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海巴戟(Morinda citrifolia Linn)为茜草科(Rubiaceae)巴戟天属(Morinda)植物,国外称之为诺丽(Noni)[1],广泛种植于太平洋地区,作为保健及药用植物已有上千年的历史[2],其果实、叶子、枝干、根部均可入药[3],在我国海南岛、西沙群岛和台湾岛也有分布。海巴戟各部位提取物均具有一定的抗菌、抑瘤等作用[4-5],其果实提取物是安全的天然抗氧化剂,具有抗氧化活性[6]、保护心肌细胞[7]和抑制肿瘤生长的作用,叶子提取物可用于治疗溃疡和轻微感染[8]。海巴戟的根、叶、果均含有抗氧化活性成分,且根的抗氧化活性最强[9]。海巴戟果汁对四氯化碳(CCl4)引起的肝损伤小鼠具有肝保护功能[10]。有研究表明,关节病患者摄入海巴戟果汁可以控制炎症,缓解关节不适,调节免疫系统[11]。由于海巴戟富含多种活性成分,国际市场已将它定位为药品和保健食品[12]。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性菌,属于弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio),无芽胞,有鞭毛,形态呈杆状、弧状、卵圆状等。该菌在含2%~4%氯化钠的培养基中生长旺盛,在氯化钠质量分数小于2%时基本不生长。副溶血性弧菌的致病性是溶血素、脲酶、黏附因子和分泌系统等多种致病因子相互作用的结果,机理较复杂。其主要致病因子是多种溶血毒素,主要有不耐热溶血毒素(Thermolabile hemolysin,TLH),耐热直接溶血毒素(Thermostable direct hemolysin,TDH)和相对耐热直接溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH) [13]。副溶血性弧菌常存在于海洋和河口生态系统及鱼、虾、贝类等水产品中[14]。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾,由于凡纳滨对虾具有较强的环境适应能力、生长快和抗病力强、经济效益显著等特点,是目前世界上养殖单产最高的对虾品种[15],也是世界三大高产量对虾养殖品种之一[16]。随着对虾养殖规模的不断扩大,对虾养殖病害发生频率亦相应增加,由副溶血性弧菌引起的疾病最常见,如红体病、红腿病、白斑病、肠炎病、烂鳃病等,导致对虾养殖业蒙受了巨大损失。近年来,急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND)在凡纳滨对虾养殖中广为流行,患病对虾表现为红体、壳软,肠胃排空,肝胰腺变色、肿大后呈纤维化萎缩,最终坏死。该病3~5 d致死率高达90%[17]。我国于2010年在海南省首次发现该疾病,随后全国大部分对虾养殖区遭受感染,损失惨重。2012年,LIGHTNER等[18]首先报了AHPND的致病原是副溶血弧菌,随后,又有多篇报道证明AHPND是由副溶血弧菌引起[19-23],通过控制副溶血性弧菌可以大大减少AHPND暴发的风险[24]。目前,水产养殖业对副溶血性弧菌的防治主要依赖抗生素,但抗生素的长期使用使得耐药菌株不断出现,多种副溶血性弧菌菌株已产生光谱耐药性。相关研究表明,副溶血性弧菌已对磺胺类、头孢类、氨基糖苷类和青霉素类药物出现不同程度的耐药性,对阿莫西林的平均耐药率已高达50%[25-27]。因此,寻找一种有效的天然抗菌物质已成为大家关注的焦点。据报道,植物提取物中的生物碱、萜类、单宁、皂苷、糖苷、黄酮类、酚类、甾体和精油等具有促进生长、改善免疫系统、抗菌能力、刺激食欲和抗应激特性等特性[28-30]。使用植物提取物作为水产养殖中抗生素可持续有效的替代品,具有治疗成本低、生物降解性好、耐药性低等优点[31-34]。本研究针对副溶血性弧菌对对虾产业的严重危害性,以海巴戟为材料,探究其提取物对凡纳滨对虾副溶血性弧菌的抑制效果,旨在为海巴戟在水产养殖领域的应用提供依据。
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通过控制紫外灯照射时长,对分别照射0、5、10、15、20、25 min的海巴戟果提取物进行涂布平板抑菌试验,对应的抑菌圈平均直径分别为11.2、8.4、8.0、6.7、0、0 mm。
根据平均值绘制折线图(图1)。从图1可知,紫外线会影响海巴戟果提取物的抑菌能力,紫外照射时间越长,抑菌能力越弱;当紫外线作用时间≥20 min时,培养皿中滤纸片周围无抑菌圈产生。
图 1 紫外线照射时长处理的海巴戟果提取液对副溶血性弧菌抑菌效果的影响
Figure 1. Effect of the hot-water noni fruit extract under different ultraviolet exposure durations on bacteriostasis of V. parahaemolyticus
表 1 不同煮沸时间对海巴戟果提取物抑菌率的影响
Table 1. Effect of hot-water noni fruit extract on bacteriostatic rate at different boiling time
煮沸时间/min Boiling duration 0 5 10 15 20 25 对照 Control 菌落数平均值/cfu Average value 545 348 321 177 179 182 625 抑菌率/% Bacteriostatic rate 12.64 45.76 48.64 71.68 71.36 70.88 0 实验结果表明,紫外线照射会影响海巴戟果提取物的抑菌效果,紫外照射时间越长,抑菌能力越弱甚至消失。推测紫外线照射可能会分解海巴戟果提取物中的活性物质,从而对其抑菌能力造成影响。
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从图2可知,浸泡30 min(0组)和对照组之间差异不显著,煮沸5 min和浸泡30 min相比差异显著,但是和煮沸10 min差异不显著。分别煮沸15、20、25 min和煮沸5、10 min相比差异极显著,但是三者之间差异不显著。煮沸0、5、10、15、20、25 min的海巴戟果提取物对副溶血性弧菌的抑菌率分别为12.64%、45.76%、48.64%、71.68%、71.36%、70.88%(表1)。煮沸能够显著提高海巴戟果提取物对副溶血性弧菌的抑制作用。根据实验结果,分别煮沸0、5、10、15 min时,海巴戟果提取物的抑菌率依次增大,15 min后,煮沸时长对其抑菌作用的几乎没有影响。煮沸15 min的海巴戟果提取物抑菌效率最大。
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添加不同质量浓度的海巴戟果提取物,培养12 h后,1~13支试管中,4~12号试管内液体混浊,1~3号试管内液体澄清,继续培养48 h后,3号试管出现轻微混浊,1~2号试管内液体依旧澄清,该结果初步表明,副溶血性弧菌的生长在海巴戟果提取物的质量浓度达到25.00 g·L−1时明显受到抑制,当海巴戟果提取物的质量浓度达到50 g·L−1时,副溶血性弧菌不生长。准备副溶血性弧菌培养皿,分别对培养12 h和48 h的试管内菌液进行涂布培养,如表2、表3所示,培养12 h后,海巴戟果提取物的质量浓度≥25.00 g·L−1时,培养皿中没有副溶血性弧菌,据此判断,海巴戟果提取物的最小抑菌质量浓度(MIC)值为25.00 g·L−1。继续培养36 h后,海巴戟果提取物质量浓度为25.00 g·L−1的培养皿中出现副溶血性弧菌,而海巴戟果提取物质量浓度为50.00 g·L−1和100 g·L−1的培养皿中仍没有副溶血性弧菌生长,据此得出其MBC值为50.00 g·L−1。
表 2 添加不同质量浓度海巴戟果提取物培养12 h后副溶血性弧菌生长情况
Table 2. The growth of V. parahaemolyticus after 12 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract
提取物质量浓度/(g·L−1) Concentration 100.00 50.00 25.00 12.50 6.25 3.13 1.56 0.78 0.39 0.20 0.10 0 副溶血性弧菌生长情况 Growth of V. parahaemolyticus − − − + + + + + + + + + 注:“+”表示培养皿中有菌体生长,“−”表示培养皿中没有菌体生长。
Note: “+”means the growth of bacteria in the culture dish; “−”means there is no growth of bacteria in the culture dish.表 3 添加不同质量浓度海巴戟果提取物培养48 h后副溶血性弧菌生长情况
Table 3. The growth of V. parahaemolyticus after 48 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract
提取物质量浓度/(g·L−1) Concentration 100.00 50.00 25.00 副溶血性弧菌生长情况 Growth of V. parahaemolyticus − − + 注:“+”表示培养皿中有菌体生长,“−”表示培养皿中没有菌体生长。
Note: “+”means the growth of bacteria in the culture dish; “−”means there is no growth of bacteria in the culture dish.
Bacteriostatic Effect of Noni (Morinda citrifolia) Fruit Extract on Vibrio parahaemolyticus Isolated from Litopenaeus vannamei
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摘要:
采用传统煎煮法提取海巴戟果有效成分,以副溶血性弧菌为试验菌株,将抑菌圈直径、最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)及抑菌率作为检测指标,探讨海巴戟果热水提取物对水产动物致病菌的体外抑菌效果。结果表明,海巴戟果提取物对副溶血性弧菌的生长有抑制作用,其最小抑菌质量浓度(MIC)为25.00 g·L−1,最小杀菌质量浓度(MBC)为50.00 g·L−1。海巴戟果提取物对副溶血性弧菌的抑菌效果随着紫外照射时长而减弱,甚至消失,煮沸时间≥15 min才能使其更好地发挥抑菌作用。
Abstract:The effective components of noni (Morinda citrifolia) fruit were extracted by traditional water decocting method and used to test their bacteriostatic effect on Vibrio parahaemolyticus isolated from Litopenaeus vannamei. V. parahaemolyticus is the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease that causes serious loss in aquaculture of Litopenaeus vannamei. Diameter of inhibition zones, minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and bacteriostatic rate were determined, based on which the antibacterial effects of the noni fruit extract on V. parahaemolyticus in vitro were discussed. The results showed that the noni fruit extract inhibited the growth of V. parahaemolyticus at the minimum inhibitory concentration (MIC) of 25.00 g·L−1 and the minimum bactericidal concentration (MBC) of 50.00 g·L−1. The bacteriostatic effect of the noni fruit extract on V. parahaemolyticus decreased or even disappeared with the increase of duration of exposure of the noni fruit extract to ultraviolet. Only when boiled for 15 min or more for extraction could M. citrifolia have a better bacteriostatic effect on the growth of V. parahaemolyticus.
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Key words:
- Morinda citrifolia /
- extract /
- Litopenaeus vannamei /
- Vibrio parahaemolyticus /
- bacteriostatic effect
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图 2 不同煮沸时长海巴戟果提取物对副溶血性弧菌菌落数的影响
数据柱(点)标注相同字母表示差异不显著(P > 0.01),不同字母表示差异显著(P < 0.01)。
Fig. 2 Inhibition of number of colonies of V. parahaemolyticus by the hot-water noni fruit extract at different boiling durations
Value columns (points) with the same letters mean significant difference at P > 0.01, while those with different letters mean significant difference at P < 0.01.
表 1 不同煮沸时间对海巴戟果提取物抑菌率的影响
Table 1 Effect of hot-water noni fruit extract on bacteriostatic rate at different boiling time
煮沸时间/min Boiling duration 0 5 10 15 20 25 对照 Control 菌落数平均值/cfu Average value 545 348 321 177 179 182 625 抑菌率/% Bacteriostatic rate 12.64 45.76 48.64 71.68 71.36 70.88 0 表 2 添加不同质量浓度海巴戟果提取物培养12 h后副溶血性弧菌生长情况
Table 2 The growth of V. parahaemolyticus after 12 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract
提取物质量浓度/(g·L−1) Concentration 100.00 50.00 25.00 12.50 6.25 3.13 1.56 0.78 0.39 0.20 0.10 0 副溶血性弧菌生长情况 Growth of V. parahaemolyticus − − − + + + + + + + + + 注:“+”表示培养皿中有菌体生长,“−”表示培养皿中没有菌体生长。
Note: “+”means the growth of bacteria in the culture dish; “−”means there is no growth of bacteria in the culture dish.表 3 添加不同质量浓度海巴戟果提取物培养48 h后副溶血性弧菌生长情况
Table 3 The growth of V. parahaemolyticus after 48 h culture with different concentrations of the hot-water noni fruit extract
提取物质量浓度/(g·L−1) Concentration 100.00 50.00 25.00 副溶血性弧菌生长情况 Growth of V. parahaemolyticus − − + 注:“+”表示培养皿中有菌体生长,“−”表示培养皿中没有菌体生长。
Note: “+”means the growth of bacteria in the culture dish; “−”means there is no growth of bacteria in the culture dish. -
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