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肉鸡养殖业在我国畜牧业中扮演重要角色，尤其是海南省的肉鸡规模效率达到1，明显优于其他省份[1]。文昌鸡作为海南省特色畜禽品种，在当地畜禽养殖业中起到支撑作用，但在其养殖过程中极易受到肠道疾病的困扰，如大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等引发的疫病或菌落失调症等。治疗此类疾病往往只有抗生素疗法，但抗生素的大量使用，增强了细菌的耐药性和相关产品的药物残留，严重危害动物和人体健康，因此，人们迫切需要寻找到新的产品来替代抗生素 [2]；此外，饲料抗生素添加剂于2020年开始被全面禁止[3]。可见，饲料中添加抗生素替代品的需求进一步加大。
在抗生素替代品的选择中，乳酸菌具有较大的优势。乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制肠道病菌、利于营养物质的消化吸收、提高机体免疫系统能力等作用，同时其具有生长快、产酸量高等特点 [4]；乳酸菌作为微生态饲料添加剂在畜牧业中的使用越来越广泛，是抗生素的理想替代品[5]。
近年来，国内外对优良乳酸菌菌株的筛选及益生特性的研究比较活跃 [6-7]，但是对热带动物肠道源乳酸菌的筛选研究较少。海南省拥有独特的热带季风和海洋气候，炎热潮湿的气候利于细菌的滋生[8]，加之环境的不同也会影响益生菌的生存以及功能的发挥 [9-10]。因此，本试验针对热带地区的家禽养殖业，以海南文昌鸡肠道内容物为样品，从中分离筛选优质热带动物肠道源抑菌乳酸菌，为微生态制剂替代抗生素提供更广泛的原料来源和理论依据。
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试验用海南文昌鸡4只经处死后，采集肠道粘膜及内容物，分别放于不同编号的10 mL试管内，4 ℃保存备用。
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MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基和LB肉汤培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。细菌基因组提取试剂盒购自北京全式金生物有限公司。Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×) 购自北京擎科生物科技有限公司。
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菌株均由本实验室提供，信息如表1所示，标准菌株于−80 ℃低温保存，保存完好，未被污染。
表 1 标准菌株信息
标准菌株种类 菌株编号 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu) ATCC 29213 大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 25922 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella) ATCC 50013 -
电子天平（PA2004C，上海佑科仪器仪表有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ.L-75，鸡西市辰丰医疗器械制造有限公司）；恒温培养摇床（FS-70B，黄骅菲斯福实验仪器有限公司）；微波炉（20MX34-L，中山东菱威力电器有限公司）；冰箱（BCD-218STPS，海尔智家股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（WGL-230B，黄骅菲斯福实验仪器有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2F，苏州净化设备有限公司）；医用低温箱（MDF-U5386S，松下健康医疗器械有限公司）等。
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按照试剂盒说明书提取菌株的DNA，保存于−20 ℃备用。
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扩增菌株16S rRNA基因序列所用的引物如表2所示。
表 2 16S rRNA基因序列测序所用引物序列
引物名称 序列(5′ to 3′) 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT -
取1 g肠道内容物，溶入到生理盐水中，摇匀，以10倍为梯度，逐渐稀释到10−5，取最后2～3个稀释梯度的液体20 μL，利用涂布棒涂到已加入2% CaCO3的MRS固体培养基上，利用封口膜封口，37 ℃下放置2 d。挑选形态较好且产生钙圈的单菌落置于MRS肉汤培养基中，继续培养16～24 h，将菌液接种到平板上培养2 d，即完成1次纯化。纯化3次之后，获得形态较为一致的菌落。取已培养16～24 h的菌液与50%的灭菌丙三醇等量，加入到2 mL小离心管中进行混合，设置3个重复，做好标记，放超低温冰箱内备用。
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观察分离的菌株，挑选在培养基上产生溶钙圈且呈乳白色、凸起、边缘整齐、稍大的单菌落，进行过氧化氢和革兰氏染色鉴定。
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在干净的载玻片上滴加2滴10%H2O2溶液，从培养的菌板上利用移液枪挑取单菌落置于H2O2溶液中。观察是否产生小气泡，出现气泡为阳性，不产生为阴性。保留结果为阴性的菌株，用于革兰氏染色鉴定。
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将1.3.2中的不产生气泡的菌按照革兰氏染色试剂盒的说明进行操作，在光学显微镜下观察其特性。紫色为革兰氏阳性，蓝色为阴性。保留阳性菌。
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rRNA基因序列鉴定 PCR扩增采用通用引物27F和1 492R，使用Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×)进行PCR扩增，模板选用1.1.5中保存的菌株DNA。具体要求见表3、4。
表 3 PCR反应条件
阶段 温度/℃ 时间/s 循环数 预变性 95 180 变性 95 30 30 退火 55 30 30 延伸 72 90 30 保存 4 表 4 PCR反应体系
试剂 使用量/μL 模板 2 27F 2 1492R 2 Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×) 44 总体积 50 扩增后配制2%的琼脂糖凝胶进行电泳。PCR产物送至生工生物公司进行测序分析。将16S rRNA基因序列测定的结果上传到NCBI网站，进行BLAST同源性比对，确定菌株种类。
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（1）配制固体LB培养基，灭菌并置于60 ℃的水浴锅中进行保温备用。
（2）将乳酸菌的单菌落移入MRS培养基中，于37 ℃培养16～24 h作为种子液。取0.1 mL种子液接种到0.9 mL灭菌的MRS培养液中，在37 ℃培养16～24 h。将标准菌株（大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）接种于LB培养液中进行过夜培养。
（3）待步骤（1）准备的LB琼脂培养基降到50 ℃后分别加入标准菌株作为指示菌。按照0.25%的比率进行添加，混合充分后倒入已安放好4个牛津杯的一次性培养皿中，每个皿加入14 mL培养基。20 min后，将牛津杯取出，4个孔各自注入不同的乳酸菌上清液100 μL。乳酸菌上清液加入后，常温放置2～3 h，待液面下降到培养皿皿底后，移到培养箱中培养。
（4）24 h后，利用千分尺测量抑菌圈的直径，记录数据。
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（1）将MRS液体培养基配置好，使用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节pH到2.5。
（2）将初步抑菌试验获得的菌株接种到培养液中，于37 ℃培养12～24 h。
（3）将已培养好的菌液涡旋40 s，以10为倍数进行梯度稀释（0.1 mL菌液加入到0.9 mL 0.9%氯化钠溶液中），逐步稀释到10−6，取100 μL菌液进行涂布，做3次重复试验，涂好的培养皿用封口膜进行封口，培养36～48 h。
（4）取100 μL上述的菌液接种到900 μL pH 2.5的培养液中，培养2 h后取出。
（5）2 h后取出，以10为梯度进行稀释，逐渐稀释到10−6，取100 μL涂板。同样，每个菌重复3次以上操作，用于对照。
（6）培养36～48 h后，统计菌落的数量。
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试验方法同1.3.6。将pH 2.5的MRS溶液替换为0.25%的PBS胆盐溶液进行试验，同样设置3个重复。
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通过MRS琼脂培养基培养，进行分离纯化获得了可以产生溶钙圈、形态为圆形、边缘整齐、呈乳白色等的单菌落。经过氧化氢阴性和革兰氏染色阳性鉴定，共筛选到17株菌株，其鉴定结果见表5。
表 5 乳酸菌初步筛选结果
菌株 菌株形态特征 过氧化氢试验 革兰氏染色 S2-4 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S2-2 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S3-2 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-1 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-5 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-6 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-8 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K1-6 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K2-2 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K3-7 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K4-5 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 H3-6 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 H4-1 菌落大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K4-6 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性 K2-3 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性 K4-7 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性 K3-3 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性 -
提取经初筛获得的17株乳酸菌的基因组DNA,利用通用引物扩增其16S rRNA基因序列。经测序后，在NCBI上进行BLAST同源性比对，结果如表6。表6显示本实验筛选的17株菌的相似度均达到97%及以上，其中，13株菌为植物乳杆菌，4株菌为粪肠球菌。
表 6 同源性比对结果
编号 种属 相似度/% 编号 种属 相似度/% S2-4 植物乳杆菌 98 K3-7 植物乳杆菌 100 S2-2 植物乳杆菌 98 K4-5 植物乳杆菌 98 S3-2 植物乳杆菌 98 H3-6 植物乳杆菌 98 S4-1 植物乳杆菌 98 H4-1 植物乳杆菌 98 S4-5 植物乳杆菌 98 K4-6 粪肠球菌 99 S4-6 植物乳杆菌 97 K2-3 粪肠球菌 99 S4-8 植物乳杆菌 98 K4-7 粪肠球菌 99 K1-6 植物乳杆菌 98 K3-3 粪肠球菌 99 K2-2 植物乳杆菌 98 注：“相似度”指与NCBI数据库相应菌株16S rRNA序列结果的比对相似度。 -
如表7所示，这些菌株对标准菌株的抑菌圈直径之和均在41～45 mm之间，抑菌效果接近，其中编号为S4-1的菌株抑菌圈直径之和最大，为44.3 mm。
表 7 不同对照组抑菌圈直径之和
编号 抑菌圈直径之和/mm 编号 抑菌圈直径之和/mm S2-4 42.89 K1-6 42.80 S2-2 43.66 K2-2 42.97 S3-2 43.20 K3-7 42.87 S4-1 44.30 K4-5 43.10 S4-5 41.71 H3-6 41.65 S4-6 42.40 H4-1 41.61 S4-8 42.37 注：另外4株菌株未见明显抑菌圈。 由图1可得，筛选所获得的13株植物乳杆菌对3种病原菌均有抑制作用，抑菌圈直径接近14 mm，为中度敏感[11]的类型。不同植物乳杆菌对不同病原菌的抑菌效果存在一定的差异，其中植物乳杆菌S4-1对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径超过15 mm。
图 1 不同菌株的抑菌圈直径
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乳酸菌在pH 2.5 的培养液中培养2 h的存活率如图2所示。植物乳杆菌K1-6的耐酸性能最好。不同的菌株存活率差异较大，植物乳杆菌均有一定的耐pH的特性。
图 2 乳酸菌菌株在pH 2.5处理下的存活率
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乳酸菌在胆盐浓度为0.25%的情况下保持2 h的存活率，如图3所示。S4-5和H3-6的乳酸菌存活率较高，K3-7的菌株存活率较低，不同菌株间的差异较大。
图 3 乳酸菌菌株在0.25%胆盐处理下的存活率
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海南岛地处热带，具有高温高湿的环境。这种炎热潮湿的气候一方面利于细菌的滋生，影响动物的健康养殖；另一方面高温高湿环境会影响动物肠道微生物的组成[12-13]，影响益生菌功效的发挥。目前针对热带地区益生菌筛选鉴定的研究较少，因此本研究选择海南文昌鸡的肠道内容物，通过16S rRNA基因序列测序、耐受试验和抑菌试验等一系列体外评价，筛选出在当地环境下抑菌效果较好的乳酸菌株，为开发热带畜禽养殖乳酸菌制剂提供材料。
目前研究表明，乳酸菌在畜禽肠道中，能够形成一层菌膜，帮助机体抵抗病原菌的侵袭，提高畜禽的抵抗力。养殖环境中存在的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌是引起畜禽肠道疾病的主要病原菌[11]。因此在本试验中选择了这3种菌作为评价益生菌体外抑菌能力强弱的指示菌。试验的结果也表明文昌鸡肠道源的多株植物乳杆菌对这3株病原菌均具有抑菌活性。这符合前人大量关于乳酸菌抑菌的理论研究的结论，如乳酸菌会释放一些有机酸、细菌素等小分子物质，这些物质具有一定的抑菌能力[14]。本试验中筛选到植物乳杆菌S4-1对大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌效果，其对金黄色葡萄球菌的抑菌能力最强，具有开发为饲用乳酸菌的潜力。
拥有良好抑菌特性的外源乳酸菌要在畜禽肠道内发挥其生物学效应，还必须保证其能通过畜禽的胃进入肠道。畜禽的胃中具有低的pH环境，因此益生菌必须具有较高的酸耐受性[5]。而不同的菌株耐受低pH值的能力也不同，因此本试验对初步筛选的益生菌也进行了酸耐受性的试验。此外，畜禽肠道中具有较高浓度的胆汁，胆汁对细菌有较强的破坏能力,胆盐对乳酸菌的细胞膜具有溶解性，导致乳酸菌的死亡[15]。因此为了保证较多数的活菌能在肠道中生长和繁殖，发挥其生物学效应，必须筛选出对胆盐具有一定耐受力的乳酸菌。因此本研究在体外也评价了益生菌的胆盐耐受性。结果表明，植物乳杆菌S4-1具有较高的酸耐受性和一定的胆盐耐受性，综合抑菌效果最好。笔者认为该菌具有作为热带及其他地区畜禽饲用乳酸菌的潜力。
不同来源的益生菌具有不同的温度适应性，谢曈[16]等通过对10种益生菌研究发现其耐高温能力存在差异。菌株的高温耐受性有助于其在畜禽肠道生长和后期工业应用，也是优良益生菌的特性之一。相较于其他地区的乳酸菌，本实验所筛选出的植物乳杆菌S4-1来源热带地区，在耐高温方面具有先天优势。此外，前人研究表明，在鸡和猪的日粮中添加乳酸菌，均能有效改善肠道菌群结构，降低肠道中大肠杆菌数量[17-18]。但本实验尚未进行动物体内实验，植物乳杆菌S4-1对机体的影响有待进一步验证。
Screening and identification of lactic acid bacteria with bacteriostatic activity from Wenchang Chicken in Hainan
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摘要: 为获取具有抑菌活性的海南文昌鸡源乳酸菌，笔者以海南文昌鸡的肠道粘膜及内容物为样品分离乳酸菌。通过菌株形态观察，革兰氏染色镜检、过氧化氢试验和16S rRNA基因序列测序鉴定乳酸菌；而后利用乳酸菌对酸和胆盐的耐受性及其抑菌试验从中筛选出热带动物肠道源抑菌乳酸菌。本研究共获得17株乳酸菌，分别为13株植物乳杆菌和4株粪肠球菌，其中植物乳杆菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均有较高抑制作用，有一定耐酸耐胆盐的能力；粪肠球菌抑菌效果均较差。研究结果表明，筛选获得的海南文昌鸡源植物乳杆菌S4-1综合抑菌效果较好，可用于畜禽肠道益生菌制剂开发的后续研究。Abstract: Lactic acid bacteria were isolated from the intestinal mucosa and contents of Wenchang Chicken in Hainan to obtain the strains of lactic acid bacteria with bacteriostatic activity. The isolates were determined and identified by morphological observation, Gram staining, hydrogen peroxide test, and 16S rRNA gene sequencing, and their acid and bile tolerance were tested by using the acid tolerance test and the bile salt tolerance test to screen the lactic acid bacteria with bacteriostatic activity from the intestinal tracts of tropical animals. A total of 17 strains of lactic acid bacteria were selected from the isolates, including 13 strains of Lactobacillus plantarum and 4 strains of Enterococcus faecalis. Of the 17 strains isolated, the strains of L. plantarum showed a high inhibition of Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Salmonella typhimurium, and had some tolerance to acid and bile, while the strains of Enterococcus faecalis had low bacteriostatic effect. Comprehensive evaluation showed that the strain S4-1 of L. plantarum showed a higher bacteriostatic effect. The strain S4-1 of L. plantarum isolated from Wenchang Chicken in Hainan can hence be used as a follow-up study for the development of probiotic preparations for livestock intestines.
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Key words:
- Wenchang chicken /
- lactic acid bacteria /
- bacteriostasis /
- screen
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表 1 标准菌株信息
标准菌株种类 菌株编号 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu) ATCC 29213 大肠杆菌(Escherichia coli) ATCC 25922 鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella) ATCC 50013 
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表 2 16S rRNA基因序列测序所用引物序列
引物名称 序列(5′ to 3′) 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT
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表 5 乳酸菌初步筛选结果
菌株 菌株形态特征 过氧化氢试验 革兰氏染色 S2-4 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S2-2 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S3-2 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-1 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-5 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-6 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 S4-8 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K1-6 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K2-2 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K3-7 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K4-5 菌落较大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 H3-6 菌落较小，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 H4-1 菌落大，有突起，呈乳白色，边缘光滑 阴性 阳性 K4-6 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性 K2-3 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性 K4-7 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性 K3-3 菌落较小，突起较小，呈略透明，边缘光滑 阴性 阳性
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表 6 同源性比对结果
编号 种属 相似度/% 编号 种属 相似度/% S2-4 植物乳杆菌 98 K3-7 植物乳杆菌 100 S2-2 植物乳杆菌 98 K4-5 植物乳杆菌 98 S3-2 植物乳杆菌 98 H3-6 植物乳杆菌 98 S4-1 植物乳杆菌 98 H4-1 植物乳杆菌 98 S4-5 植物乳杆菌 98 K4-6 粪肠球菌 99 S4-6 植物乳杆菌 97 K2-3 粪肠球菌 99 S4-8 植物乳杆菌 98 K4-7 粪肠球菌 99 K1-6 植物乳杆菌 98 K3-3 粪肠球菌 99 K2-2 植物乳杆菌 98 注：“相似度”指与NCBI数据库相应菌株16S rRNA序列结果的比对相似度。
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表 7 不同对照组抑菌圈直径之和
编号 抑菌圈直径之和/mm 编号 抑菌圈直径之和/mm S2-4 42.89 K1-6 42.80 S2-2 43.66 K2-2 42.97 S3-2 43.20 K3-7 42.87 S4-1 44.30 K4-5 43.10 S4-5 41.71 H3-6 41.65 S4-6 42.40 H4-1 41.61 S4-8 42.37 注：另外4株菌株未见明显抑菌圈。
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图(3) / 表 (7)
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