废水：本实验所用废水于2016—2018年期间取样自海南省儋州市海南天然橡胶产业集团股份有限公司金联橡胶加工厂和金福橡胶加工厂。废水原液(以下简称金联原液/金福原液)，即未经任何处理的废水，含有大量的氮、磷和有机物。厌氧发酵后的废水（以下简称金联厌氧），是经过厌氧、兼性(厌氧和好氧)两级氧化塘处理的废水，含有大量的氮、磷。处理后废水（金联处理），是经过化学脱磷，脱氮处理的水，即经厌氧、兼性(厌氧和好氧)两级氧化塘处理后化学脱磷，脱氮处理的水，仍含有超标的氮、磷。藻种：念珠藻（Nostoc sp.）、鱼腥藻（Anabaena sp.）、鞘丝藻(Lyngbya sp.)、小球藻（Chlorella sp.）均为本实验室藻种库分离纯化鉴定的淡水微藻。采用固体Tris-Acetate-Phosphate（TAP）培养基划线保存，培养温度为25 ℃，光照强度110 μmol·m⁻²·s⁻¹，光暗比16 h︰8 h。液体培养时，培养温度为25 ℃，光照强度110 μmol·m⁻²·s⁻¹，光暗比16 h ︰8 h，摇床转速为180 r·min⁻¹。仪器：景宏六合一水质测定仪（JH-TD602），柯迪达笔式pH计（CT-6021A），柯迪达电导率仪（CT-3031）。

TAP液体培养念珠藻、鱼腥藻、鞘丝藻和小球藻至对数期，4 000 r·min⁻¹离心5 min收集藻细胞，加入2 mL TAP 培养基重悬藻细胞作为种子液，按10%的接种量接种于金联原液的稀释液废水中（稀释倍数为5，10，15，20，30倍），连续培养4 d，观察其生长状况。

用100 mL TAP液体培养基将小球藻培养至对数生长期，4 000 r·min⁻¹ 离心5 min收集藻细胞，加入2 mL TAP培养基重悬藻细胞作为种子液，分别接种于50 mL稀释10倍的金联和金福橡胶加工废水原液的稀释液中，连续振荡培养6 d。于2，4，6 d 取样测定叶绿素a、叶绿素b和生物量，测定起始和终止时的TN，TP和COD含量。

将小球藻种子液接种于稀释10倍的金联橡胶加工废水中，连续培养2 d，再添加新的营养液培养2 d，每天测定藻细胞密度、pH值、电导率，并绘制变化曲线。

取样样品经0.22 μm的微孔滤膜抽滤。叶绿素的测定采用丙酮提取法^[6]：取5 mL 小球藻培养液，4 ℃，5 000 r·min⁻¹ 离心5 min,蒸馏水洗涤2次，加入8 mL 80%丙酮混匀，4 ℃萃取24 h至藻细胞沉淀为白色，4 ℃离心，80%丙酮定容至25 mL 分别测定663，665 nm处的吸光值。生物量的测定，取正常培养的小球藻，梯度稀释后测定OD₆₈₀，烘干后测定干质量，绘制OD₆₈₀与细胞干质量的标准曲线。细胞密度的测定，藻细胞数与680 nm处的光密度呈正相关，测定分光光度计于680 nm 波长处的吸光度（OD₆₈₀）。总氮采用碱性过硫酸钾消解分光光度法（GB11894—89）。总磷采用钼锑抗分光光度法（GB11893—89）。COD采用重铬酸钾法（GB11914—89）。电导率的测定采用测定培养液的电导率(EC)法，取5 mL 的藻液经0.22 μm 的微孔滤膜抽滤，所得滤液在室温下用电导仪测定其电导率。pH的测定, 取5 mL 的藻液经0.22 μm 的微孔滤膜抽滤，所得滤液在室温下用笔式pH仪测定。

所有实验的测定均重复3次，实验结果采用SPSS 22.0 进行差异显著性分析（LSD 法），养藻前后总氮、总磷、COD采用t检验（Student’s T-Test），在图中a代表显著水平（P<0.05），b代表极显著水平（P<0.01），绘图采用Origin 2019。

将制备好的念珠藻、鱼腥藻、鞘丝藻、小球藻种子液接种于稀释不同倍数的金联橡胶加工厂的废水中连续培养。结果表明(图1)：培养第4天，念珠藻除了在稀释5倍的污水中生长情况较差，其余各倍数生长情况均较好；鱼腥藻仅在稀释30倍的污水中生长较好；鞘丝藻和小球藻除了在稀释5倍、10倍的污水中生长情况较差，其余各倍数生长情况较好。表明在一定稀释倍数范围内，各藻种生长状况与稀释倍数呈现正相关。小球藻在污水中的适应性明显高于念珠藻，鱼腥藻和鞘丝藻。

图  1  微藻天然橡胶加工废水中的生长状况

Figure 1.  Growth of microalgae in the effluent of the natural rubber processing factories

小球藻细胞内含有丰富的叶绿素，光合作用非常强，因而叶绿素含量的多少通常是直接体现光合能力大小的一个重要生理指标。笔者测定了小球藻在稀释10倍的橡胶加工废水中的叶绿素含量和生物量(图2)。结果显示，随着培养时间的增加，叶绿素a+b 含量均出现不同程度的下降，且达到显著水平（P<0.05），其中，金联处理组下降最明显，第6天与第2天相比，下降了58.7%。生物量测定结果表明，除金联处理组生物量先升高，后降低外，其余各组生物量明显增加，金联原液组、金联厌氧组和金福处理组，第6天与第2天相比分别增加了2.51倍，1.41倍和0.34倍，金联原液组增加最显著。

图  2  小球藻在橡胶加工废水中连续培养下叶绿素和生物量的测定

Figure 2.  Determination of chlorophyll and biomass of Chlorella sp. cultured continuously in the effluent of the NR processing factories

从表1可以看出，金联橡胶原液总氮含量为1 742.27 mg·L⁻¹，金福橡胶原液总氮含量为1 303.34 mg·L⁻¹，说明橡胶加工废水原液含有超标的氮含量，金联厌氧废水总氮含量为35.9 mg·L⁻¹，厌氧后化学脱氮后废水总氮含量为12.30 mg·L⁻¹。养藻前后对比显示，天然橡胶加工废水养殖小球藻后总氮含量均出现显著的降低，对氮的去除效率金联原液组效果最佳为89.21%，依次是金联原液组>金福原液>金联厌氧>金联处理，这说明利用小球藻净化天然橡胶加工废水对原液稀释后的去除效果最佳。

对养殖小球藻前后的橡胶加工废水总磷含量测定显示(表2)，金联原液总磷含量为23.75 mg·L⁻¹，金福原液总磷含量为23.79 mg·L⁻¹，说明橡胶加工废水原液含有较高的磷，养殖小球藻后，金联原液总磷含量为7.13 mg·L⁻¹，总磷去除效率为70%，其次为金福原液，去除效率为69.60%。

化学需氧量是指检测水样在强酸性条件下，由氧化剂氧化1 L水中有机物所需要的氧气量，可以反映出水体中有机物的含量以及水体的有机物污染程度。从表3可以看出，金联原液和金福原液养藻前COD分别为238.40 ，178.40 mg·L⁻¹，超出了天然橡胶加工污水排放标椎，经过养殖微藻后COD分别为120.80 ，112.80 mg·L⁻¹，达到天然橡胶一二级排放标椎。养藻后与养藻前COD变化均达到显著水平（P<0.05），去除效率依次是金联原液组>金福原液组>金联处理组>金联厌氧组。

微藻对污水中氮磷的去除受到营养液成分、有机负荷、pH等因子的影响。从图3可以看出，采用天然橡胶加工废水培养小球藻，第2天细胞密度达到2.81×10⁷个∙mL⁻¹，添加营养液后细胞密度持续增加，第3天达到最大值6.32×10⁷个∙mL⁻¹，然后降低。添加营养液后藻细胞的终浓度高于对照，这说明添加营养液可以有效延长培养时间，提高微藻的产量。连续培养过程中培养液pH值逐渐增加，培养至平台期后pH趋于稳定，第2天添加营养液后溶液被稀释，pH降低，随后pH逐渐增加，略低于对照。在连续培养过程中，电导率从起始的2.27 ms∙cm⁻¹，逐渐降低，最终稳定在2.0 ms∙cm⁻¹左右，第2天添加营养液后，溶液被稀释，导电率急剧增加，最后降低，稳定于4.5 ms∙cm⁻¹左右，说明添加营养液后，溶液pH和电导率的改变可能是导致微藻细胞密度增加的主要因素。

图  3  稳定期添加营养液对细胞密度、pH和电导率的影响

Figure 3.  Effects of nutrient solution on cell density, pH value and conductivity after adding nutrient solution into medium at stationary phase

微藻生长繁殖快，光合效率高，可以有效去除污水中的氮、磷、金属离子及有毒物质等污染物。微藻种类繁多，不同藻种的污水处理能力差别很大，李川等^[6]在研究蛋白核小球藻、鱼腥藻、双对栅藻和突变衣藻4种藻在固定和悬浮状态下对污水中氮的净化能力时发现，小球藻和鱼腥藻对污水中氮的去除效果较好。据研究报道，对污水中氮和磷吸收效果最好的微藻有螺旋藻、小球藻、栅藻、颤藻，栅列藻，其中小球藻是去除效率最高的藻类之一^[7]。本研究涉及的4种藻，在稀释相同倍数的天然橡胶加工废水中，小球藻（Chlorella sp.）长势明显的优于念珠藻（Nostoc sp.）、鱼腥藻（Anabaena sp.）和鞘丝藻(Lyngbya sp.)。这也验证了小球藻较强的适应污水能力。微藻生长受到生长因素的影响，如光照、温度、氮、磷浓度及平衡。有机负荷大小，pH值等其中有些会成为微藻的限制因子^[8]，在小球藻处理污水过程中，叶绿素含量随着培养时间的增加而降低，说明小球藻生长受到一定的抑制，这也说明废水中存在限制小球藻生长的抑制因子。污水氮和磷含量测定显示，污水中氮、磷含量严重超标。对氮、磷的去除率随着氮、磷浓度的升高而増加。对金联橡胶加工原液废水氮、磷和COD的去除率分别为89.71%，70.00%和49.33%，这说明小球藻对天然橡胶加工废水中的氮、磷、COD去除效果较好，这与之前报道的小球藻处理市政污水的氮磷效果结果一致^[9]。

小球藻对废水氮、磷、COD的去除效果，因小球藻属存在差异，而且受到起始接种浓度，培养环境以及水体中营养成分比例的影响^[10]。适宜藻类生长的氮磷比为（7∶17）～（15∶1），当氮磷比<5∶1时就会引起氮限制，而当氮磷比>40∶1则会引起磷限制^[11]。小球藻对不同形态氮的吸收顺序为：氨氮>简单有机氮>硝酸盐氮>亚硝酸盐氮，对不同形态磷的吸收顺序为：正磷酸盐>偏磷酸盐>焦磷酸盐>有机磷酸盐^[12]。小球藻对氮磷的去除效果还受到溶液pH的影响，据报道小球藻对氮磷去除效果最佳的pH范围为7～8^[13]。本研究不同处理阶段的天然橡胶加工废水的氮磷比例、pH等具有较大差异，导致了小球藻对氮、磷、COD去除效率的差异。在培养小球藻至对数期后添加新的营养液，微藻细胞浓度增加，这可能是新添加的营养液补充了氮源和碳源，也可能是有效降低溶液的pH和增加电导率等因素导致的结果。结果表明，天然橡胶加工废水培养小球藻至对数期后，适量添加营养液可以有效延长培养时间。