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木麻黄(Casuarina equisetifolia)原产于澳大利亚,是一种速生的防风常绿乔木[1],在我国沿海地区主要用于防风固沙。海南岛位于我国南海北部,因其特殊的地理位置,常遭受台风的侵袭。因此,海南岛从20世纪50年代开始大规模种植木麻黄,通过营造木麻黄人工海防林,全岛风沙问题得到了基本解决。目前,木麻黄已经成为海南防护林建设中的重要树种之一[2],但以木麻黄为主的海防林容易遭受灵芝属(Ganoderma)病原木腐菌的侵染,常引起其发生茎腐或根腐病,造成树木死亡[3-4]。在对海口、澄迈、万宁、昌江沿海和沿江木麻黄防护林的调查中发现,由南方灵芝〔Ganoderma australe (Fr.) Pat.〕引起的茎腐病发病率为3%~10%,为有效保护海岸线防护林,有必要对引起木麻黄木腐病的病原菌进行研究。2004年,吴兴亮等[5]首次对中国南方灵芝的地理分布和生境进行了报道。陈礼浪等[4]对海南木麻黄木腐菌进行了研究,共发现6种病原灵芝木腐菌,包括南方灵芝。吴如慧[6]对由二孢假芝(Amauroderma subresinosum)引起的海南木麻黄茎腐病的病原菌进行了致病性测定和生物学特性研究。目前,尚未见由南方灵芝引起的木麻黄活立木茎腐病的致病性测定及生物学研究的报道。笔者从海南发病的木麻黄活立木病树上采集病样并进行分离培养,对其病原菌通过接种完成致病性测定,采用形态学结合分子生物学手段进行种类鉴定,以及对其菌丝生长的生物学特性进行研究,旨在为研究木麻黄茎腐病的发病规律及诊断等提供理论依据。
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木麻黄树被病原菌侵染后表现为树冠稀疏,嫩枝失绿,枯枝多(图1A),后期整株变黄枯死(图1B,图1C)。在发病树木的茎干基部木质部组织出现白色腐朽(图1D)。多雨季节,病株茎基部长出褐色檐状的新鲜灵芝担子果(图1E,图1F)。
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接种3个月后观察MMHJF001菌株对木麻黄树基部的侵染的情况,结果发现,幼树树冠稀疏,生长不良,枯枝多,重病株整株枯死(图2A),茎干接种部位长满白色菌丝,茎干内部组织白腐(图2B,图2C),与田间病害症状相同。对照幼树则生长正常,创伤部位边缘已长出愈伤组织,内部组织健康(图2D)。采集发病组织进行再分离获得的菌株与MMHJF001相同。表明分离菌MMHJF001为致病菌。将菌株接种到瓶装木屑培养基,6个月后长出的担子果与发病树木茎基部生长的担子果形态特征相同(图2E)。
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形态鉴定 (1)菌落特征:在PDA平板上培养的MMHJF001的菌落前期为白色,边缘圆形或扇形,菌丝边缘稀薄,中间较浓密,菌落老化后变淡黄色(图3A)。(2)担子果:担子果一年生至多年生,无柄,硬木栓质,单生、群生或叠生。菌盖呈半圆形,大小为(8.0~21.8) cm×(5.8~12.5) cm,厚约4 cm,有明显同心环纹和环棱,菌盖边缘较钝;担子果上表面颜色呈灰褐色、土褐色或黑褐色,无漆样光泽,边缘较钝,白色,下表面灰白色。阴暗条件下生长的担子果颜色较深,强光下生长的担子果颜色稍浅。菌肉呈棕色或肉桂色,厚1.5~2.1 cm,菌管褐色或深褐色,长0.5~0.7 cm(图3B~图3E)。(3)显微结构:刚弹射出不久的新鲜孢子为典型的南瓜子形,双层壁,褐色或淡褐色,大小为(5.5~6.5) µm ×(8.7~ 11.1) µm,平均5.9 µm×10.0 µm,大端钝圆,小端呈圆锥形,其顶端无色透明,担孢子中央有一个较大的油滴;老熟担孢子小端平截,无色部分消失,大小为(5.8~6.8) µm×(7.4~8.8) µm,平均6.1 µm×8.3 µm,双层壁明显,颜色略深(图3F)。
分子鉴定:测序后获得MMHJF001菌株的rDNA-ITS和SSU序列长度分别为635 bp(NCBI登录号为MN696209.1)和1076 bp(登录号为MN696211.1)。将序列分别在NCBI上进行BLAST比对,结果显示与NCBI上登陆号为MN689631.1、LC084663.1、AF0266291.1等南方灵芝[Ganoderma australe (Fr.) Pat.]的序列相似度达99%。在NCBI数据库中选取rDNA-ITS,SSU相关基因序列(表1),将2种序列拼接,利用MEGA 6.0软件联合构建系统发育树,结果表明,菌株MMHJF001与南方灵芝的遗传距离最小,聚为一类,同源性达100%(图4)。结合形态学鉴定,确定MMHJF001菌株为南方灵芝[Ganoderma australe (Fr.) Pat.]。
表 1 菌株的序列登录号
Table 1. Accession number of sequences of fungal strains in GeneBank
种名 Species 菌株号 Strain No GeneBank 登录号 GenBank accession number ITS SSU 本实验菌株 MMHJF001 MN696209.1 MN696211.1 Ganoderma australe XJSJF003 MN747808.1 MN747807.1 G.australe YLJF001 MN689631.1 MN689632.1 G.boninense G14 KR093028.1 JQ665238.1 G.sinense CACP17101260 MK313125.1 MK341562.1 G.tropicum Loe31 MK007291.1 MK235148.1 G.applanatum XC14080601 MK345426.1 MK346838.1 G.gibbosum SPC2 KU569547.1 KU695655.1 G.tsugae Yuan5649 JQ781854.1 JX029986.1 G.resinaceum HSBU200870 KT343307.1 KT353526.1 G.lucidum HSBU20089 KT343301.1 KT353544.1 G.lucidum G32 KX055534.1 KP101172.1 Amauroderma subresinosum THP16 FJ154782.1 FJ154783.1 Amauroderma subresinosum THP48 FJ154784.1 FJ154785.1 Amauroderma subresinosum ML82 FJ154779.1 FJ154780.1 Phellinus nigricans T.Niemela9065 MF319077.1 MF319008.1 -
从图5可知,MMHJF001菌株菌丝在15~37 ℃均能生长,在15~28 ℃时随着温度的上升菌落直径增大,在28~37 ℃时随着温度的上升菌落直径则逐渐减小,40 ℃时停止生长,25~30 ℃温度范围适宜生长,28 ℃为菌丝生长的最适温度。
图 5 不同温度培养MMHJF001菌株的菌落直径
Figure 5. Colony diameter of the strain MMHJF001 cultured at different temperatures
从图6可知,病原菌MMHJF001菌株在pH为3~9范围内均能生长,pH3~7时菌丝生长速率增快,pH7时菌落直径最大,极显著高于其他处理,表明pH7最适宜菌丝生长。实验结果显示,南方灵芝更适于在弱酸性至中性环境中生长。
图 6 不同 pH条件下MMHJF001菌株的菌落直径
Figure 6. Colony diameter of the strain MMHJF001 cultured at different pH values
从图7可知,3种不同光照和黑暗条件MMHJF001菌株菌丝的生长差异显著。在黑暗的条件下菌株菌落直径最大,菌落边缘呈圆形,菌丝生长均匀。在连续光照条件下的菌落直径最小,菌落外围呈不规则扇形,菌丝生长不均匀。实验结果显示,黑暗条件有利于病原菌的菌丝生长。
图 7 不同光照下MMHJF001菌株的菌落直径
Figure 7. Colony diameter of the strain MMHJF001 cultured under different light conditions
从表2可知,原菌MMHJF001菌株在供试的6种培养基上均能生长。在橡胶树、耳叶相思和银合欢枝条浸出液培养基上长势较好,木麻黄、紫檀次之,而在槟榔叶柄浸汁培养基上病原菌长势较差,菌丝较稀薄。本研究结果表明,银合欢浸汁培养基最适合木麻黄灵芝茎腐病病原菌的生长。
表 2 不同植物浸出液培养基对MMHJF001菌丝生长的影响
Table 2. Effect of different culture mediums on the mycelium growth of the strain MMHJF001
植物浸出液
Plant extract菌落特征 Colony characteristics 菌丝生长状态 Mycelium growth status 菌落直径/cm Colony diameter 木麻黄 菌丝白色浓厚,菌丝较长,边缘平展密集,呈放射状 6.58bB 橡胶树 菌丝白色浓厚,菌丝长,边缘平展密集,呈放射状 8.08aA 槟榔 菌丝半透明稀疏,菌丝较短,边缘平展稀疏,呈放射状,菌丝颜色较深 5.00cC 紫檀 菌丝白色较浓厚,菌丝较长,边缘平展密集,呈放射状 6.74bB 银合欢 菌丝白色浓厚,菌丝长,边缘平展密集,呈放射状 8.17aA 耳叶相思 菌丝白色较浓厚,菌丝长,边缘平展较稀疏,呈放射状 8.23aA 注:小写字母代表在P<0.05水平差异显著,大写字母代表在P<0.01水平差异极显著。
Note: Lowercase letters represent significant differences at the P<0.05 level, uppercase letters represent highly significant differences at the P<0.01 level.
Identification and Biological Characteristics of a Ganoderma Stem Rot Pathogen Infecting Casuarina equisetifolia
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摘要: 2018年,在海南省万宁市的木麻黄(Casuarina equisetifolia)活立木上发现了一种灵芝茎腐病。为明确该病害的病原菌种类及其生物学特性,笔者采用常规组织分离法,从其担子果分离出10株形态相同的菌株,并选取其中具有代表性的优势菌株(编号为MMHJF001)对其进行致病性测定、形态学特征鉴定、rDNA-ITS和SSU序列分析,构建系统发育树,以及生物学特性测定。结果表明:引起木麻黄灵芝茎腐病的病原菌为南方灵芝(Ganoderma australe)。该病原菌菌丝生长最适温度为28 ℃,最适 pH为7,黑暗条件有利菌丝生长,且在耳叶相思(Acacia auriculiformis)、银合欢(Leucaena leucocephala)、橡胶(Hevea brasiliensis)植物浸汁培养基上生长较好。Abstract: A Ganoderma stem rot disease was found to infect Casuarina equisetifolia in 2018 in Wanning City, Hainan Province. In order to clarify the pathogen species and biological characteristics of the disease, 10 strains with the same morphology were isolated from basidiocarps by using the conventional tissue separation method. MMHJF001, a representative strain with excellent growth, was selected for pathogenicity determination, morphological identification, sequence analysis of rDNA-ITS and SSU, phylogenetic tree construction, and biological characteristics determination. The results showed that the pathogen causing the stem rot of C. equisetifolia was Ganoderma australe (Fr.) Pat. The optimum temperature for mycelial growth of the pathogen is 28 ℃, and the optimum pH is 7.0. Dark conditions are conducive to mycelial growth of the pathogen, and the pathogen grows better on the plant extract media from Acacia auriculiformis, Leucaena leucocephala (Lam.) and Hevea brasiliensis.
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图 2 菌株的致病性测定
A:接种5个月后的木麻黄整株枯死;B、C:病原菌已在接种部位定殖,内部组织白腐;D:对照;E:接种分离菌的瓶装木屑培养基诱导长出的担子果。
Fig. 2 Pathogenicity test of Ganoderma australe (Fr.) Pat
A: The whole plant died after 5 months of inoculation; B and C: Pathogens have colonized at the inoculation site, and white rot appeared on the internal tissue; D: Healthy plant; E: Isolated strains were developed into basidiocarps in bottled sawdust medium.
图 3 病原菌形态
A:PDA培养基上生长5天的菌落(正面);B:弱光下生长的担子果;C:强光下生长的担子果;D:担子果(正面);E:担子果(反面);F:担孢子。
Fig. 3 Morphology of pathogen
A: Colony morphology of 5 days old culture on PDA medium (front side); B: Basidiocarps growing in a low light condition; C: Basidiocarp growing in a strong light condition; D: Basidiocarp (front side); E: Basidiocarp (back side); F: Basidiospores.
图 5 不同温度培养MMHJF001菌株的菌落直径
小写字母代表在P<0.05水平差异显著,大写字母代表在P<0.01水平差异极显著,下同。
Fig. 5 Colony diameter of the strain MMHJF001 cultured at different temperatures
Lowercase letters represent significant differences at the P<0.05 level; uppercase letters represent highly significant differences at the P<0.01 level, similarly hereinafter.
表 1 菌株的序列登录号
Table 1 Accession number of sequences of fungal strains in GeneBank
种名 Species 菌株号 Strain No GeneBank 登录号 GenBank accession number ITS SSU 本实验菌株 MMHJF001 MN696209.1 MN696211.1 Ganoderma australe XJSJF003 MN747808.1 MN747807.1 G.australe YLJF001 MN689631.1 MN689632.1 G.boninense G14 KR093028.1 JQ665238.1 G.sinense CACP17101260 MK313125.1 MK341562.1 G.tropicum Loe31 MK007291.1 MK235148.1 G.applanatum XC14080601 MK345426.1 MK346838.1 G.gibbosum SPC2 KU569547.1 KU695655.1 G.tsugae Yuan5649 JQ781854.1 JX029986.1 G.resinaceum HSBU200870 KT343307.1 KT353526.1 G.lucidum HSBU20089 KT343301.1 KT353544.1 G.lucidum G32 KX055534.1 KP101172.1 Amauroderma subresinosum THP16 FJ154782.1 FJ154783.1 Amauroderma subresinosum THP48 FJ154784.1 FJ154785.1 Amauroderma subresinosum ML82 FJ154779.1 FJ154780.1 Phellinus nigricans T.Niemela9065 MF319077.1 MF319008.1 表 2 不同植物浸出液培养基对MMHJF001菌丝生长的影响
Table 2 Effect of different culture mediums on the mycelium growth of the strain MMHJF001
植物浸出液
Plant extract菌落特征 Colony characteristics 菌丝生长状态 Mycelium growth status 菌落直径/cm Colony diameter 木麻黄 菌丝白色浓厚,菌丝较长,边缘平展密集,呈放射状 6.58bB 橡胶树 菌丝白色浓厚,菌丝长,边缘平展密集,呈放射状 8.08aA 槟榔 菌丝半透明稀疏,菌丝较短,边缘平展稀疏,呈放射状,菌丝颜色较深 5.00cC 紫檀 菌丝白色较浓厚,菌丝较长,边缘平展密集,呈放射状 6.74bB 银合欢 菌丝白色浓厚,菌丝长,边缘平展密集,呈放射状 8.17aA 耳叶相思 菌丝白色较浓厚,菌丝长,边缘平展较稀疏,呈放射状 8.23aA 注:小写字母代表在P<0.05水平差异显著,大写字母代表在P<0.01水平差异极显著。
Note: Lowercase letters represent significant differences at the P<0.05 level, uppercase letters represent highly significant differences at the P<0.01 level. -
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