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咖啡（Coffea L.）隶属于茜草科咖啡属，为常绿灌木或小乔木，位列世界三大饮料之首，兼具提神醒脑、促进新陈代谢、抗氧化、利尿消肿等生理功效 [1-2]。商业化栽培咖啡主要包含小粒种咖啡（Coffea arabica L.）、中粒种咖啡（Coffea canephora Pierre ex A. Froehner，俗称罗布斯塔）与大粒种咖啡（Coffea liberica Bull. ex Hiern）。其中，小粒种咖啡适应性广，种植面积约占全球咖啡总种植面积的 60%；中粒种罗布斯塔咖啡次之，占比约 40%[3]。中国是全球重要的咖啡生产、贸易与消费国，咖啡自给率不足的问题亟待解决 [4]。中国咖啡种植区主要分布于云南、海南等省区，长期过量施用化肥造成土壤酸化、养分失衡等一系列土壤问题 [5]。
植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR）具有环境友好、成本低廉、可持续性强等特点。热带地区微生物资源禀赋丰富，定向挖掘并利用功能微生物促进作物生长，减少化肥与农药投入，是实现热区农业绿色可持续发展的重要途径 [6-7]。PGPR 可通过解磷、合成植物激素、分泌铁载体等直接或间接途径调控并促进植物生长 [8-9]。例如，贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等菌株能够活化土壤难溶性磷、合成铁载体并分泌吲哚乙酸（IAA），提升土壤养分有效性，促进植株根系发育；有研究证实，大肠杆菌可显著提高玉米、番茄的株高、根长及生物量 [8-10]。多功能 PGPR 可改善植物养分吸收效率、调控根际微生态环境，在可持续农业领域具备广阔应用潜力 [9-11]。
咖啡根际富集以芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）为核心的有益微生物类群，部分菌株具备较强的解磷与产 IAA 能力 [7]。当前，针对咖啡专用高效促生菌株的筛选与应用研究仍较为匮乏，难以支撑咖啡绿色栽培的生产需求 [12]。为此，本研究拟从热区土壤中定向筛选兼具解磷、产 IAA、产铁载体功能的促生细菌，并开展分子鉴定；依托室内试验评价菌株解磷、产 IAA 及产铁载体能力，结合温室盆栽试验，探究功能菌株对咖啡幼苗的促生效果。本研究旨在筛选适配咖啡生长的促生细菌资源，明确菌株功能特征及其对咖啡幼苗的促生效应，为咖啡专用绿色农资研发、推动咖啡产业绿色发展提供菌种资源与理论依据。
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土壤样品采自海南省万宁市中国热带农业科学院香料饮料研究所试验基地（18°45′ N，110°13′ E），样地包含咖啡园、次生林、苦丁茶（Ilex kudingcha C.J. Tseng）单作园、可可（Theobroma cacao L.）园及胡椒（ Piper nigrum L.）园。选取健康植株，参照 Zhou 等 [11] 的方法，小心取出根系，轻轻抖落根际松散土壤；将根系连同粘附于根表的根际土壤置于冰盒，运回实验室后 4℃冷藏保存备用。
供试的咖啡幼苗为罗布斯塔中粒种咖啡，育苗参照赵青云等[13]的方法。
初筛培养基：NA 培养基 [14]、产吲哚乙酸（IAA）液体培养基 [15]、蒙金娜无机磷固体溶磷培养基（CHINOOK，货号：CN260038-250 g）、产铁载体检测培养基 [16]。
复筛培养基：产吲哚乙酸（IAA）液体培养基 [15]、蒙金娜无机磷液体溶磷培养基（北京索莱宝科技有限公司，货号：LB0600）、LB 培养基 [16]。
钼锑抗试剂配制参照唐玉娟等 [17] 的方法。
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称取10 g根际土壤样品，放入装有90 mL无菌生理盐水（0.85% NaCl）的三角瓶，置于28℃摇床180 r·min−1震荡培养30 min，梯度稀释，选取10−6、10−7、10−8稀释液，分别吸取0.1 mL，均匀涂布于NA培养皿，每个稀释梯度设置3个重复，置于28℃恒温培养箱中静置培养5 d，观察菌落生长情况[18]。
待平板长出单菌落后，依据菌落形态特征差异挑取单菌落，纯化菌株。将获得的单菌落接入LB液体培养基，28℃，180 r·min−1震荡培养至对数期，与无菌甘油混合后分装冻存管（无菌甘油终浓度25%），置于−80℃冰箱低温保存备用[14]。
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溶磷细菌初筛：将活化后的菌株接种至蒙金娜固体培养皿，28℃恒温静置培养7 d。观察菌株周围是否出现透明圈，若出现透明圈，则表明该菌株具有溶磷能力。采用游标卡尺测量透明圈直径（D）和菌落直径（d），计算D/d值，D/d值越大，表明菌株溶磷能力越强[17]。
产IAA菌株初筛：将活化后的菌株接种至添加L-色氨酸的LB液体培养基，28℃、180 r·min−1振荡培养3 d，
8000 r·min−1离心10 min。取上清液1 mL，加入1mL Salkowski试剂，摇匀后避光静置30 min。若溶液变为粉红色，则表明该菌株具有产IAA能力[15]。产铁载体菌株初筛：将活化后的菌株接种至CAS蓝色培养皿上，28℃恒温静置培养3 d，观察菌株周围是否出现橙色圈。若出现橙色圈，则表明该菌株具有产铁载体能力。采用游标卡尺测量橙色圈直径（D）和菌落直径（d），计算D/d值，D/d值越大，表明菌株的产铁载体能力越强[19]。
溶磷细菌解磷能力定量: 参照随曌一等的方法[20]绘制磷标准曲线。将冷冻保存的菌种活化后接种于LB 液体培养基中，37℃、220 r·min−1 下过夜培养。用无菌水将培养后的菌液调整 OD 600 为 1.0，分别取 1 mL 菌液接种于装有 10 mL 蒙金娜无机磷液体培养基[含Ca3（PO4）2]的试管中，置于 37℃恒温摇床中、220 r·min−1 震荡培养 3 d。将培养液转移至离心管中，10 000 r·min−1 离 心 10 min。采用钼锑抗比色法测定菌株解磷量。
菌株产IAA能力定量：参照伍巧慧等的方法[15]绘制IAA标准曲线。将产IAA菌株接种于含有1.0 g·L−1 L−色氨酸的NB液体培养基中，置于28℃恒温摇床180 r·min−1震荡培养3 d，用酶标仪（600 nm波长）测吸光值，将菌悬液OD值调节至l。然后将菌悬液10 000 r·min−1离心10 min，吸取l mL上清液，加入等体积的Sackowcki’s显色剂，在室温下避光静置30 min，测定吸光值（530 nm波长），以空白培养基为对照，每株菌重复3次。根据标准曲线计算菌株产IAA量。
菌株产铁载体定量测定[17]：挑取活化后的单菌落接种至LB液体培养基，于28℃、150 r/min条件下振荡培养3 d，随后对培养获得的菌悬液进行离心处理。分别取1 mL上清液与1 mLCAS检测液充分混匀，静置1 h。用酶标仪（630 nm波长）测定样品吸光值（As），以等体积混合的LB液体培养基与CAS检测液吸光值为对照参比值（Ar），测定菌株发酵3d的铁载体产量。As/Ar值在0～0.6、0.6～0.8、0.8～1.0分别表示产铁载体能力较强、中等、较弱。铁载体活性单位（Siderophore Unit，su），su=[（Ar−As）/Ar]×100%（As:样品吸光值，Ar:对照吸光值）。
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挑取单菌落于PCR管中，采用细菌通用引物27F3和1492R进行 PCR 扩增。PCR 反应体系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix Ⅱ 25 μL；引物 1492R（10 µmol·L−1）1.25 μL；引物 27F（10 µmol·L−1）1.25 μL；ddH2O 20 μL；DNA 模板（OD600 nm 0.7-0.8）2.5 μL。PCR扩增反应程序采用三段式温控程序，具体参数设置为：94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，32 个循环；72℃后延伸 5 min，4℃保存[20-21]。将扩增的 PCR 产物委托上海市凌恩生物进行16S rDNA 基因测序。利用 MEGA 11.0 软件构建系统发育树，最后用邻接法构建系统发育树自展数为1 000。
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分菌株活化后制备种子液，按照1%比例接种至 LB 液体培养基培养，获得菌悬液。菌悬液于10 000 r·min−1 离心 10 min。弃去上清液，收集菌体沉淀。用无菌水重悬菌体，充分混匀。将重悬后的菌悬液与牛粪有机肥（有机质45%、全氮1.7%、P2O51.7%、K2O 2.2%）按照6%（v/m）的比例混合，用无菌水调节含水量至65%，静置发酵5 d后备用[22]。取上述 6 种单菌肥等质量均匀混合，得到复合微生物菌肥（Mix）。
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选取定量复筛效果最优的6株菌开展后续试验。挑选长势一致且具两片子叶的咖啡幼苗布置盆栽试验。试验设置 9 个处理，每处理重复10盆，每盆装土800 g。试验处理如下：空白对照（CK）：1%无菌水（水/土）；有机肥对照（OF）：1%有机肥；HJ13 处理：1%HJ13 微生物菌肥；CS14 处理：1%CS14 微生物菌肥；CS10 处理：1% CS10 微生物菌肥；C16 处理：1% C16 微生物菌肥；Kd2-18 处理：1%Kd2-18 微生物菌肥；KK7 处理：1%KK7 微生物菌肥；Mix处理：1%复合微生物菌肥。
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咖啡幼苗移栽60d后测定植株生长与生理指标。采用便携式叶绿素测定仪测定叶片叶绿素、氮平衡指数。采用直尺测量株高，即植株基部至顶端的高度。采用电子天平称量地上部与地下部鲜质量。采用WinRHIZO根系扫描系统扫描根系，获得根系形态特征参数。将地上部植株和根系分别装入牛皮纸袋中放入烘箱，105℃杀青30 min，调节温度至80℃持续烘干至恒重，测定地上部与根系干质量。
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本试验所有数据均使用 Microsoft Excel 2021 进行初步整理和计算，结果以“平均值±标准偏差”（Mean±SD）表示。采用SPSS 26.0软件对数据单因素方差分析（ANOVA），在方差分析结果显著的前提下，采用Duncan多重比较法进行多重比较，P<0.05为差异显著。16S rDNA测序结果在 NCBI 上利用 BLAST 工具进行比对后，利用 MEGA 11.0 软件构建系统发育树。
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采用NA培养基，从5种不同作物根际土壤中分离获得可培养细菌菌株，经划线纯化后，共获得100株纯培养菌株，其中从咖啡园中筛选出18株，次生林中筛选出11株，苦丁茶单作种植园中筛选出32株，可可园中筛选出19株，胡椒园中筛选出20株。对初步筛选获得的100株细菌菌株进行溶磷、产IAA、产铁载体能力检测，通过比较培养皿中透明圈大小及染液染色情况，挑选出透明圈大及显色反应颜色深的菌株。其中，共筛选出42株解磷菌株，各菌株溶磷能力有显著性差异，其中CS14（从次生林土壤中筛选获得）、CS10、KK7（从可可园土壤筛选获得）、HJ13（从胡椒园土壤中筛选获得）溶磷能力高于其它菌株，D/d值分别为2.648、2.472、1.952、1.656。由表1可知，6株菌解磷量具有显著差异，菌株CS14、CS10、KK7、Kd2-18（从苦丁茶园土壤中筛选获得）、HJ13解磷量分别为600.362、589.158、375.786、135.502、97.587 mg·L−1，而C16无解磷能力（表1、图1）。
表 1 不同菌株解磷能力
Table 1. Phosphorus solubilization capacity of different strains
菌株
StrainD/d 解磷量/（mg·L−1）
Phosphate solubilizationCS14 2.65±0.12a 600.36±4.78a CS10 2.47±0.10a 589.16±1.66a KK7 1.95±0.13b 375.79±11.10b HJ13 1.66±0.06c 97.59±2.17 d Kd2-18 1.07±0.01d 135.50±2.80c C16 − − 注：“−”表示未检测到该活性；D/d为溶磷圈与菌落直径比值；菌株编号中字母CS、KK、HJ、Kd、C分别表示菌株从次生林、可可园、胡椒园、苦丁茶园、咖啡园中土壤筛选获得。表中数据表示为平均值±标准偏差（3次重复）。同列不同小写字母表示不同处理间差异性显著（P<0.05）。下同。 Note: "−" indicates that the activity was not detected. D/d represents the ratio of the phosphorus solubilization zone diameter to the colony diameter. The letters CS, KK, HJ, Kd, and C in the strain codes indicate that the strains were isolated from soils collected from secondary forest, cocoa plantation, pepper plantation, Kuding tea plantation, and coffee plantation, respectively. Values are expressed as means ± standard deviation（n=3）. Different lowercase letters in the same column indicate statistically significant differences among the treatment groups（P<0.05）. Similarly hereinafter. 
图 1 不同菌株在蒙金娜培养基上的溶磷圈
Figure 1. Phosphate-dissolving zones of different strains on Mengjinna medium
共筛选出67株产IAA的功能菌株，白瓷板中反应液颜色越深表示菌株产IAA能力越高。Kd2-18比色反应为红色，合成IAA量高于其它菌株（图2）。定量测定结果表明，筛选出的6株菌能产生IAA，各菌株合成IAA的能力差异显著。菌株Kd2-18产IAA量为176.711 mg·L−1，显著高于其他菌株，HJ13、CS14产IAA量分别为49.889、43.055 mg·L−1，CS10、KK7、C16产IAA能力次之，分别为19.947 、12.856 、12.521 mg·L−1（表2）。
图 2 菌株产IAA显色反应
Figure 2. Chromogenic reaction for IAA produced by strains
表 2 不同菌株产IAA能力
Table 2. IAA-producing ability of different strains
菌株
StrainIAA浓度/（mg·L−1）
IAA concentrationKd2-18 176.71±1.18a HJ13 49.89±0.91b CS14 43.06±0.85c CS10 19.95±0.54d KK7 12.86±0.04e C16 12.52±0.31e 将分离出的细菌经活化后通过CAS检测法定性检测，其中，53株细菌可在CAS培养皿上产生透明圈，初步判定有产铁载体能力，占菌株总数53%。从图3 可以看出，菌株CS10和CS14周围的透明圈较大。从表3可以看出，各菌株产铁载体能力有明显差异，其中菌株CS10、CS14、KK7、C16、HJ13D/d值分别为1.671、1.403、1.391、1.384、1.102，而Kd2-18无产铁载体能力。对筛选出的菌株进行定量测定，从表3中可看出各株菌产铁载体活性差异性显著，其中CS10和CS14螯合铁载体活性分别为78.793%、63.008%，菌株Kd2-18无螯合铁载体能力。
图 3 不同菌株在CAS培养皿上产铁载体能力
Figure 3. Siderophore production (CAS assay)by different strains on agar plates
表 3 不同菌株产铁载体能力
Table 3. Siderophore-producing ability of different strains
菌株
StrainD/d 铁载体活性单位/%
Siderophore unitsCS10 1.67±0.04a 78.79±0.34a CS14 1.40±0.02b 63.01±0.68b KK7 1.39±0.04b 38.06±0.14c HJ13 1.38±0.04b 21.17±0.31d C16 1.10±0.01c 35.79±0.19c Kd2-18 - - -
将菌株16S rDNA序列测序结果上传至NCBI数据库，利用BLAST工具进行同源序列比对，筛选获得相似度较高的模式菌株16S rDNA序列，采用MEGA 11软件，基于邻接法（Neighbor-Joining, NJ）构建系统发育进化树（图4），设置Bootstrap重复抽样次数为
1000 次，对进化树分支的可信度进行检验。6株菌分属于5个不同的属，菌株C16与Bacillus cereus strain GC7277同源性达98.88%，置信度为75（图4-A）。菌株CS10与Burkholderia sp. strain BD24-2同源性达98.39%，置信度为94（图4-B）。菌株KK7与Pseudomonas sp. 22DNR同源性达97.64%，置信度为83（图4-C）。菌株CS14与Burkholderia sp. JSA9同源性达98.79%，置信度为98（图4-D）。菌株HJ13与Acinetobacter sp. AVLB2同源性达98%，置信度为87（图4-E）。菌株Kd2-18与Proteus mirabilis strain iR swarm同源性达97.85%，置信度为98（图4-F）。
图 4 不同菌株系统发育树
Figure 4. Phylogenetic trees of different bacterial strains
综上，菌株C16为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），菌株CS10为伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.），菌株KK7为假单胞菌（Pseudomonas sp.），菌株CS14为伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.），菌株HJ13为不动杆菌（Acinetobacter sp.），菌株Kd2-18为奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）。
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施用不同促生菌有机肥均可显著促进咖啡植株幼苗生长，但促生效果不同，其中施用复合菌肥（Mix）组植株长势显著优异于其他处理组。不同施肥处理咖啡植株地上部、地下部干鲜质量、株高结果如图5所示。施用不同生物有机肥均可提升咖啡植株生物量积累。处理CS14植株地上部鲜质量、干质量相较于有机肥处理分别显著增加74.53%、53.31%。处理CS10植株地上部鲜重、地上部干重相较于CK分别显著增加76.49%、62.65%。处理C16植株地上部鲜重、地上部干重相较于CK分别显著增加82.28%、53.33%。与CK相比，处理HJ13地上部鲜重、地上部干重显著增加136.74%、106.21%。处理KK7地上部干质量相较于CK显著增加60.38%。处理Kd2-18地上部鲜重、地上部干重相较于CK分别提升86.44%、73.49%，相较于常规有机肥处理分别提升11.51%、2.60%，与CK及常规有机肥处理差异显著（P<0.05）。处理Mix地上部鲜质量、干质量相较于CK分别提升101.70%、72.35%，相较于常规有机肥处理分别提升20.64%、1.92%，与CK及常规有机肥处理差异显著（P<0.05）。处理Mix地上部干重与CS10、C16、KK7相比分别提升了5.41%、14.71%、8.33%，与Kd2-18相比无显著提升，而较CS14、HJ13分别降低32.76%、15.22%（图5-A）。单一菌剂处理间比较显示，处理CS14的地上部干质量（0.58 g）和鲜质量（2.35 g）均显著高于CS10、C16、KK7及Kd2-18（P<0.05），但与处理HJ13之间差异未达显著水平（P>0.05）。综上，单一菌剂处理CS14对咖啡幼苗地上部生物量积累具有显著的促进作用，而复合菌剂处理的表现优于部分单一菌株处理。
图 5 不同菌剂处理对咖啡幼苗的促生作用
Figure 5. Effects of Different Microbial Inoculant Treatments on the Growth Promotion of Coffee Seedlings
不同处理植株株高差异性显著（P<0.05），其中处理Mix株高为11.10cm，显著高于其余处理，与CK、有机肥处理相比，分别增加了30.59%、10.72%（图5-B）。处理CS14、CS10、C16、HJ31、KK7、Kd2-18株高与CK相比，分别增加了23.24%、18.53%、14.71%、6.76%、30.00%、22.65%（图5-B）。综上所述，施用不同生物有机肥对咖啡幼苗的生物量积累均有显著的促进作用，其中单一菌剂处理中，CS14的促生效果最优。
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从图6可知，施用不同生物有机肥均可显著提高叶片叶绿色含量和氮平衡指数，其中处理CS14叶绿素和氮平衡指数与有机肥处理相比分别增加41.38%、50.28%。处理CS10叶绿素和氮平衡指数与有机肥处理相比分别增加17.24%、6.70%。处理C16叶绿素和氮平衡指数与 有机肥处理相比分别增加31.03%、26.26%。处理HJ13叶绿素和氮平衡指数与有机肥处理相比分别增加28.74%、39.11%。处理KK7叶绿素和氮平衡指数与有机肥处理相比分别增加59.77%、50.84%。处理Kd2-18叶绿素和氮平衡指数与有机肥处理相比分别增加59.77%、50.84%。处理Mix叶绿素和氮平衡指数与有机肥处理相比分别增加45.97%、44.13%。综上所述，菌株Kd2-18对促进咖啡幼苗光合性能与氮素营养方面表现出较强的优势。
图 6 不同菌剂处理对咖啡幼苗叶绿素、氮平衡指数的影响
Figure 6. Effects of microbial agent treatments on chlorophyll and nitrogen balance index in coffee seedlings
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不同处理咖啡幼苗总根长、根平均直径、根总表面积、根尖数如图7 所示，其中复合菌剂处理Mix总根长、根平均直径、根总表面积、根尖数均高于其他处理，分别为2 600.15 mm、0.39 mm、3 130.78 mm2、65.50个，与有机肥处理相比分别显著增加了64.66%、17.42%、91.52%、40.11%。处理CS14总根长、根平均直径、根总表面积、根尖数与有机肥处理相比分别增加了56.81%、6.82%、67.61%、17.11%。处理CS10总根长、根平均直径、根总表面积与有机肥处理相比分别增加了33.45%、18.94%、59.79%，根尖数与CK和有机肥处理分别降低了4.69%、2.14%。处理C16总根长、根平均直径、根总表面积、根尖数与CK相比分别增加了42.28%、23.64%、76.28%。处理HJ13总根长、根平均直径、根总表面积、根尖数与有机肥处理相比分别增加了26.83%、9.85%、40.10%、20.32%。处理KK7总根长、根平均直径、根总表面积与有机肥处理相比分别增加了0.86%、9.85%、10.25%。处理Kd2-18总根长、根平均直径、根总表面积与CK相比分别增加了26.14%、29.10%、41.19%。综上所述，施用生物有机肥对咖啡幼苗根系生长有显著促进作用。处理复合菌剂Mix处理促根效果最优。
图 7 不同菌剂处理对咖啡幼苗根系形态特征的影响
Figure 7. Effects of different microbial agent treatments on root morphological characteristics of coffee seedlings
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本研究从不同作物根际土中分离获得了6株具解磷、产铁载体和产IAA等促生功能的细菌菌株。为初步评估其促生潜力，采用选择培养基对6株菌的解磷、产铁载体和产IAA能力进行了定性检测。比较不同菌株在蒙金娜（解磷）、CAS（产铁载体）培养皿中透明圈大小及与Salkowski试剂反应后颜色深浅，6株菌溶磷圈直径与菌落直径之比（D/d）从大到小依次为CS14>CS10>KK7>HJ13>Kd2-18>C16，其中CS14的D/d值为2.65。CAS培养皿中透明圈D/d从大到小依次为CS10>CS14>KK7>HJ13>C16>Kd2-18，CS10的D/d值为1.67，Kd2-18的D/d值为0。6株菌与Salkowski试剂反应后颜色由深到浅依次为Kd2-18>HJ13>CS14>CS10>KK7>C16。赵艳等[23]利用蒙金娜有机培养基从王草根际分离的21株解磷菌，其培养48 h的D/d值在1.3～7.0之间，72 h在1.72～5.5之间，不同菌株间差异明显，D/d值可有效反映菌株间的相对溶磷能力差异。摇瓶试验结果表明：在蒙金娜（解磷）、LB（产铁载体、IAA）中震荡培养3d后，CS14解磷量最高为600.36 mg·L−1，CS10铁载体活性最高为78.79%，Kd2-18 IAA浓度最高为176.71 mg·L−1。通过定性和定量测定，筛选出了具有多种促生特性的菌株，定量与定性结果在总体趋势上表现一致：CS14在平板中溶磷圈最大，其摇瓶解磷量同样最高；CS10在CAS平板中透明圈最大，其铁载体活性也最强；Kd2-18在Salkowski显色反应中颜色最深，其IAA产量也最高。然而，部分菌株的定性与定量排序并不完全吻合。这种定性排序与定量排序之间的部分偏离，可能与不同菌株铁载体或IAA分泌的动力学特征差异有关。上述结果表明，透明圈直径及菌液显色程度仅可对菌株解磷、产铁载体与产IAA能力进行定性表征，其定量评价仍需通过摇瓶试验完成。本研究所得结论，与李明源等[24]提出的“定性初筛可快速缩小菌株筛选范围，定量复筛是准确评价菌株功能强度必要环节”的研究结论一致。
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通过16S rRNA基因序列分析，菌株C16 为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus），菌株CS14 为双栖伯克霍尔德菌（Burkholderia ambifaria），菌株CS10 为稳定伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis），菌株Kd2 - 18 为奇异变形杆菌（Proteus mirabilis），菌株KK7 为乳酸假单胞菌（Pseudomonas crudilactis），菌株HJ13 为皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）（图4）。现有研究报道指出，上述6株细菌均具备一定水平的解磷、产铁载体及产IAA能力，且对供试作物均表现出一定程度的促生效应[25-29]。马雪晴等[30]从茶树根际筛选出的森林伯克霍尔德氏菌DFP-24同样具备解磷、产IAA、产铁载体，与本研究中CS14和CS10的多功能特性高度一致。
盆栽试验结果表明，筛选获得的高效促生菌株对咖啡幼苗具有显著促生作用。其中施用菌株CS14促生效果最好，植株地上、地下部干重分别比CK提高159.26%、78.29%，复合菌剂Mix对咖啡幼苗根系形态特征有显著促进作用，植株总根长、根平均直径、根总表面积、根尖数与CK相比分别增加了116.78%、40.91%、202.88%、36.46%，表明接种PGPB可显著增加植株生物量和养分积累[31]。在温室条件下，接种PGPB可普遍改善地上和地下部生物量以及养分吸收效率。
菌株的促生效果与其体外促生功能密切相关。本研究中，菌株CS14（Burkholderia ambifaria）与菌株CS10（Burkholderia stabilis）凭借其优异的解磷（600.36 mg·L−1）与产铁载体（78.79%）能力，显著促进了咖啡幼苗生物量积累。与已报道的其他作物根际解磷菌株相比，赵艳等[23]从王草根际分离获得的21株解磷菌溶磷量为4.11～327.1 mg·mL−1，本研究筛选得到的CS14解磷能力处于同类研究的较高水平，这说明菌株CS14能够溶解土壤中的难溶性磷，利于咖啡对难溶性磷的吸收。菌株Kd2-18（Proteus mirabilis）IAA产量为176.71 mg·L−1，显著高于秘鲁咖啡根际来源的固氮螺菌Azospirillum amazonense 1I（66.03 mg·L−1 ）[32]。但值得注意的是，已有研究报道从咖啡内生菌中分离的菌株IAA产量可达257.16 μg·mL−1[33]，从咖啡根际分离的蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus YT2-1C的IAA产量高达193 μg·mL−1[34]。因此，Kd2-18的IAA产量虽高于部分已报道菌株，但并未达到咖啡根际/内生促生菌的最高水平。施用菌株Kd2-18的咖啡植株叶绿素指数（34.75）和氮平衡指数（67.5）最优，结合其IAA产量可推测，可能是该菌株通过分泌高活性IAA调控咖啡幼苗内源激素水平，进而促进植株光合器官发育，提升光合效率与氮素吸收同化能力，最终体现为叶片氮平衡指数与叶绿素水平的提升，该作用路径与IAA调控植物生长发育的经典机制相符。Defez等[35]提出产IAA细菌可通过协调光合功能与碳氮代谢平衡刺激植物生长。Cao等[36]的研究结果表明，B. licheniformis G41可产生吲哚−3−乙酸（IAA）、合成铁载体并溶解难溶磷酸盐，施用该菌株可有效促进脐橙幼苗生长，具备开发为高效环保型微生物肥料的应用潜力。Ferraro等[37]研究表明，根际栖息的丰富PGPB类群对咖啡幼苗的生长具有显著的正向促进作用。综合本研究结果可知，本试验所得结论与前人已报道的PGPB促生效应研究结论一致，进一步验证了植物根际促生菌功能特性与促生效应之间存在相关性。同时，对各项指标的综合分析结果显示，合成菌群展现出更为优异的促生效果，表明菌株组合可有效弥补单菌定殖稳定性差、功能单一的不足[38]。
需要说明的是，本研究采用的根际细菌分离方法为传统分离法，该方法仅适用于初步分离筛选可培养的好氧根际细菌。另外，本研究开展了温室盆栽条件下的短期促生效果验证，菌株在不同土壤类型、不同施肥水平以及不同咖啡生育阶段的促生效应仍需进一步验证。后续研究可综合利用转录组、基因组、代谢组学等多组学技术，解析PGPB−土壤−咖啡跨界互作的分子与微生物生态学机制；构建高效合成菌群，开发复合微生物菌剂，提高菌株在田间条件下的定殖效率和促生效果。
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从不同作物根际土壤中靶向筛选出了同时具备解磷、分泌吲哚乙酸及合成铁载体多重促生功能的菌株C16、CS14、CS10、Kd2-18、KK7、HJ13，经16S rDNA分子生物学鉴定，分别为蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、双栖伯克霍尔德菌（Burkholderia ambifaria）、稳定伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、乳酸假单胞菌（Pseudomonas crudilactis）、皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）；菌株CS14解磷量高达600.36 mg·L−1，菌株Kd2-18产IAA能力最高，达176.71 mg·L−1，菌株CS10产铁载体能力最强，铁载体活性单位达78.79%；施用功能微生物对咖啡幼苗生长均具促生作用，复合菌株可能协同发挥溶磷、产IAA和产铁载体等多种促生功能，其促生效果优于单一菌株，具有更好的应用潜力。综上，本研究从土壤中筛选并获得了对咖啡植株具有显著促生作用的高效功能菌株，为咖啡种植中绿色农业投入品的开发提供了重要的菌种资源储备。
高效促生细菌筛选鉴定及其对咖啡幼苗的促生效果研究
DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20260113
CSTR: 32425.14.j.cnki.rdswxb.20260113
Screening and identification of efficient plant growth-promoting bacteria and their growth-promoting effects on coffee seedlings
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摘要: 有益功能微生物在植物促生方面具有重要作用，本研究旨在筛选适配咖啡的促生细菌资源并解析其促生效应，为咖啡（Coffea L.）绿色投入品研发与化肥减量施用提供支撑。从热带土壤中分离细菌，经复筛获得 54 株多功能促生菌株；定性与定量测定菌株溶磷、产 IAA 及产铁载体能力，结合形态学特征与 16S rDNA 序列完成菌株鉴定，并通过盆栽试验评价单一菌株及混合菌剂对咖啡幼苗的促生效果。结果表明，从热带土壤分离得到 100 余株细菌，复筛获得 54 株多功能促生细菌；其中菌株 CS10、CS14、KK7、HJ13 同时具备溶磷、产 IAA 和产铁载体活性，CS14 溶磷量最高，达 600.36 mg·L−1，Kd2-18 产 IAA 能力最强，为 176.71 mg·L−1。经鉴定，C16、CS14、CS10、Kd2-18、KK7、HJ13 分别为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、双栖伯克霍尔德菌（Burkholderia ambifaria）、稳定伯克霍尔德菌（Burkholderia stabilis）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、乳酸假单胞菌（Pseudomonas crudilactis）、皮特不动杆菌（Acinetobacter pittii）。盆栽试验显示，供试菌株均可显著促进咖啡幼苗生长，混合菌处理促生效果最优；与对照相比，株高、地上部鲜质量、地上部干质量、地下部鲜质量、地下部干质量分别提升 30.59%、101.70%、72.35%、124.40%、25.33%，根系总根长、根平均直径、根总表面积、根尖数分别提高 116.78%、40.91%、202.88%、36.46%。综上，本研究筛选获得多株高效促生咖啡幼苗的功能细菌，菌株可通过分泌生长素、溶解难溶性磷、产生铁载体等途径发挥促生作用，可为咖啡健康种苗培育及绿色菌肥研发提供菌株资源与理论依据。Abstract: Beneficial functional microorganisms play an important role in promoting plant growth. An attempt was made to screen plant growth-promoting bacterial resources suitable for coffee and analyze their growth-promoting effects, so as to provide support for the development of green agricultural input products and chemical fertilizer reduction. Bacteria were isolated from tropical soils under crop plantations and secondary forest, and 54 strains of multifunctional plant growth-promoting bacteria were obtained after rescreening. The phosphorus-solubilizing, IAA-producing and siderophore-producing capacities of the strains were determined qualitatively and quantitatively. The bacterial strains were identified by morphological observation combined with 16S rDNA gene sequencing. Pot experiments were conducted to evaluate the growth-promoting effects of single strains and mixed bacterial inoculants on coffee seedlings. Results showed that more than 100 bacterial strains were isolated from the tropical soils, of which 54 multifunctional plant growth-promoting strains were acquired after rescreening. Among them, strains CS10, CS14, KK7 and HJ13 possessed phosphorus-solubilizing, IAA-producing and siderophore-producing abilities simultaneously. Strain CS14 had the highest phosphorus-solubilizing capacity of 600.36 mg·L−1, while strain Kd2-18 exhibited the maximum IAA production of 176.71 mg·L−1. Strains C16, CS14, CS10, Kd2-18, KK7 and HJ13 were identified as Bacillus cereus, Burkholderia ambifaria, Burkholderia stabilis, Proteus mirabilis, Pseudomonas crudilactis and Acinetobacter pittii, respectively. Pot trials revealed that all tested strains significantly promoted the growth of coffee seedlings, and that the mixed bacterial treatment achieved the optimal growth-promoting performance. Compared with the control, all the tested strains increased the plant height, shoot fresh weight, shoot dry weight, root fresh weight and root dry weight of coffee seedlings by 30.59%, 101.70%, 72.35%, 124.40% and 25.33%, respectively, and total root length, average root diameter, total root surface area and root tip number by 116.78%, 40.91%, 202.88% and 36.46%, respectively. In conclusion, several functional bacterial strains were determined to have remarkable promoting effects on coffee seedling growth. These strains can promote coffee seedling growth via multiple mechanisms including auxin secretion, solubilization of soil insoluble phosphorus and siderophore production. The findings can provide strain resources and theoretical basis for the cultivation of healthy coffee seedlings and the development of green bacterial fertilizers.
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Key words:
- Coffee /
- plant growth-promoting bacteria /
- phosphorus solubilization /
- IAA /
- siderophore /
- pot experiment
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图 3 不同菌株在CAS培养皿上产铁载体能力
Fig. 3 Siderophore production (CAS assay)by different strains on agar plates
图 5 不同菌剂处理对咖啡幼苗的促生作用
注：CK:空白对照；OF：有机肥对照；Mix:复合菌肥处理；KK7：KK7 微生物菌肥处理；Kd2-18:Kd2-18微生物菌肥处理；CS10:CS10微生物菌肥处理；CS14:KK7 微生物菌肥处理；C16:C16 微生物菌肥处理；HJ13:HJ13 微生物菌肥处理。
Fig. 5 Effects of Different Microbial Inoculant Treatments on the Growth Promotion of Coffee Seedlings
Note: CK: blank control; OF: organic fertilizer control; Mix: compound bio-organic fertilizer treatment; KK7: KK7 bio-organic fertilizer treatment; Kd2-18: Kd2-18 bio-organic fertilizer treatment; CS10: CS10 bio-organic fertilizer treatment; CS14: KK7 bio-organic fertilizer treatment; C16: C16 bio-organic fertilizer treatment; HJ13: HJ13 bio-organic fertilizer treatment.
图 6 不同菌剂处理对咖啡幼苗叶绿素、氮平衡指数的影响
Fig. 6 Effects of microbial agent treatments on chlorophyll and nitrogen balance index in coffee seedlings
图 7 不同菌剂处理对咖啡幼苗根系形态特征的影响
Fig. 7 Effects of different microbial agent treatments on root morphological characteristics of coffee seedlings
表 1 不同菌株解磷能力
Table 1 Phosphorus solubilization capacity of different strains
菌株
StrainD/d 解磷量/（mg·L−1）
Phosphate solubilizationCS14 2.65±0.12a 600.36±4.78a CS10 2.47±0.10a 589.16±1.66a KK7 1.95±0.13b 375.79±11.10b HJ13 1.66±0.06c 97.59±2.17 d Kd2-18 1.07±0.01d 135.50±2.80c C16 − − 注：“−”表示未检测到该活性；D/d为溶磷圈与菌落直径比值；菌株编号中字母CS、KK、HJ、Kd、C分别表示菌株从次生林、可可园、胡椒园、苦丁茶园、咖啡园中土壤筛选获得。表中数据表示为平均值±标准偏差（3次重复）。同列不同小写字母表示不同处理间差异性显著（P<0.05）。下同。 Note: "−" indicates that the activity was not detected. D/d represents the ratio of the phosphorus solubilization zone diameter to the colony diameter. The letters CS, KK, HJ, Kd, and C in the strain codes indicate that the strains were isolated from soils collected from secondary forest, cocoa plantation, pepper plantation, Kuding tea plantation, and coffee plantation, respectively. Values are expressed as means ± standard deviation（n=3）. Different lowercase letters in the same column indicate statistically significant differences among the treatment groups（P<0.05）. Similarly hereinafter. 
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表 2 不同菌株产IAA能力
Table 2 IAA-producing ability of different strains
菌株
StrainIAA浓度/（mg·L−1）
IAA concentrationKd2-18 176.71±1.18a HJ13 49.89±0.91b CS14 43.06±0.85c CS10 19.95±0.54d KK7 12.86±0.04e C16 12.52±0.31e
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表 3 不同菌株产铁载体能力
Table 3 Siderophore-producing ability of different strains
菌株
StrainD/d 铁载体活性单位/%
Siderophore unitsCS10 1.67±0.04a 78.79±0.34a CS14 1.40±0.02b 63.01±0.68b KK7 1.39±0.04b 38.06±0.14c HJ13 1.38±0.04b 21.17±0.31d C16 1.10±0.01c 35.79±0.19c Kd2-18 - -
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