CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除

侯国锋; 曾家伟; 羊熙春; 王爱媛; 刘亚欣; 曾纪锋; 郭桂英; 杨诺; 李迁; 郑继平

doi:10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.03.005

CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除

DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.03.005

1. 海南大学热带农林学院, 海口 570228;
2. 海南大学教务处, 海口 570228;
3. 海南大学网络与教育技术中心, 海口 570228

基金项目:

海南自然科学基金面上项目(317071)

海南自然科学基金创新研究团队项目(2017CXTD005)

国家自然科学基金(31460699)

详细信息

第一作者:
侯国锋(1990-),男,海南大学热带农林学院2015级硕士研究生.E-mail:2232739029@qq.com

通信作者:
郑继平(1973-),男,教授.研究方向:细菌遗传学.E-mail:jiping.zheng@hainu.edu.cn

中图分类号: Q819

Outer Membrane Vesicles as CRISPR/Cas9 System Carrier for Elimination of Streptococcus agalactiae

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hianan 570228, China;
2. The Academic Affairs Office, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China;
3. Network and Educational Technology Center, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

摘要: 人工核酸内切酶技术CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)/Cas9是当前最有效的基因编辑工具。外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)是细菌主动分泌和吸收的双层膜结构,具有运载DNA、蛋白等多种物质的能力。为探究以OMVs为CRISPR编辑工具的转运载体、用于病原菌清除的可行性,本研究以高致病性无乳链球菌(Streptococcus agalactiae or Group B Streptococcus,GBS)为材料,在原有CRISRR质粒p Cas9的基础上,通过分子克隆,构建穿梭质粒p Cas9-2.0和具有靶向剪切无乳链球菌cfb基因的毒性质粒p Cas9-cfb,将质粒p Cas9-cfb转入asd缺陷型大肠杆菌X6097后,一方面进行重组菌的OMVs制备、电镜观察和DNA分析,另一方面与GBS混合培养,最后在选择平板上对GBS菌落计数。结果显示,重组了质粒p Cas9-cfb的X6097能够分泌OMVs且内含质粒;实验组平板上没有GBS菌落产生;对照组平板上菌落经鉴定皆为含p Cas9-2.0的GBS,且菌落数量随共培养时间的延长和卡那霉素(Kan)的浓度升高而增多。综上可见,OMVs可以运载CRISPR为染色体剪切工具、并实现对靶向病原菌的定向清除,但受OMVs分泌量的限制消除效率较低。同传统的预防性疫苗相比,本研究为病原菌清除提供了一个新的研究方向;同当前以噬菌体为载体的研究思路相比,本方法更简便、成本更低。另外,本研究也为难以进行电击转化的菌株提供了一个更简单的质粒转化方法。
- CRISPR /
- OMVs /
- 无乳链球菌 /
- 病原菌清除 /
- 质粒转化
Abstract: As bacterial unique immune system, clustered regularly interspaced short palindromic repeats（ CRISPR）/Cas9 is the most effective gene editing tool at present. Outer membrane vesicles（ OMVs） are the physiological structures of active secretion and absorption of bacteria,and have the ability to carry DNA,protein and some other substances. To investigate the possibility of OMVs transporting CRISPR/Cas9 and eliminating pathogenic bacteria,the plasmid pCas9 was reconstructed to develop shuttle plasmid pCas9-2. 0（ which can be replicated in E. coli and Streptococcus agalactiae or Group B Streptococcus,GBS）,and p Cas9-cfb( which is derived by inserting crRNA targeting cfb gene in GBS E0. The E. coli X6097（ Δasd） was used for harboring pCas9-2. 0 or pCas9-cfb. The OMVs of recombinant X6097 were extracted,purified and observed by electron microscope. The pCas9-2. 0 or pCas9-cfb was detected from OMVs by PCR. Recombinant X6097 and GBS E0 strains were mixed and co-cultured,and finally counted on BHI medium by using the colony count method. The results showed that the OMVs were secreted by the recombinant X6097 as a carrier for shipping the plasmid from the X6097 to the GBS E0. The secretion and transfer efficiency of OMVs were enhanced by prolonging co-culture time with low-level kanamycin. The GBS E0 was killed by absorbing pCas9-cfb. Compared with the traditional prophylactic vaccine,this study provides a new research strategy for the control of pathogenic bacteria in natural environment. Compared with the current phage delivery systems,this method is more convenient and lower in cost. In addition,this study developed a new plasmid transformation method for some strains that are hard to be electroporated or some labs without electroporation apparatus.
- CPRISPR /
- out membrane vesicles（OMVs） /
- Streptococcus agalactiae /
- elimination of pathogenic bacteria /
- plasmid transformation

[1]	杨一丹, 郑慧盈, 王快快, 吴薇, 缪卫国, 林春花. 海南杧果细菌性坏死病病原菌鉴定 . 热带生物学报（中英文）, 2026, 17(4): 709-715. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250163
[2]	贾新蕾, 黄增朝, 杨林狄, 吕静, 李妍萍, 简纪常, 黄郁葱. 不同培养温度的鱼源海豚链球菌转录组分析 . 热带生物学报（中英文）, 2024, 15(1): 109-121. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230027
[3]	凌博, 陈丽青, 王宇, 杨诺, 范丽霞, 郭桂英, 李雪松, 曾纪锋, 李迁, 郑继平. pSETsac B质粒构建及其对达卡气单胞菌kdp E基因的有痕与无痕敲除效率评价 . 热带生物学报（中英文）, 2024, 15(4): 452-459. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20230056
[4]	刘露露, 林哲, 邹振. CRISPR/Cas9技术在昆虫基因功能研究中的应用及优化 . 热带生物学报（中英文）, 2023, 14(1): 50-59. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.006
[5]	朱清亮, 李增平, 丁婧钰, 张宇, 程乐乐. 海南3种相思树红根病病原菌的鉴定 . 热带生物学报（中英文）, 2023, 14(1): 111-119. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2023.01.013
[6]	朱清亮, 李增平, 张宇. 一种木麻黄茎腐病病原菌的鉴定及其生物学特性测定 . 热带生物学报（中英文）, 2022, 13(5): 524-531. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.05.015
[7]	云莉, 倪雅丽. 茴香醛对变异链球菌的抗菌活性和抗生物被膜活性 . 热带生物学报（中英文）, 2022, 13(6): 614-621. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2022.06.011
[8]	朱晓菲, 黄娇媚, 原昊, 万逸. Class2 CRISPR-Cas系统发掘及分析方法 . 热带生物学报（中英文）, 2021, 12(1): 115-123. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.01.017
[9]	葛春晖, 尤文静, 蒋泽橙, 成梓瑜, 汤月, 邵远志. 火龙果采后病原菌的鉴定及其防控处理的优化 . 热带生物学报（中英文）, 2021, 12(2): 228-235. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2021.02.012
[10]	刘亚欣, 王宇, 杨诺, 郭桂英, 李迁, 曾纪锋, 郑继平. 乳酸乳球菌电击转化方法的优化 . 热带生物学报（中英文）, 2020, 11(2): 245-250. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.02.016
[11]	黄文枫, 胡艳平, 朱白婢. 海南薄皮甜瓜枯萎病病原菌鉴定及抗病砧木的筛选 . 热带生物学报（中英文）, 2020, 11(3): 310-313. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2020.03.008
[12]	林宇, 李增平, 吴如慧, 张宇. 非洲楝拟茎点霉叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性的测定 . 热带生物学报（中英文）, 2019, 10(1): 34-40. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2019.01.006
[13]	彭昀, 肖宇明, 刘衍超, 李增平, 王萌, 梁晓宇, 张宇. 橡胶树枯萎病病原菌室内毒力测定 . 热带生物学报（中英文）, 2019, 10(3): 272-275. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2019.03.012
[14]	刘海天, 赵光军, 郭晓慧, 张永政, 周永灿, 蔡岩, 谢珍玉, 郭伟良, 王世锋. 无乳链球菌对罗非鱼粘液的粘附特性 . 热带生物学报（中英文）, 2016, 7(2): 153-158. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2016.02.002
[15]	任希望, 梁丽雯, 王鹤鸣, 廖华兰, 林道哲, 黎秀琼, 陈银华. 木薯细菌性枯萎病病原菌的分离与鉴定 . 热带生物学报（中英文）, 2015, 6(1): 59-64. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2015.01.009
[16]	张贺, 漆艳香, 刘晓妹, 张欣, 蒲金基, 张辉强, 谢艺贤. 粉蕉枯萎病病原菌1号小种致病力的分化 . 热带生物学报（中英文）, 2014, 5(2): 136-141,146. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2014.02.010
[17]	赵光军, 周永灿, 杨慧, 蔡岩, 张晗, 谢珍玉, 王世锋, 李聪. 罗非鱼无乳链球菌拮抗菌的分离、鉴定及多样性分析 . 热带生物学报（中英文）, 2014, 5(4): 312-319,356. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2014.04.002
[18]	梁丽雯, 任希望, 高志亮, 符秀梅, 林道哲, 罗红丽, 陈银华. 红掌细菌性叶枯病病原菌的分离与鉴定 . 热带生物学报（中英文）, 2013, 4(4): 327-331. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2013.04.010
[19]	张晗, 周永灿, 赵光军, 蔡岩, 谢珍玉, 郭伟良, 王世锋. 测定无乳链球菌灭活疫苗浓度的分光光度法 . 热带生物学报（中英文）, 2013, 4(4): 369-373. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2013.04.016
[20]	薛玉潇, 贾慧升, 王国芬, 刘磊, 黄俊生. 接种生防菌和病原菌对香蕉抗枯萎病的诱导 . 热带生物学报（中英文）, 2012, 3(1): 62-65,68. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2012.01.007

点击查看大图

计量

文章访问数: 489
HTML全文浏览量: 104
PDF下载量: 15
被引次数: 0

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

留言板

CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除

DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.03.005

第一作者:
侯国锋(1990-),男,海南大学热带农林学院2015级硕士研究生.E-mail:2232739029@qq.com

通信作者:
郑继平(1973-),男,教授.研究方向:细菌遗传学.E-mail:jiping.zheng@hainu.edu.cn

Outer Membrane Vesicles as CRISPR/Cas9 System Carrier for Elimination of Streptococcus agalactiae

计量

CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除

DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.03.005

1. 海南大学热带农林学院, 海口 570228;

2. 海南大学教务处, 海口 570228;

3. 海南大学网络与教育技术中心, 海口 570228

作者简介:
侯国锋(1990-),男,海南大学热带农林学院2015级硕士研究生.E-mail:2232739029@qq.com

通讯作者: 郑继平(1973-),男,教授.研究方向:细菌遗传学.E-mail:jiping.zheng@hainu.edu.cn

English Abstract

Outer Membrane Vesicles as CRISPR/Cas9 System Carrier for Elimination of Streptococcus agalactiae

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hianan 570228, China;

2. The Academic Affairs Office, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China;

3. Network and Educational Technology Center, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

全文HTML

目录

喜报！《热带生物学报（中英文）》影响因子稳步攀升，再创历史新高！

留言板

CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除

DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.03.005

第一作者: 侯国锋(1990-),男,海南大学热带农林学院2015级硕士研究生.E-mail:2232739029@qq.com

通信作者: 郑继平(1973-),男,教授.研究方向:细菌遗传学.E-mail:jiping.zheng@hainu.edu.cn

Outer Membrane Vesicles as CRISPR/Cas9 System Carrier for Elimination of Streptococcus agalactiae

计量

出版历程

CRISPR/Cas9的外膜囊泡转运与无乳链球菌清除

DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.2018.03.005

1. 海南大学热带农林学院, 海口 570228; 2. 海南大学教务处, 海口 570228; 3. 海南大学网络与教育技术中心, 海口 570228

作者简介: 侯国锋(1990-),男,海南大学热带农林学院2015级硕士研究生.E-mail:2232739029@qq.com

通讯作者: 郑继平(1973-),男,教授.研究方向:细菌遗传学.E-mail:jiping.zheng@hainu.edu.cn

English Abstract

Outer Membrane Vesicles as CRISPR/Cas9 System Carrier for Elimination of Streptococcus agalactiae

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hianan 570228, China; 2. The Academic Affairs Office, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 3. Network and Educational Technology Center, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

全文HTML

目录

喜报！《热带生物学报（中英文）》影响因子稳步攀升，再创历史新高！

第一作者:
侯国锋(1990-),男,海南大学热带农林学院2015级硕士研究生.E-mail:2232739029@qq.com

通信作者:
郑继平(1973-),男,教授.研究方向:细菌遗传学.E-mail:jiping.zheng@hainu.edu.cn

1. 海南大学热带农林学院, 海口 570228;

2. 海南大学教务处, 海口 570228;

3. 海南大学网络与教育技术中心, 海口 570228

作者简介:
侯国锋(1990-),男,海南大学热带农林学院2015级硕士研究生.E-mail:2232739029@qq.com

1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hianan 570228, China;

2. The Academic Affairs Office, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China;

3. Network and Educational Technology Center, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China