些酰胺类杀菌剂被公认的作用机制是抑制病原菌的琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase, SDH),因此它们也被称为琥珀酸脱氢酶抑制剂(Succinate dehydrogenase inhibitor, SDHI)[7]

      SDHI类杀菌剂具有高效、广谱、选择性强等优势,兼具预防和治疗作用。对多种病原菌孢子萌发、芽管伸长、菌丝体生长等各阶段抑制作用显著。常用于谷物、蔬菜、果树等多种作物及草坪,防治由灰葡萄孢菌、镰刀菌、白粉菌、链格孢菌、丝核菌、尾孢菌等病原菌引起的病害[8, 9]。但大部分的SDHI类杀菌剂不能用于防治炭疽病,对炭疽菌属(Colletotrichum)的抑制效果很差[10,11]。Ishi 等首次研究发现 SDHI 类杀菌剂对炭疽菌抑菌活性差异较大,啶酰菌胺、氟唑菌酰胺和氟吡菌酰胺对炭疽菌无离体抑菌活性,活体防效较差。吡噻菌胺对于大多数炭疽菌离体抑菌活性较好,但活体防效一般[12]。苯并烯氟菌唑由先正达公司于2003年开发,2012年上市,是一种广谱杀菌剂,具有优异的抑菌活性,在防治多种作物炭疽病方面表现出卓越效果[13]。多数SDHI类杀菌剂对炭疽菌的EC50值均大于100 μg·mL−1,苯并烯氟菌唑对所有炭疽菌测试菌株的EC50值不大于0.2 μg·mL−1;多数SDHI类杀菌剂无法抑制炭疽菌分生孢子的萌发和芽管伸长,苯并烯氟菌唑抑制孢子萌发的EC50值均小于8.2 μg·mL−1,0.1 μg·mL−1浓度即可显著抑制菌体分生孢子的芽管伸长[12]。因此,除SDH酶靶标结合机制外[14],苯并烯氟菌唑等SDHI类杀菌剂对炭疽菌毒力差异的产生可能还其他作用机制。本研究前期发现,苯并烯氟菌唑可以显著破坏暹罗炭疽菌的细胞膜,导致菌体电解质外泄[15]。这种药剂的作用方式得到了其他研究数据的支持,如Hou等的透射电镜和细胞膜电导率实验结果表明,苯并烯氟菌唑可以破坏玉米小斑病菌的细胞膜[16]。高杨杨研究发现苯并烯氟菌唑具有优异的膜渗透性能,对胶孢炭疽菌和灰霉菌的膜渗透率均显著大于其他SDHI类杀菌剂[17],这可能是由于该药剂易破坏细胞膜从而顺利进入菌体内部。麦角甾醇是真菌生物膜的特异性组分,对保持细胞膜完整性和流动性具有重要作用。麦角甾醇合成途径复杂,催化酶种类众多,合成中间产物多样,研究麦角甾醇合成通路有利于探明真菌麦角甾醇生物合成的分子调控机制,为改善现有杀菌剂的化学结构奠定理论基础。

      本研究以橡胶树暹罗炭疽菌为研究对象,开展苯并烯氟菌唑处理下的转录调控分析,重点聚焦其对麦角甾醇合成通路的抑制作用;通过气相色谱-质谱联用(GC-MS/MS)分析,明确了苯并烯氟菌唑对麦角甾醇合成前体种类及其含量的影响;通过基因过表达技术验证了关键合成酶的功能,初步揭示了苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇合成的分子机制。该研究为炭疽病防治新药剂的筛选提供了理论依据。

      • 橡胶树暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)CS23菌株由本实验室分离鉴定并保存。

      • 99.99%苯并烯氟菌唑原药由德国Dr. Ehrenstorfer公司提供,丙酮溶解并配制成10000 μg·mL−1的储备液,于4 ℃保存。96.4%麦角甾醇标准品和99.7%角鲨烯标准品由坛墨质检科技股份有限公司提供。90%羊毛甾醇、99%胆固醇由上海源叶生物科技有限公司提供。

      • PDB培养基由马铃薯200 g煮沸滤取的浸出液和葡萄糖20 g组成;PDA培养基在PDB基础上加入琼脂粉20 g以用于平板培养。YCS培养基包括上层、下层及液体培养基:上层培养基含酵母提取物1 g、酸水解酪蛋白1 g、葡萄糖10 g和琼脂粉10 g;下层培养基含酸水解酪蛋白1 g、酵母提取物1 g、蔗糖342 g和琼脂粉12 g;YCS液体培养基由蔗糖342 g和酸水解酪蛋白1 g组成,三者均定容至1000 mL。所有培养基均在121 ℃高压灭菌20 min后使用。

      • 药剂处理:将CS23菌株于PDA平板上28 ℃活化培养3 d后,取直径5 mm的菌饼置于100 mL PDB液体培养基中,以28 ℃和180 rpm条件下摇床培养36 h。根据前期研究,选择 5 μg·mL−1 苯并烯氟菌唑作为处理浓度,加入后继续培养 36 h[15]。使用无菌水作为空白对照。滤干菌丝多余水分,称取等量菌丝置真空冷冻干燥器干燥备用。

        皂化法提取甾类化合物:参考黄慧等醇碱皂化法提取米曲霉麦角甾醇[18],并在此基础上改进。称取300 mg冻干菌丝,加入皂化剂氢氧化钾-甲醇溶液(60 g/L),在70 ℃皂化2 h。用3倍的正己烷萃取3次,合并提取液,旋转蒸发正己烷浓缩得到不可皂化脂质,加入二氯甲烷使溶液体积为1 mL,−20 ℃保存。

      • 定性方法:采用美国国家标准与技术研究院(National institute of standards and technology, NIST)谱库检索并结合甾醇类化合物的质谱裂解规律进行定性分析。

        定量方法:采用胆固醇内标法进行定量。将与麦角甾醇具有相似结构的外源物质胆固醇溶解于二氯甲烷中,配制成12.5、25、50、100、200 μg·mL−1的胆固醇标准液。然后,将胆固醇标准液加入提取液中,作为内标物质。通过GC-MS/MS对样品进行检测,建立标准曲线为y=461.95x−7856.1,R2=0.9916,最低检出限为0.01 μg·mL−1,用于其他甾醇类化合物的定量分析。

      • 色谱条件:TG-5ILMS型气相色谱柱(30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm);进样口温度230 ℃;恒流模式;不分流进样;进样体积1 μL。程序升温:初始温度为80 ℃(保持2 min),以30 ℃/min升至250 ℃(保持5 min),以35 ℃/min升至300 ℃(保持2 min)。载气为高纯氦气(99.999%)。

        质谱条件:电子轰击离子源(EI);离子源温度300 ℃;传输线温度250 ℃;溶剂延迟时间3 min;Full Scan 模式扫描,质子数/电荷数(m/z)比值监测范围50~500。

      • 将活化好的CS23菌株挑取5个菌饼转入终浓度为1 μg·mL−1苯并烯氟菌唑PDB培养基中,恒温摇床28 ℃、140 rpm培养3 d,以无添加药剂为空白对照。用滤纸过滤菌丝并用无菌水清洗,将吸干水分的菌丝体转移至研钵中加入液氮速冷,并迅速研磨至粉末状,取500 mg磨碎后的菌丝样品至2.0 mL无酶离心管中采用Trizol法提取RNA,方法参考天根总RNA提取试剂盒说明书。核酸浓度分析仪检测RNA合格后寄样送转录组测序。RNA-seq数据已上传至NCBI数据库,登录号为PRJNA744009[15]。使用倍数变化 ≥ 2 且 p 值 < 0.05 作为筛选标准,以识别不同组别之间的差异表达基因。

      • 采取同源重组的策略,将目的基因 cDNA 序列引入pCAMBIA1303过表达载体中。从CS23菌株中提取总RNA,经反转录合成cDNA文库,以cDNA为模板使用表1中特异性引物分别PCR扩增ERG1、ERG7、cyp51acyp51b基因。采用ClonExpres无缝克隆技术,将纯化得到的目的基因片段连入酶切线性pCAMBIA1303载体质粒。连接体系为:线性化载体4.5 μL,目的基因片段0.5 μL,2 × ClonExpress Mix 5 μL,ddH2O补足 10 μL PCR仪50 ℃反应15 min。重组转化步骤参考ClonExpress® Ultra One Step Cloning Kit试剂盒说明书(诺唯赞)。菌落PCR扩增并测序以验证阳性单克隆,阳性转化子加入甘油后置于−80 ℃保存。

        表 1  本研究使用的引物

        Table 1.  Primer used in this study

        引物名称
        Primer name
        引物序列
        Primer sequences
        KL-CDS-cyp51b-F1 ATGGGTCTCCTGCAGGAGGT
        KL-CDS-cyp51b-R1 TTACGCCTCACGCTTCTCCC
        KL-CDS-cyp51a-F1 ATGAGCCCTCTCGTTGTCTATGG
        KL-CDS-cyp51a-R1 TCAATCACGTCGGGTCCACC
        KL-CDS-ERG1-F1 ATGATTGAGAGTCCGACAGCAGC
        KL-CDS- ERG1-R1 CTAGTTCAATTCGCGCCACAT
        KL-CDS-ERG7-F1 ATGGTCGTCGAGAAGAAAGCG
        KL-CDS-ERG7-R1 TTACTCCTTGCCGCTGATGC
        qp-cyp51a-F ACGTCGCAAGAACGGTGATA
        qp-cyp51a-R CTGACCTCCCATGAGAAGCG
        qp-cyp51b-F TGGAACAAGAAGCGCGATCA
        qp-cyp51b-R GTGCCGTTCTTGTAGGTGGA
        qp- ERG1-F GGCAAGACGAAGGACGACTA
        qp- ERG1-R GGAGGTACTCCTTGCGGAAC
        qp-ERG7-F TGCAAGGACTCGGACAAGTG
        qp-ERG7-R TGAGCGCCTCCGAAATACAG
        qp-β2-tubulin-F AGCCCTACAACGCCACTCTCT
        qp-β2-tubulin-R GTGGTTCAGGTCGCCGTAAG
        qp-ERG5-3F TCACGCCGAACTACACTGTCC
        qp-ERG5-3R ACATATCTTCGCGCAAGGCAA
        qp-ERG5-2F AATTCGTCGTTCTTGCATCCG
        qp-ERG5-2R CTTCGATACTCTGCGTGGTC
        qp-ERG6-2-F ATCAGACAGGCTCGTACAGCA
        qp -ERG6-2-R TGCCACCCTTGAGTCCCAT
        1303-F TTTGAACCTTTCAGTTCGAGCTTT
        1303-R CTGAATGCCCACAGGCC
        cz-cyp51b-F agacatcaccatggtagatct
        ATGGGTCTCCTGCAGGAGGT
        cz-cyp51b-R ttctacaggacgtaaactagt
        TTACGCCTCACGCTTCTCCC
        cz-cyp51a-F agacatcaccatggtagatct
        ATGAGCCCTCTCGTTGTCTATGG
        cz-cyp51a-R ttctacaggacgtaaactagt
        TCAATCACGTCGGGTCCACC
        cz-ERG1-F agacatcaccatggtagatct
        ATGATTGAGAGTCCGACAGCAGC
        cz-ERG1-R ttctacaggacgtaaactagt
        CTAGTTCAATTCGCGCCACAT
        cz-ERG7-F agacatcaccatggtagatct
        ATGGTCGTCGAGAAGAAAGCG
        cz-ERG7-R ttctacaggacgtaaactagt
        TTACTCCTTGCCGCTGATGC
          注:小写字母代表线性化载体重叠序列。
          Note:The lowercase letters represent an overlapping sequence of linearized vector.
      • 将CS23菌株和过表达菌株ERG1-OE1、ERG7-OE1、cyp51a-OE1、cyp51b-OE1在PDA平板上于28 ℃活化培养3 d后取直径5 mm菌饼置于含有100 mL PDB液体培养基锥形瓶中28 ℃和180 rpm下振荡培养。每个菌株设置3个生物学重复。药剂处理:摇培36 h后向培养基中加入苯并烯氟菌唑使其终浓度为5 μg·mL−1,继续摇培36 h。滤干菌丝多余水分,采用Trizol法提取RNA以β2-tubulin基因为内参基因比较不同条件下的基因表达式,使2−ΔΔCt方法计算每个基因的相对表达水平。基因表达量的相对标准偏差(RSD)均小于15%,数据以均值±SD形式呈现。

      • 采用菌丝生长速率法测定菌株的药敏性[19]。向灭菌后的PDA培养基中加入苯并烯氟菌唑储备液,使其终浓度为0.1 μg·mL−1和0.05 μg·mL−1。将暹罗炭疽菌基因过表达菌株ERG1-OE1、ERG7-OE1、cyp51a-OE1、cyp51b-OE1在PDA平板上于28 ℃活化培养3 d后,从菌落边缘打取直径5 mm的菌饼,分别接种于含不同浓度苯并烯氟菌唑的PDA平板中央,每浓度设3个重复,于28 ℃培养5 d后,采用十字交叉法测量各处理的菌落直径,计算菌丝生长抑制率并使用SPSS 22.0进行统计分析,确保结果可靠性。每个处理3次重复。

      • 方法参考Cao 等[20]稍作修改,PDA培养基中加入苯并烯氟菌唑储备液,使其终浓度为0.1 μg·mL−1。同时,加入适量麦角甾醇和角鲨烯母液形成不同浓度的药剂外源物质组合。将CS23菌株及过表达菌株分别接种于PDA平板正中央28 ℃培养5 d后,采用十字交叉法测量各处理的菌落直径,同1.2.5计算不同外源组合物质对过表达菌株的菌丝生长抑制率。每个处理3次重复。

      • 为了探究苯并烯氟菌唑对破坏暹罗炭疽菌的细胞膜完整性的分子作用机制,本研究对苯并烯氟菌唑处理条件下的CS23菌株进行转录组分析。以药剂未处理的CS23菌株转录组为对照,使用倍数变化≥ 2 且 p 值 < 0.05 为显著差异分析GO途径和KEGG富集通路(表2),发现在苯并烯氟菌唑处理组的差异基因显著富集在细胞膜相关途径(0031224; 0044425; 0016020)和甾类化合物合成通路(ko00100)中。尤其是在麦角甾醇合成通路中,有6个关键基因表达显著下调,相对表达量在0.11~0.43之间。另外,通过荧光定量PCR技术分析了这些基因的表达量,发现表达趋势与转录组数据一致,相对表达量在0.16~0.48之间(表3)。上述结果表明,苯并烯氟菌唑可能通过抑制麦角甾醇的生物合成来破坏暹罗炭疽菌的细胞膜完整性。

        表 2  苯并烯氟菌唑处理条件下的CS23菌株转录组GO和KEGG分析

        Table 2.  GO and KEGG analysis of differential genes of CS23 treated with benzovindiflupyr

        ID 描述
        Description
        q
        q-value
        GO terms
        GO:0031224 膜内在成分
        intrinsic component of membrane
        0.000089
        GO:0044425 膜部分
        membrane part
        0.009700
        GO:0016020
        Membrane
        0.010000
        GO:0071944 胞外
        cell periphery
        0.049000
        GO:0036387 Pre-RC 复合体
        pre-replicative complex
        0.049000
        GO:0003824 催化活性
        catalytic activity
        0.013000
        KEGG pathway
        ko00100 甾类化合物合成
        steroid biosynthesis
        0.000560
        ko00360 苯丙氨酸代谢
        phenylalanine metabolism
        0.001100
        ko01110 次级生物合成代谢
        biosynthesis of secondary
        metabolites
        0.002200
        ko00380 色氨酸代谢
        tryptophan metabolism
        0.002200
        ko00500 淀粉和蔗糖代谢
        starch and sucrose metabolism
        0.004000
        ko00040 戊糖和葡萄糖醛酸酯途径
        pentose and glucuronate
        interconversions
        0.022000
        ko02010 ABC 转运
        ABC transporters
        0.022000
        ko00052 半乳糖代谢
        galactose metabolism
        0.045000
          注:q值小于0.05代表显著富集。
          Note: The q-value < 0.05 indicates significant enrichment.

        表 3  苯并烯氟菌唑处理条件下的CS23菌株麦角甾醇生物合成基因相对表达量

        Table 3.  Relative expression of ergosterol biosynthesis gene in CS23 strain treated with benzovindiflupyr

        基因ID
        Gene ID
        基因名称
        Gene name
        转录组结果
        Transcriptome result
        荧光定量PCR结果
        qRT-PCR result
        ncbi_
        59275084
        ERG50.110.22±0.11
        ncbi_
        59276216
        cyp51a0.170.17±0.06
        ncbi_
        59275085
        ERG50.180.16±0.06
        ncbi_
        59266665
        ERG60.220.19±0.03
        ncbi_
        59271246
        ERG10.430.48±0.02
        ncbi_
        59267068
        cyp51b0.360.36±0.02
      • 为了进一步明确苯并烯氟菌唑对麦角甾醇生物合成通路的作用机制,本研究利用GC-MS/MS技术分析了暹罗炭疽菌的麦角甾醇生物合成途径中的中间体组成,根据甾醇类化合物的代谢规律以及NIST质谱库检索分析,鉴定出10种甾醇类化合物,按照麦角甾醇合成路线顺序依次是角鲨烯、羊毛甾醇、4,4-二甲基胆甾-8, 14,24-三烯醇、4,4-二甲基酵母甾醇、酵母甾醇、4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯、粪甾醇、表甾醇、麦角甾烯醇、麦角甾醇(表4)。以未处理组为对照,本研究分析了苯并烯氟菌唑对暹罗炭疽菌中10种甾醇类化合物含量的影响。定量结果显示,在两组处理的菌丝中均检测到10种甾醇类化合物,其中角鲨烯、羊毛甾醇、4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯和麦角甾醇的含量在两组之间存在显著差异。苯并烯氟菌唑处理后,4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯和麦角甾醇的含量显著降低,而羊毛甾醇的含量则显著升高(图1)。结果表明,苯并烯氟菌唑可影响暹罗炭疽菌体内麦角甾醇生物合成中间体的含量,最终影响麦角甾醇的生物合成

        表 4  CS23菌株的10种甾醇类化合物GC-MS/MS鉴定结果

        Table 4.  Identification results of 10 sterol compounds by GC-MS/MS

        序号
        No.
        中文名称
        Chinese name
        英文名称
        English name
        保留时间(min)
        Retention time(min)
        分子量
        Molecular weight
        分子式
        Molecular formula
        1 角鲨烯 Squalene 17.04 410.7180 C30H50
        2 羊毛甾醇 Lanosterol 24.23 426.7174 C30H50O
        3 4,4-二甲基胆甾-8,14,
        24-三烯醇
        4,4-dimethyl-cholesta-8,
        14,24-trienol
        25.21 410.6749 C29H46O
        4 4,4-二甲基酵母甾醇 4,4-dimethylzymosterol 22.74 412.6908 C29H48O
        5 4α-甲基酵母甾醇-
        4-羧酸酯
        4α-Methylzymosterol-4-
        carboxylate
        24.95 442.6737 C29H46O3
        6 酵母甾醇 Zymosterol 23.72 384.6377 C27H44O
        7 粪甾醇 Fecosterol 23.20 398.6642 C28H46O
        8 表甾醇 Episterol 23.40 398.6642 C28H46O
        9 麦角甾烯醇 Ergosta-5,7,24(28)-trienol 21.99 396.6484 C28H44O
        10 麦角甾醇 Ergosterol 22.60 396.6484 C28H44O
          注:甾醇类化合物的排序依据麦角甾醇生物合成通路的先后顺序,从1至10依次排列。
          Note: The sterol compounds are listed in the order of the ergosterol biosynthesis pathway, from 1 to 10.

        图  1  苯并烯氟菌唑处理后菌株体内10种甾醇中间体的含量

        Figure 1.  The content of 10 sterol intermediates in the strain after treatment with benzovindiflupyr

      • 参考真菌麦角甾醇合成途径[21],结合苯并烯氟菌唑对麦角甾醇合成中间体及编码基因的抑制作用,我们筛选出可能受药剂作用的四个催化酶基因,分别为ERG1、ERG7、cyp51acyp51b。本研究成功构建了这四个基因的暹罗炭疽菌过表达菌株,并与野生型菌株CS23进行了荧光定量分析。结果表明,过表达菌株的基因表达量均显著高于CS23菌株,表达水平提高了1.7至3.1倍(图2A)。此外,我们进一步测定了这些过表达菌株对苯并烯氟菌唑的药敏性。结果显示,与CS23菌株相比,ERG1基因的过表达菌株ERG1-OE1对苯并烯氟菌唑的敏感性降低了7.6~8.9%,而其他过表达菌株与CS23菌株无显著差异(图2B)。这表明,苯并烯氟菌唑可能通过抑制CS23菌株中ERG1基因的表达,从而影响麦角甾醇的生物合成。

        图  2  过表达菌株的基因相对表达量(A)和对苯并烯氟菌唑的药敏性(B)

        Figure 2.  The relative gene expression of the overexpression strains(A)and their sensitivity to benzovindiflupyr(B)

      • 以未添加组为对照,研究外源添加角鲨烯和麦角甾醇条件下,苯并烯氟菌唑对CS23菌株及ERG1-OE1菌株菌丝生长抑制率的影响。结果表明,0.1 μg·mL−1苯并烯氟菌唑处理后2~5天内,菌丝生长抑制率逐渐降低,外源添加不同浓度角鲨烯和麦角甾醇显著降低了药剂对两个菌株的抑制率,尤其在第5天时,100 μg·mL−1麦角甾醇处理下,苯并烯氟菌唑对CS23菌株的抑制率仅为25.18%,对ERG1-OE1则无抑制效果(图3)。由此可见,外源添加角鲨烯和麦角甾醇能显著降低苯并烯氟菌唑对暹罗炭疽菌的生长抑制作用。

        图  3  外源添加角鲨烯和麦角甾醇条件下苯并烯氟菌唑的抑菌效果

        Figure 3.  The inhibitory effect of benzovindiflupyr under the conditions of exogenous addition of squalene and ergosterol

      • 酰胺类杀菌剂苯并烯氟菌唑在防治多种作物炭疽病方面展现出独特优势,能够有效抑制炭疽菌的菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长[1113]。因此,Ishii等人提出,除了SDH酶靶标结合机制外,可能还存在其他作用机制,导致苯并烯氟菌唑等SDHI类杀菌剂对炭疽菌的毒力差异[12]。然而,该现象背后的具体作用机制尚未完全阐明。本研究对苯并烯氟菌唑处理下的暹罗炭疽菌进行转录组分析,发现差异基因显著富集细胞膜相关途径和甾类化合物合成通路。尤其是在麦角甾醇合成通路中,有6个关键基因表达差异显著,相对表达量在0.11~0.43之间。经荧光定量PCR技术验证,这些基因表达趋势与转录组数据一致。

        麦角甾醇又称麦角固醇,是一种类异戊二烯的准平面分子,是真菌细胞膜上特有的甾醇类组分。麦角甾醇是真菌细胞膜的关键成分,参与质膜融合、胞间运输等多种生物过程[2224]。此外,麦角甾醇还存在于线粒体、液泡、内质网等多种内膜结构中,对胞内信号传递、物质运输、遗传等生物学过程意义重大[2527]。本研究建立了GC-MS/MS技术,用于分析麦角甾醇生物合成途径中的甾醇组分及其含量,并推测苯并烯氟菌唑可能作用的关键合成酶。在真菌甾醇组分的分析中,尽管已有多项研究采用GC-MS进行定性和定量分析并取得了良好效果,但该方法仍需进行衍生化处理[2830]。本研究中提取的不可皂化脂质无需衍生化处理,可直接通过GC-MS/MS进行分离,获得更精确的母离子分子量,对甾醇组分进行定性和定量分析。在检测的十种甾醇组分中,角鲨烯、羊毛甾醇、4α-甲基酵母甾醇-4-羧酸酯和麦角甾醇的含量在不同处理间显著变化。结果表明,苯并烯氟菌唑显著作用于暹罗炭疽菌的麦角甾醇生物合成通路,这与转录组分析及GO和KEGG富集分析的结果一致。

        多项研究表明,阻断或破坏麦角甾醇合成途径中的任意一步,都会导致中间代谢产物增加或最终麦角甾醇合成量减少[3133]。苯并烯氟菌唑可能抑制炭疽菌中的角鲨烯环氧化酶,且其作用靶标有别于麦角甾醇类杀菌剂[34, 35]。为进一步验证角鲨烯环氧化酶的作用,本研究通过基因过表达技术构建了过表达菌株。结果显示,与CS23菌株相比,编码角鲨烯环氧化酶的ERG1基因过表达菌株ERG1-OE1对苯并烯氟菌唑的敏感性显著降低,说明苯并烯氟菌唑可能会抑制角鲨烯环氧化酶的活性。此外,外源添加角鲨烯和麦角甾醇后,暹罗炭疽菌对苯并烯氟菌唑的药敏性显著降低,表明外源角鲨烯和麦角甾醇的添加增加了菌体内麦角甾醇的含量,可能通过减弱药剂对细胞膜完整性的破坏作用,降低了其抑制效果[36]

        综上所述,苯并烯氟菌唑不仅通过靶向SDH酶发挥作用,还能够抑制麦角甾醇合成酶相关基因的表达,从而阻断麦角甾醇合成途径,展现出多重作用机制。其中,ERG1基因的显著变化与中间代谢产物的积累及药敏性的改变密切相关,可能是苯并烯氟菌唑的关键作用靶标之一。本项研究的意义在于初步揭示了苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌的分子机制,为炭疽病防治新药剂的筛选与应用提供了重要的理论依据。然而,本研究虽然利用基因过表达技术验证了关键合成酶的功能,但仍存在一定的实验局限性,尤其是药剂与靶标酶的直接结合尚需进一步实验证据。为克服上述局限,后续研究将通过酶活性测定、分子对接和基因敲除等实验方法,进一步验证和完善本研究的预测结果。这将有助于进一步揭示苯并烯氟菌唑抑制暹罗炭疽菌麦角甾醇合成的分子机制,为新型酰胺类杀菌剂的研发提供理论依据。

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