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大叶紫薇[Lagetstroemia speciosa(L.) Pers.],又称大花紫薇,原产于亚洲的热带地区,在我国的海南、广东、广西、四川、云南等省均有种植。大叶紫薇具有校高的药用价值和观赏价值,其提取物具有敛疮、解毒、凉血止血等功效,同时,园林绿化种植大叶紫薇移栽成活率极高,全年可观花的时间长达7个月[1-2]。2001年,朱爱萍等[3]对紫薇的白粉病(Uncinula austruliana)进行了生物学特性和致病性研究。2007年,翁殊斐等[4]对大花紫薇进行病虫害检索表的编制与综合防治,主要报道了大叶紫薇的斑点病(Phyllosticta lagerstroemiae)以及炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)。2009年,吴建民[5]对大叶紫薇褐斑病(Brown spot)和煤污病(Sooty mold)的症状、发生规律以及防治方法进行了报道。炭疽菌引起的植物炭疽病可导致寄主植物出现叶斑、枝枯等症状,甚至出现植株枯死。严重的植物炭疽病还可导致在种植产业上发生重大的经济损失。胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)是一种常见的引发多种植物炭疽病的病原真菌,其侵染的寄主种类丰富,分布范围广,但近年来发现其包含有多个复合种,炭疽病在我国虽有大量报道,但对热带林木炭疽病的调查以及鉴定偏少[6]。目前,只有少量的文献中提及到大叶紫薇炭疽病的病原菌为胶孢炭疽菌,但是尚未见到大叶紫薇炭疽病的致病性测定、分子鉴定及生物学特性等方面的详细报道。因此,笔者在海南发现的大叶紫薇炭疽病病树上采集病叶,并进行病原菌的分离培养和致病性测定,同时采用形态学结合分子生物学手段进行病原菌的种类鉴定及其生物学特性研究,旨在进一步明确大叶紫薇炭疽病的病原菌种类,为后续研究其发病规律及诊断防治等提供理论依据。
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在海南发现的大叶紫薇炭疽病主要危害下层老叶。病斑多出现在叶尖和叶缘,叶面上也有少量发生。发病初期,在病叶上呈现红褐色小斑点,边缘具明显的亮黄色晕圈,继而病斑扩展为半圆形或不规则,褐色至灰白色,边缘具2~5 mm宽的紫红色或深褐色坏死带,病斑的外围出现明显的亮黄色的晕圈。潮湿条件下,病斑中央轮生小黑点。后期部分老病斑中央组织破裂出现穿孔,重病叶易脱落。
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大叶紫薇炭疽病的致病性测定结果显示,接种3 d后,滴加分生孢子悬浮液在刺伤部分的老叶和喷施分生孢子悬浮液在无刺伤的嫩叶的处理均发病;接种4 d后,使用菌饼刺伤接种的老叶发病,老叶上未刺伤部分接种菌饼部分全部未发病,对照区域也未出现病变。接种7 d后,观察到叶片接种部位出现橘红色分生孢子团(图1)。从接种发病部位再分离获得的菌株与最初分离的DYZWTJ001菌株形态相同,证明DYZWTJ001菌株为大叶紫薇炭疽病的病原菌。
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病原菌在自然生长5 d后的PDA培养基表面菌落的平均直径为6.9 cm。观察到其菌落上的菌丝非常的致密,表面蓬松,中心呈灰色,边缘呈白色,背面中心呈橘红色,边缘呈白色。分生孢子为单胞,整体呈现圆柱状,两端无色且钝圆,大小为(13.59~15.83)μm×(4.60~6.51)μm。分生孢子盘褐色,椭圆形,大小为(72.27~77.05)μm×(35.25~37.46)μm(图2)。
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将测序后的各基因序列提交至GenBank数据库获得序列号,获得DYZWTJ001菌株的 rDNA-ITS、ACT 、GADPH和CHS序列长度分别为550 bp(NCBI 登录号为MZ955449) 、257 bp(NCBI 登录号为MZ955450)、251 bp(登录号为MZ955451)和283 bp(登录号为OM867674)。在NCBI数据库中选取 rDNA-ITS、ACT 和GADPH相关基因序列(表1),将3种序列拼接,利用MEGA 7.0软件联合构建系统发育树,结果(图3)表明,菌株DYZWTJ001与隐秘刺盘孢的遗传距离最小,在93%水平上聚为一支。结合形态学鉴定,确定DYZWTJ001菌株为隐秘刺盘孢(Colletotrichum aenigma)。
表 1 参考菌株及其GeneBank登录号
种名 菌株号 GeneBank登录号 ITS ACT GADPH CHS 本实验菌株 DYZWTJ001 MZ955449 MZ955450 MZ955451 OM867674 C. tofieldiae CBS 495.85 GU227801 GU227899 GU228193 GU228291 C. xanthorrhoeae BRIP 45094 JX010261 JX009478 JX009927 JX009823 C. asianum ICMP 18580 FJ972612 JX009584 JX010053 JX009867 C. alatae ICMP 17919 JX010190 JX009471 JX009990 JX009837 C.aenigma ICMP 18608 JX010244 JX009443 JX010044 JX009774 C. lilii CBS 186.30 GU227811 GU227909 GU228203 GU228301 C. liriopes CBS 119444 GU227804 GU227902 GU228196 GU228294 C. truncatum CBS 151.35 GU227862 GU227960 GU228254 GU228352 C.kahawae subsp.ciggaro ICMP18539 JX010230 JX009523 JX009966 JX009800 C.musae CBS116870 JX010146 JX009433 JX010050 JX009433 C.mupharicola CBS470.96 JX010187 JX009437 JX009972 JX009835 C.psidii CBS145.29 JX010219 JX009515 JX009967 JX009901 C.kahawae subsp.Kahawea IMI319418 JX010231 JX009452 JX010012 JX009813 Monilochaetes infuscans CBS 869.96 JQ005780 JQ005843 JX546612 JQ005801 -
DYZWTJ001菌株均能在6种培养基上生长,其菌丝生长速度依次为PDA>PSA>CA>OMA>Czapek>CMA(表2)。培养基PDA和PSA下菌丝生长情况差异不显著(P<0.05)。
表 2 不同培养基对DYZWTJ001菌丝生长的影响
培养基 菌落特征 菌落直径/cm PDA 菌丝致密,菌落白色,近圆形 6.98±0.19aA PSA 菌丝致密,菌落白色,近圆形 6.90±0.07aA CA 菌丝近无色透明,近圆形 5.41±0.25bB OMA 菌丝近无色透明,近圆形 5.40±0.12bB Czapek 菌丝致密,菌落白色,近圆形 5.29±0.07bB CMA 菌丝近无色透明,近圆形 4.92±0.17bB -
菌株DYZWTJ001在不同梯度温度环境下培养5 d后,在20~32 ℃条件下均能生长,而在10 、15 、35 ℃条件下不能生长。20~30 ℃内,随温度的升高,菌落生长速度显著加快,30 ℃时病原菌菌落生长速度最快,菌落直径为6.92 cm,其次是28 ℃时病原菌菌落生长速度较快,菌落直径为6.70 cm,这两个温度下的菌落直径与其他温度下的菌落直径存在显著性差异(P<0.05),因此认定30 ℃为此炭疽菌最适生长温度;从30~32 ℃,菌丝生长速度随温度的升高而下降,到35 ℃时,病原菌完全停止生长(图4)。
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菌株DYZWTJ001在pH值为2时菌丝不能生长,在pH值3~13环境下均能生长。其中,pH值为8时,菌丝生长速度最快,菌落直径为5.86 cm,与其他pH值下的菌落直径存在显著性差异(P<0.05);之后随着pH值的升高,菌丝生长速率逐渐下降(图5),表明碱性条件比弱酸性条件更有利于菌丝的生长。
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菌株DYZWTJ001在不同光照条件下均能生长。在黑暗环境下,其生长速率最快,菌落直径达6.89 cm;全光处理次之,菌落直径达3.80 cm;光∶暗=12 h∶12 h处理生长最慢,菌落直径达3.81 cm(图6);光∶暗=12 h∶12 h处理和全光照处理间差异不显著(P<0.05),可见不同光照条件对此炭疽菌菌丝生长影响不大。
Identification and biological characteristics of pathogens causing anthracnose of Lagetstroemia speciosa
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摘要: 为了明确大叶紫薇炭疽病的病原菌种类,为后续研究其发病规律及诊断防治提供理论依据,对海南出现的大叶紫薇炭疽病进行致病性测定、形态学鉴定和ITS、ACT、GAPDH、CHS序列分析,结果表明:引起海南大叶紫薇炭疽病的病原菌为隐秘刺盘孢(Colletotrichum aenigma)。生物学特性测定结果表明:大叶紫薇炭疽病原菌丝最适生长温度为 30 ℃,最适 pH 为8。黑暗条件有利于其菌丝生长,在PDA、PSA培养基上的生长速率较快。Abstract: In order to clarify the pathogen species of anthracnose disease infecting Lagetstroemia speciosa to provide a theoretical basis for further study on its pathogenesis, diagnosis and control, the leaves of L. speciosa infected with anthracnose disease were sampled and isolated, and the isolates were determined in terms of pathogenicity and morphological characteristics and analyzed by using ITS, ACT, GAPDH and CHS sequence analysis. The isolates were identified as Colletotrichum aenigma, a pathogen causing anthracnose disease of L. speciosa. Biological characteristics tests showed that the pathogen had optimum mycelial growth when cultured at 30 ℃ on the PDA medium with pH 8. Dark culture was conducive to mycelial growth of the pathogen, and the mycelia of the pathogen grew fast on both the PDA and PSA media.
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表 1 参考菌株及其GeneBank登录号
种名 菌株号 GeneBank登录号 ITS ACT GADPH CHS 本实验菌株 DYZWTJ001 MZ955449 MZ955450 MZ955451 OM867674 C. tofieldiae CBS 495.85 GU227801 GU227899 GU228193 GU228291 C. xanthorrhoeae BRIP 45094 JX010261 JX009478 JX009927 JX009823 C. asianum ICMP 18580 FJ972612 JX009584 JX010053 JX009867 C. alatae ICMP 17919 JX010190 JX009471 JX009990 JX009837 C.aenigma ICMP 18608 JX010244 JX009443 JX010044 JX009774 C. lilii CBS 186.30 GU227811 GU227909 GU228203 GU228301 C. liriopes CBS 119444 GU227804 GU227902 GU228196 GU228294 C. truncatum CBS 151.35 GU227862 GU227960 GU228254 GU228352 C.kahawae subsp.ciggaro ICMP18539 JX010230 JX009523 JX009966 JX009800 C.musae CBS116870 JX010146 JX009433 JX010050 JX009433 C.mupharicola CBS470.96 JX010187 JX009437 JX009972 JX009835 C.psidii CBS145.29 JX010219 JX009515 JX009967 JX009901 C.kahawae subsp.Kahawea IMI319418 JX010231 JX009452 JX010012 JX009813 Monilochaetes infuscans CBS 869.96 JQ005780 JQ005843 JX546612 JQ005801 表 2 不同培养基对DYZWTJ001菌丝生长的影响
培养基 菌落特征 菌落直径/cm PDA 菌丝致密,菌落白色,近圆形 6.98±0.19aA PSA 菌丝致密,菌落白色,近圆形 6.90±0.07aA CA 菌丝近无色透明,近圆形 5.41±0.25bB OMA 菌丝近无色透明,近圆形 5.40±0.12bB Czapek 菌丝致密,菌落白色,近圆形 5.29±0.07bB CMA 菌丝近无色透明,近圆形 4.92±0.17bB -
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