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菜心(Brassica campestris L.ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee)又称菜薹,是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种中以花薹为产品的蔬菜,是华南地区特色蔬菜之一,在海南的市场供应中居于重要位置[1-2。海南省高温高湿的气候条件,尤其是6月至8月,导致夏季蔬菜生产困难,其中立枯病是重要土传病害,严重影响菜心的产量和品质[3-5]。
菜心立枯病病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani),隶属半知菌亚门,是一种土壤传播的强腐生真菌,喜温暖湿润的环境,对干旱有较强抵抗力,在温室或大棚育苗中若环境温湿度适宜,可一年四季发生侵染[6-8]。该菌可侵染多种作物,包括甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)[9]、黄瓜(Cucumis sativus)[10]、番茄(Solanum lycopersicum)[11]、水稻(Oryza sativa)[12]、柑橘(Citrus spp.)[13]、棉花( Gossypium hirsutum)[14]等。目前立枯病防治主要依赖化学杀菌剂[15-16],但容易带来农药残留、土壤污染及病原菌耐药性增强等问题。因此,为控制菜心立枯病、提高其产量和品质,亟需安全有效的方法替代化学杀菌剂,而生物防治因环境友好,成为理想选择[17-18]。
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)受到科研与产业界的广泛关注,已被科研人员从多种生境中成功分离,包括植物根际土壤、植物体内、水体等,显示出其极强的环境适应性[19-21]。大量研究表明,该菌对植物病原菌的抑制作用具有广谱性:在茄科作物中,对番茄青枯病病原菌(Ralstonia solanearum)的相对防效原菌的抑制作用具有广谱性:在茄科作物中,对番茄青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)的相对防效可达40.23%[22];在禾本科作物中,能显著降低玉米茎腐病(Fusarium graminearum)的发病株率[23];在果树中,对采摘后葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)的保护作用防效为70.31%[24]。而其在蔬菜立枯病方面的拮抗能力未见报道。
因此,筛选鉴定立枯丝核菌的拮抗菌,用于对防控菜心立枯病,为菜心立枯病的生物防控提供新材料,对于缓解海南夏季种菜难的问题有重要意义。
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土壤材料:分离生防菌的土壤来自海南省海口市云龙镇海南琼山蔬菜科技小院(19°90′19.89″N,110°47′93.69″E )有典型立枯病症状的菜心根际土壤。盆栽实验所用自然土也采于此。
病原菌材料:立枯丝核菌由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所杨腊英老师提供。将立枯丝核菌接种于PDB培养基,在28℃,180 r·min−1条件下震荡培养7 d,制备成病原菌菌液,备用。
拮抗菌材料:9株拮抗菌由中国热带农业科学院热带生物技术研究所热带功能微生物创新与利用研究组提供,其余生防菌株分别从感染和未感染立枯病的菜心植株根际土壤中分离获得。将拮抗菌接种于LB液体培养基,在37℃、180 r·min−1条件下震荡培养24 h,制备成拮抗菌液,备用。
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采用平板稀释梯度培养法[25]对根部土壤细菌进行分离纯化。选取具有典型立枯病症状菜心植株以及健康菜心植株根际土壤:小心拔取植株后用无菌刷轻轻刮取根系表面紧贴的土壤,分别装进无菌自封袋中,4℃保存备用。称取10 g土壤样品,加入90 mL无菌水,振荡30 min制成10−1浓度土壤悬液,依次梯度稀释至10−5、10−6。分别取100μL各稀释度悬液涂布于马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA),和LB固体培养基,每个稀释度3次重复,30℃条件下倒置培养24 h。对生长出的真菌和细菌采用平板划线法分别在PDA和LB固体培养基上反复纯化,直至获得单一形态菌落。
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采用平板对峙法[26]对拮抗菌进行筛选。在PDA培养基平板中央接种直径5 mm病原菌菌饼,将待筛选菌株菌液滴加在灭菌滤纸上,接种于距离菌饼2.5 cm两侧,以未接拮抗菌菌液的病原菌作为对照,重复3次实验,30℃条件下培养5~7 d,待对照病原菌长至接近培养皿边缘时,用游标卡尺测量抑菌圈直径计算抑菌率。
$$\begin{split} &抑制率(\% )=({\mathrm{CK}}净生长直径-\\&实验净生长直径)/{\mathrm{CK}}净生长直径\text{,} \end{split} $$ (1) -
形态学鉴定:在LB固体培养基平板上划线接种拮抗菌株,30℃光照条件下培养24 h,观察菌落平板颜色、透明度、形状、边缘、质地等形态特征。
生理生化鉴定:采用广东环凯生物科技有限公司生产的生化试验配套试剂进行菌株LCQ2025YL10的生理生化特性检测,并参照《常见细菌系统鉴定手册》[27]对菌株LCQ2025YL10进行革兰氏染色、溶菌酶试验、甘露醇利用试验、葡萄糖利用试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、V-P试验、柠檬酸盐利用实验、φ/3%过氧化氢试验等生理生化测定。
分子生物学鉴定:利用27 F和
1492 R通用引物对拮抗菌株采用50 μL的扩增体系进行PCR扩增,反应条件为:预变性94℃,5 min;变性94℃,30 s;退火58℃,30 s;延伸72℃,30 s;循环31次;终延伸72℃,7 min; 最后4℃保存。PCR产物经电泳检测后测序,测序序列在NCBI数据库,BLAST软件进行比对分析后,利用MEGA 12.0软件中的NeighborJoining法构建系统发育树,鉴定拮抗菌种类。 -
将平板对峙中抑制率最高的LCQ2025YL10与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)一起进行盆栽防治试验。每种参试拮抗菌为1个处理,每个处理三次重复。具体为:每盆保留10株生长健康且大小一致的菜心植株,待菜心植株在盆栽中长出两片真叶时,以灌根法接种第一次拮抗菌菌液100 mL,3 d后以相同方法接种病原菌菌液100 mL,再3 d后第二次接种拮抗菌菌液100 mL。对照组为只接种病原菌菌液。第二次接种拮抗菌菌液的第10 d观察菜心立枯病发病情况。对菜心立枯病进行病情等级分级,分别计算发病率、病情指数和相对防效。
菜心立枯病分级标准如下:
0级:健康植株;
1级:植株茎基部出现病斑,占茎粗1/2以下;
2级:植物茎基部病斑扩展,占茎粗2/3以内;
3级:植物茎基部病斑环绕,茎基部萎蔫;
4级:植物茎基部已经干枯、断裂、坏死甚至植株死亡。
$$ \mathrm{发病率=(染病株数/调查总株数)\times 100\% \text{,}} $$ (2) $$\begin{split} &病情指数=\sum (各级病株数\times 该病级值)/\\&(调查总株数\times 最高级值)\times 100\text{,} \end{split} $$ (3) $$ \begin{split} &相对防效=(对照病情指数-处理病情指数)/\\&对照病情指数\times 100\% \text{,} \end{split} $$ (4) -
大田防效试验于2025年5~7月海口市云裕村发生立枯病的菜心种植区进行,田间每相邻小区间均做挖沟处理,田间试验处理方式与盆栽试验相同,3个重复,第二次接种拮抗菌菌液10 d后,采回试验小区内全部植株,进行发病情况统计,病情等级分级和测定方法与盆栽试验相同。
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采用Excel 2019、SPSS 26.0软件对数据进行统计分析,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)(P < 0.05)以及Origin2021制作图表。
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从菜心植株根际土壤共分离出27株细菌,未分离到立枯丝核菌的拮抗真菌。采用平板对峙法进一步筛选后,确定有7株菌对立枯丝核菌有抑制作用,分别命名为LCQ2025YL5、LCQ2025YL6、LCQ2025YL10、LCQ2025YL14、LCQ2025YL19、LCQ2025YL24(表1)。其中LCQ2025YL10菌株抑菌效果最好,抑菌率为77.7%(图1)。拮抗效果LCQ2025YL10>Bacillus subtilis>Y2。
表 1 不同拮抗菌株对立枯丝核菌的抑制率
Table 1. Inhibition rates of different antagonistic strains against Rhizoctonia solani
菌株Bacterial strain 抑制率Inhibition rate(%) Y2 67.96±0.99c Bacillus subtilis 70.44±0.93c LCQ2025YL5 74.96±1.68ab LCQ2025YL6 74.19±0.32b LCQ2025YL10 77.70±0.13a LCQ2025YL14 75.78±0.79ab LCQ2025YL19 74.04±0.85b LCQ2025YL24 73.44±0.06b 注:表中不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P< 0.05) Note: Different lowercase letters in the table indicate significant differences among different treatments(P< 0.05). -
拮抗菌株LCQ2025YL10在LB固体培养基培养24 h后菌落形态呈灰白色,半透明菌落,有黏性,形状近圆形,菌落表面湿润,中心隆起,边缘清晰,呈凝胶状质地(图2左);菌株革兰氏染色为紫色,形状杆状(图2右),为革兰氏阳性菌;生理生化鉴定结果如表2所示,结果表明LCQ2025YL10菌株在溶菌酶试验、V-P试验呈阳性。能够利用甘露醇,葡萄糖和柠檬酸盐,可以水解淀粉,还原硝酸盐,液化明胶,分解过氧化氢。分子鉴定结果显示,菌株LCQ2025YL10处于芽孢杆菌(Bacillus)大分支中,与贝莱斯芽孢菌株(B. velezensis)相似性为99.86%(图3)。通过形态、生理生化与分子学鉴定综合分析,将菌株LCQ2025YL10鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)。
图 2 左边图为菌株LCQ2025YL10菌落形态; 右边图为菌株LCQ2025YL10革兰氏染色结果
Figure 2. The left figure shows the colony morphology of strain LCQ2025YL10; the right figure shows the Gram staining results of strain LCQ2025YL10
表 2 LCQ2025YL10菌株生理生化鉴定结果
Table 2. Physiological and biochemical identification results of LCQ2025YL10 strain
指标 Index 结果 Result 形状 Shape 杆状 革兰氏染色 Gram staining + 溶菌酶 Lysozyme + 甘露醇 Mannitol + 葡萄糖 Glucose + 淀粉水解 Amylolysis + 硝酸盐还原 Nitrate reduction + V-P试验 V-P test - 运动性 Motility + 柠檬酸盐 Citrate utilization + 明胶液化 Gelatin liquefaction + 3%过氧化氢 3% Catalase + 注:“+”表示阳性,“-”表示阴性。 Note: “+” indicates positive reaction; “-” indicates negative reaction. -
盆栽试验结果表明,只接种病原菌的对照植株受立枯丝核菌侵染严重,根部出现明显病斑,部分植株坏死。接种枯草芽孢杆菌(B. subtilis)(阳性对照)和接种LCQ2025YL10拮抗菌液的处理组中,菜心植株生长良好(图4)。立枯病发病率分别为11.11%、7.41%,病情指数分别为3.7、2.78,均明显低于CK,其中LCQ2025YL10拮抗菌液处理后相对防效高达97.12%,明显优于枯草芽孢杆菌拮抗菌液处理后的相对防效(表3)。
表 3 不同拮抗菌株对立枯丝核菌引起的菜心立枯病盆栽防治效果
Table 3. Pot control effect of different antagonistic strains on Brassica campestris caused by Rhizoctonia solani
发病率/%
Incidence rate病情指数
Disease index相对防效/%
Relative
control effectCK 86.31±8.27a 54.17±21.29a − Bacillus subtilis 11.11±11.11b 3.70±3.70b 87.04±12.96a LCQ2025YL10 7.41±7.41b 2.78±2.78b 97.12±2.88a 注:表中不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05) Note: Different lowercase letters in the table indicate significant differences among different treatments(P< 0.05). -
大田试验结果表明,在田间无干预自然生长的菜心植株病情等级表现分明(图5),经枯草芽孢杆菌(B. subtilis)和LCQ2025YL10拮抗菌液处理的菜心植株,生长趋势明显好于CK(图6),经两株拮抗菌液处理的立枯病发病率分别为:43.09%、26.34%,病情指数分别为:20、10.99,均低于CK,均能延缓病害流行。其中LCQ2025YL10的相对防效达到69.96%,立枯病发病率和病情指数结果都要优于经枯草芽孢杆菌处理的植株(表4)。
图 5 菜心植株立枯病病情等级分级标准
Figure 5. Grading standard for disease severity of Rhizoctonia solani infecting Brassica campestris
表 4 不同拮抗菌株对立枯丝核菌引起的菜心立枯病大田防治效果
Table 4. Field control effect of different antagonistic strains against Rhizoctonia solani induced damping off disease of Brassica campestris
发病率(%)
Incidence rate病情指数
Disease index相对防效(%)
Relative control
effectCK 70.14±8.74a 36.37±5.89a − Bacillus subtilis 43.09±6.92b 20±4.04b 45.38±2.27b LCQ2025YL10 26.34±6.99b 10.99±2.12b 69.96±0.95a 注:表中不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05) Note: Different lowercase letters in the table indicate significant differences among different treatments(P<0.05). -
蔬菜苗期立枯病作为一种土传病害,在中国南北方各均有广泛发生,其病原菌立枯丝核菌(R. solani),可在土壤中存活多年,并且具有广谱侵染特性,能对番茄、黄瓜、茄子、菜心等数十种蔬菜幼苗造成危害[28-29]。该病在苗期发病初期,幼苗茎基部会出现椭圆形暗褐色病斑,随着病情发展,病斑逐渐扩大并凹陷缢缩,导致幼苗茎部支撑力下降,最终出现萎蔫倒伏,严重时部分地块可出现“成片绝苗”现象,对蔬菜生产的苗期保苗率和后期产量形成严重威胁[7]。
在众多生防微生物中,芽孢杆菌属细菌具有生长速度快、定殖能力强、抑菌谱覆盖广泛、具有产业化优势等特点,是当前生物防治领域的优良菌种资源[30-32]。本研究针对蔬菜立枯病的防治需求,从菜心田土壤中分离筛选得到一株立枯病拮抗菌株LCQ2025YL10,该菌株对立枯丝核菌表现出明显拮抗作用,抑菌率达77.7%,结合其形态学观察和16S rDNA 基因序列分析,最终鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)。盆栽试验中菌株LCQ2025YL10对立枯病的相对防效高达97.12%。大田试验中菌株LCQ2025YL10对立枯病的相对防效达到69.96%,显著高于枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。贝莱斯芽孢杆菌是一种新兴的植物益生菌,其在农业病害防控、作物促生与土壤改良方面已展现出显著成效[33]。苗雨[34]的田间试验也发现,基于贝莱斯芽孢杆菌SQR9开发的复合菌生物有机肥,可以有效降低设施茄子枯萎病的发病率,提高茄子、青莱、番茄、玉米、白菜和土豆的产量,改善果实品质。 Ahmed[35]等研究证实,贝莱斯芽孢杆菌PEA1-CF能有效抑制黄瓜花叶病毒,其灭活、治疗及保护活性均表现出显著效果。钱运龙[36]等研究表明,贝莱斯芽孢杆菌LTB49的10倍稀释发酵滤液可有效抑制黄瓜枯萎病:对病菌菌丝生长的抑制率为42.16%;对孢子萌发的抑制率高达90.82%。李坤[37]等研究发现贝莱斯芽孢杆菌TC-52菌悬液浸种处理可显著促进水稻根系发育,具体表现为胚根生长量、主根长度和侧根数分别提升19%、25%和29%;同时,该处理对水稻立枯病的防治效果超过75%。穆文强[38]等研究发现,在育苗基质中添加贝莱斯芽孢杆菌与γ-聚谷氨酸的两步混合法,可优化菌剂分布、提升基质持水性与孔隙度,结合有机肥与功能性基质,能进一步提升该菌株的农业应用效率。
虽然枯草芽孢杆菌(B. subtilis)对多种植物病原菌具有抑制作用,包括黄瓜枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum)[39]、苹果树腐烂病病原菌(Valsa spp.)[40]以及辣椒疫病病原菌(Phytophthora capsici)[41]等。但在本研究中贝莱斯芽孢杆菌LCQ2025YL10与枯草芽孢杆菌与对立枯病拮抗效果存在显著差异,大田效果更好。原因可能是由于实际应用环境中影响因素复杂多变,比如受温度、湿度、土壤微生物竞争等因素影响,导致盆栽或田间环境中效果波动较大[42]。而LCQ2025YL10菌株在盆栽和田间环境中均表现优异,表明了其实际应用潜力。
综上所述,贝莱斯芽孢杆菌可为植物病害的绿色防控提供优质微生物资源,而本研究筛选的LCQ2025YL10菌株,在菜心立枯病防治中表现出高效性和稳定性,为该菌株后续开发为生防制剂、替代化学农药提供依据。
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从海南菜心根际土壤中分离出对立枯病有明显抑制作用的拮抗菌LCQ2025YL10,抑菌率为77.7%,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B. velezensis)。盆栽试验结果表明,LCQ2025YL10菌液处理的菜心对立枯病的相对防效高达97.12%。大田试验结果表明,LCQ2025YL10菌液处理的小区对立枯病的相对防效达到69.96%,显著高于枯草芽孢杆菌(B. subtilis)(47.38%)。
一株贝莱斯芽孢杆菌的鉴定及其对菜心立枯病的防效
DOI: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250120
CSTR: 32425.14.j.cnki.rdswxb.20250120
Identification of a strain of Bacillus velezensis and its control effect on Rhizoctonia wilt in Brassica campestris
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摘要: 在海南高温高湿的环境下,由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)侵染引发的立枯病,已成为严重危害菜心生长的主要病害之一。本研究运用平板对峙法,从菜心根际土壤中分离筛选出对立枯病菌抑制率77.7%的拮抗菌LCQ2025YL10。该菌株菌落形态圆形灰白色、半透明有黏性、表面湿润、中心隆起、呈凝胶状质地;生理生化鉴定为革兰氏阳性杆状菌,能够利用甘露醇,葡萄糖和柠檬酸盐,可以水解淀粉,还原硝酸盐,液化明胶,分解过氧化氢;16S rDNA测序分析该菌株与贝莱斯芽孢菌株(Bacillus velezensis)相似性为99.86%;综合上述结果,将该菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。盆栽防治试验结果显示:经LCQ2025YL10菌液处理,菜心立枯病发病率为7.41%,病情指数为2.78,相对防效达97.12%。大田试验结果表明,LCQ2025YL10菌液处理后菜心立枯病发病率为26.34%,病情指数为10.99,相对防效达到69.96%,显著高于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的47.38%,表明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)对菜心立枯病有显著防治作用。Abstract: Under the high-temperature and high-humidity conditions in Hainan Province, Rhizoctonia wilt, caused by Rhizoctonia solani, has become one of the major diseases that seriously threaten the growth of Brassica campestris. A bio-control bacterium strain LCQ2025YL10 was isolated from the rhizosphere soil of B. campestris. The plate dual culture experiment was used to test the inhibitory effects of LCQ2025YL10 against R. solani, the causal agent of Rhizoctonia wilt. The results indicated that the strain LCQ2025YL10 exhibits a 77.7% inhibition rate against R. solani. The morphological observation indicated that the colony morphology of the strain LCQ2025YL10 was circular in shape with grayish-white color, translucent and viscous texture, wet surface, central elevation, and gelatinous consistency. Physiological and biochemical identification revealed that this strain is a Gram-positive bacillus with the ability to utilize mannitol, glucose, and citrate. It can also hydrolyze starch, reduce nitrate, liquefy gelatin, and decompose hydrogen peroxide. Furthermore, the analysis of 16S rDNA sequencing indicated that the strain shared a 99.86% similarity with Bacillus velezensis. Based on these results, the strain LCQ2025YL10 was identified as Bacillus velezensis. Pot experiment results indicated that after treatment with the B. velezensis LCQ2025YL10 bacterial suspension, the disease incidence of Rhizoctonia wilt in B. campestris was 7.41%, with the disease index of 2.78 and the relative control efficacy of up to 97.12%. In field trials, after treatment with the strain LCQ2025YL10 bacterial suspension, the disease incidence of Rhizoctonia wilt in B. campestris was 26.34%, with the disease index being 10.99, and the relative control efficacy of this strain against the disease being 69.96%, which was significantly higher than that of Bacillus subtilis (47.38%). These findings collectively indicate that Bacillus velezensis LCQ2025YL10 exerts a significant control effect on Rhizoctonia wilt of B. campestris.
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表 1 不同拮抗菌株对立枯丝核菌的抑制率
Table 1 Inhibition rates of different antagonistic strains against Rhizoctonia solani
菌株Bacterial strain 抑制率Inhibition rate(%) Y2 67.96±0.99c Bacillus subtilis 70.44±0.93c LCQ2025YL5 74.96±1.68ab LCQ2025YL6 74.19±0.32b LCQ2025YL10 77.70±0.13a LCQ2025YL14 75.78±0.79ab LCQ2025YL19 74.04±0.85b LCQ2025YL24 73.44±0.06b 注:表中不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P< 0.05) Note: Different lowercase letters in the table indicate significant differences among different treatments(P< 0.05). 表 2 LCQ2025YL10菌株生理生化鉴定结果
Table 2 Physiological and biochemical identification results of LCQ2025YL10 strain
指标 Index 结果 Result 形状 Shape 杆状 革兰氏染色 Gram staining + 溶菌酶 Lysozyme + 甘露醇 Mannitol + 葡萄糖 Glucose + 淀粉水解 Amylolysis + 硝酸盐还原 Nitrate reduction + V-P试验 V-P test - 运动性 Motility + 柠檬酸盐 Citrate utilization + 明胶液化 Gelatin liquefaction + 3%过氧化氢 3% Catalase + 注:“+”表示阳性,“-”表示阴性。 Note: “+” indicates positive reaction; “-” indicates negative reaction. 表 3 不同拮抗菌株对立枯丝核菌引起的菜心立枯病盆栽防治效果
Table 3 Pot control effect of different antagonistic strains on Brassica campestris caused by Rhizoctonia solani
发病率/%
Incidence rate病情指数
Disease index相对防效/%
Relative
control effectCK 86.31±8.27a 54.17±21.29a − Bacillus subtilis 11.11±11.11b 3.70±3.70b 87.04±12.96a LCQ2025YL10 7.41±7.41b 2.78±2.78b 97.12±2.88a 注:表中不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05) Note: Different lowercase letters in the table indicate significant differences among different treatments(P< 0.05). 表 4 不同拮抗菌株对立枯丝核菌引起的菜心立枯病大田防治效果
Table 4 Field control effect of different antagonistic strains against Rhizoctonia solani induced damping off disease of Brassica campestris
发病率(%)
Incidence rate病情指数
Disease index相对防效(%)
Relative control
effectCK 70.14±8.74a 36.37±5.89a − Bacillus subtilis 43.09±6.92b 20±4.04b 45.38±2.27b LCQ2025YL10 26.34±6.99b 10.99±2.12b 69.96±0.95a 注:表中不同的小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05) Note: Different lowercase letters in the table indicate significant differences among different treatments(P<0.05). -
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