Preliminary study on the effect of Persicaria chinensis produced in Hainan against pullorum disease

海南产火炭母粉末（保存于本实验室）；无水乙醇（西陇科学股份有限公司）；硫酸庆大霉素（合肥博美生物技术有限公司）；LB肉汤培养基（杭州微生物试剂有限公司）；MH肉汤培养基（北京路桥技术股份有限公司）；琼脂粉（赛国生物科技有限公司）；无菌生理盐水（广西裕源药业有限公司）；鸡白痢沙门氏菌标准株（ATCC10398，保存于本实验室）。

将海南产火炭母粉末送至江苏三黍生物科技有限公司进行中药非靶代谢组学检测获得海南产火炭母化学成分，随后利用TCMSP数据库（https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和SwissADME数据库（http://www.swissadme.ch/）筛选活性成分，通过SwissTargetPrediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/）和PharmMapper数据库（https://lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）预测活性成分作用靶点。在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://www.omim.org/）中以“Pullorum disease”和“Salmonella pullorum”为关键词收集鸡白痢相关靶点。通过Venny 2.1在线网站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）获得二者的交集靶点。

将交集靶点导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/）获得蛋白质相互作用（PPI）网络图并利用Cytoscape 3.10.0软件的CytoNAC插件对PPI网络图的度中心性（Degree Centrality, DC）、紧密中心性（Closeness Centrality, CC）、介数中心性（Between Centrality, BC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality, EC）、局部平均连接（Local Average Connectivity, LAC）和网络中心（Network Center, NC）六个参数进行分析。

将交集靶点导入DAVID数据库（https://davidbioinformatics.nih.gov/tools.jsp），选择物种“Gallus”后进行GO功能和KEGG通路富集分析。

将海南产火炭母及其活性成分、交集靶点、KEGG通路和鸡白痢导入Cytoscape 3.10.0软件，获得“药物-活性成分-交集靶点-通路-疾病”网络图，取Degree值前10名的交集靶点与主要靶点的交集为核心靶点。在“药物-活性成分-交集靶点-通路-疾病”网络图的基础上绘制“主要靶点-成分”网络图，对两张图中Degree值前10名活性成分取交集，其中将成分代谢物峰值排前5名的成分视为核心活性成分。

利用Chem3D软件优化核心活性成分结构。通过SWISS-MODEL在线网站（https://swissmodel.expasy.org/interactive）构建核心靶点蛋白模型。对核心活性成分结构和核心靶点蛋白模型进行预处理后利用Auto Dock Vina软件进行分子对接，记录对接结果并进行可视化。

根据网络药理学筛选结果选择φ＝70%乙醇溶液为提取溶剂以富集总黄酮^[7],采用热水浸提法进行提取并利用SPSSAU在线网站（https://spssau.com/index.html）设计四因素三水平L₉（3⁴）正交试验以最大化保留总黄酮及其他预测抗菌成分，条件设置见表1。将提取液用纱布过滤、合并后旋蒸除醇并浓缩至1 g·mL⁻¹质量浓度（生药）。

将对数生长期的鸡白痢沙门氏菌稀释至1.5×10⁶ cfu·mL⁻¹,无菌棉签蘸取后涂布于LB琼脂培养基，涂布3次，每次旋转60°，菌液稍干后放置牛津杯，在牛津杯中加入100 µL 0.5 g·mL⁻¹海南产火炭母粗提物，37 ℃、5%CO₂培养20 h,以硫酸庆大霉素（50 µg·mL⁻¹）为阳性对照，无菌生理盐水为阴性对照。使用游标卡尺通过十字交叉法进行测量，结果取均值，重复实验3次。

按照最佳提取条件重新提取3份海南产火炭母粗提物，通过牛津杯抑菌试验检测其抗菌活性，并计算3份海南产火炭母粗提物抑菌结果的平均值和相对标准偏差（Relative standard deviation, RSD），对最佳提取条件进行验证，重复试验3次，结果取均值。

通过微量肉汤稀释法倍比稀释海南产火炭母粗提物，加入菌液37 ℃、5%CO₂培养24 h后，肉眼观察无菌生长的最低浓度为MIC。吸取药液-菌液混合液于MH琼脂培养基上均匀涂布，37 ℃、5%CO₂培养24 h后，无菌落浓度为MBC浓度。MH肉汤培养基为空白对照组，MH肉汤培养基+菌液为细菌对照组。

采用Microsoft Excel软件对实验数据进行整理，实验数据以“平均值”表示，并精确到小数点后两位，采用方差分析对正交试验结果进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

中药非靶代谢组学检测发现，海南产火炭母含有331种成分，经过TCMSP数据库和SwissADME数据库筛选获得122个活性成分，通过对SwissTargetPrediction数据库和PharmMapper数据库预测的靶点进行筛选、合并、去重后共获得1024个活性成分靶点。GeneCards数据库和OMIM数据库获得的靶点进行筛选、合并、去重后共获得507个疾病靶点。二者取交集，获得交集靶点有61个，即海南产火炭母抗鸡白痢的可能靶点（图1）。

Figure 1.  Venn diagram of the intersection target

在STRING数据库中导入交集靶点进行蛋白质互作分析，通过Cytoscape 3.10.0软件进行可视化，如图2所示，图中节点颜色越深，半径越大，说明其Degree值越大，相互作用的蛋白质越多。利用CytoNAC插件对PPI网络图的DC、CC、BC、EC、LAC和NC六个参数进行分析，筛选出各参数均大于中位值的靶点视为主要靶点（图3）。

Figure 2.  PPI network diagram

Figure 3.  Main target network diagram

将交集靶点导入DAVID数据库，选择物种“Gallus”后进行GO和KEGG富集分析，获得生物过程（Biological Process, BP）45个、细胞组分（Cellular Component, CC）15个、分子功能（Molecular Function, MF）12个以及KEGG通路18条。由图4可知，靶点参与蛋白水解、蛋白质磷酸化、细胞内信号转导等多个生物过程，涉及细胞膜、细胞质、细胞溶质等多个细胞组分，涵盖ATP结合、金属离子结合、金属内肽酶活性等多个分子功能。由图5所示，KEGG通路包括C型凝集素受体信号通路、VEGF信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路等。

Figure 4.  GO enrichment diagram

Figure 5.  KEGG enrichment diagram

如图6所示，海南产火炭母通过多成分、多靶点、多通路对鸡白痢发挥作用。取Degree值前10名的交集靶点与主要靶点的交集为核心靶点，即MMP9、PPARG、AKT1、KDR、APP。

Figure 6.  Main target- ingredient network diagram

在“药物-活性成分-交集靶点-通路-疾病”网络图的基础上绘制“主要靶点-成分”网络图，结果如图7。对两张图中Degree值前10名活性成分取交集，再取中药非靶代谢组学中峰度值排前5的成分为核心活性成分，即槲皮素（Quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、毡毛美洲茶素（Velutin）、杨梅素（Myricetin）、香叶木素（Diosmetin）。

Figure 7.  Drug- ingredient -intersection target-pathway-disease network diagram

由图8可知，海南产火炭母5个核心活性成分与5个核心靶点的自由结合能均小于−5.0 kcal/mol，表明海南产火炭母活性成分与靶点蛋白具有良好的结合能力，其中香叶木素与MMP9结合力最强，其次是毡毛美洲茶素和杨梅素与AKT1，对接图如图9所示。

Figure 8.  Ingredient-target docking binding energy diagram

Figure 9.  Molecular docking diagram

根据正交试验结果（表2）的极差R可知，提取温度极差最大，为影响海南产火炭母粗提物抑菌效果的关键因子，其次是提取次数、提取时间和料液比。根据各水平的均值k可用初步判断A₃B₁C₂D₂为海南产火炭母粗提物的最佳提取条件，即料液比（m/v）为1∶60，70 ℃提取45 min，提取2次。

由表3可知，提取温度、料液比、提取时间、提取次数对试验均有极显著影响；由F值可知，影响抑菌圈直径的因素依次是提取温度、提取次数、提取时间和料液比，与正交试验结果一致

由表4可知，在最佳条件下进行3次重复，海南产火炭母粗提物抑菌效果效果较好，相对标准偏差较小，可以确定A₃B₁C₂D₂为最佳提取条件，且重复性较好。

由表5和图10可知，海南产火炭母粗提物的MIC和MBC相同，均为128 g·L⁻¹。

Figure 10.  MBC results of the crude extract of Persicaria chinensis produced in Hainan

本研究通过中药非靶代谢组学鉴定了海南产火炭母的331个成分并利用网络药理学技术筛选出槲皮素、山奈酚、毡毛美洲茶素、杨梅素和香叶木素5种可能抗鸡白痢的核心活性成分。这5种成分均属于黄酮类化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌抗病毒等多种作用，能够有效改善机体代谢、调节免疫力、保护神经、提高动物的生长性能等。槲皮素能通过抗炎和抗氧化作用缓解脂多糖导致的鸡肺炎症及鸡胚十二指肠和心脏损伤^[8−9]。山奈酚能直接抑制鸡肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门氏菌毒力基因的表达，减弱细菌的的黏附能力以及生物被膜形成能力，还能缓解炎症导致的肠道和肝脏损伤^[10−11]。与山奈酚类似，杨梅素通过下调与鸡白痢沙门菌生物被膜形成和黏附侵袭相关的基因表达发挥抗感染作用，在1/2MIC时即可发挥明显的体外杀菌效果^[12−13]。香叶木素对肾炎、肠炎等各类炎症均有明显的改善作用，能减缓肝、肺损伤，促进伤口愈合，还有一定的神经系统保护、调节作用^[14−19]。毡毛美洲茶素目前相关研究较少，但基于其结构特征及黄酮类物质的共性生物学特性，可合理推测其同样具有黄酮类化合物的抗炎、抗氧化、免疫调节等功能。综合以上信息，海南产火炭母可能主要通过发挥黄酮类成分的抗炎、抗氧化、抗菌等多种功能从而起到抗鸡白痢的作用。此外，根据“药物-成分-交集靶点-通路-疾病”网络图推测海南产火炭母可能还通过多种活性成分的协同作用实现抗鸡白痢的效果。

本研究共筛选出海南产火炭母抗鸡白痢的MMP9、PPARG、AKT1、KDR和APP共5个核心靶点。MMP9属于锌依赖性内肽酶家族，在组织重塑、炎症、肿瘤转移等过程中发挥重要作用。有研究表明，在巨噬细胞感染鼠伤寒沙门氏菌后释放的囊泡中MMP9的含量显著增加，从而提高巨噬细胞迁移能力，但过量的MMP9同时又增强炎症导致组织损伤^[20−21]。PPARG是核激素受体超家族中的一员，具有抗炎、抗肿瘤、调节新陈代谢和免疫反应等功能，研究发现，PPARG还与肠道健康相关，其介导的PPAR-γ信号通路能维持肠道内环境稳定^[22−23]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞增殖、存活、代谢和免疫反应，对炎症有双重调控作用，不仅能通过激活PI3K/AKT信号通路介导炎症反应，还可以阻断TLR4和NF-κB途径从而缓解炎症^[24−26]。KDR又称VEGFR-2，是血管生成和内皮细胞功能调控的关键分子，在病理条件下,KDR促进血管内皮细胞释放多种血管活性因子，调节炎症细胞激活和黏附以及血管张力^[27]。APP是β-淀粉样蛋白的前体蛋白，目前的研究显示，在肺部感染时降低肺微血管内皮细胞内APP表达会导致细胞增殖受损、屏障形成不良和降低抵抗力^[28]。综合以上信息，海南产火炭母可能通过调控MMP9、PPARG、AKT1等多个靶点协同调节机体免疫、平衡炎症、维持和修复组织屏障等多种生理过程，从而发挥其抗鸡白痢的药理作用。

GO功能富集分析显示，海南产火炭母通过蛋白水解、蛋白质磷酸化、细胞内信号转导等生物过程抗鸡白痢，这些过程可能涉及细胞膜、细胞质、细胞溶质等相关细胞组分参与，主要涉及ATP结合、金属离子结合、金属内肽酶活性等相关分子的功能表达。KEGG通路富集分析结果发现，海南产火炭母抗鸡白痢可能通过多靶点协同调控实现，其作用机制涉及C型凝集素受体信号通路、VEGF信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路等。C型凝集素样受体是一种重要的模式识别受体，参与对病原体的识别和诱导免疫反应，还能维持肠道内环境稳态^[29−30]。VEGF信号通路是调控血管生成和血管通透性的核心通路，还与炎症调控有关，研究表明在病理条件下抑制VEGF信号通路可减轻炎症^[31−32]。Toll样受体信号通路在免疫反应中起着关键作用，其受体能够识别病原体并介导信号至下游通路从而启动免疫反应，但免疫反应过度激活会导致炎症损伤^[33−34]。MAPK信号通路对于调控炎症反应、细胞凋亡和免疫防御至关重要，病原体入侵时MAPK信号通路立即被激活，启动免疫防御抑制感染，但病原体过度激活MAPK信号通路也会导致炎症从而促进病原侵袭^[35−37]。因此，适当调节Toll样受体信号通路和MAPK信号通路非常重要。综合以上信息，海南产火炭母可能通过参与多种生物学过程调控炎症反应、激活免疫防御等相关信号通路发挥抗鸡白痢作用。

本研究根据网络药理学的结果在通过醇提法富集总黄酮的基础上正交优化获得具有最大抑菌效果的海南产火炭母粗提物，其MIC和MBC检测结果显示，该粗提物在128 g·L⁻¹时能直接杀灭鸡白痢沙门氏菌，综合验证了“海南产火炭母以黄酮类成分为主、多成分协同效应为辅起抗鸡白痢作用”的预测。

本研究基于网络药理学的结果提出了海南产火炭母具有抗鸡白痢效果及其潜在作用机制的预测，随后对海南产火炭母粗提物的体外抑菌活性进行了初步验证，但研究未进行海南产火炭母粗提物的体内抑菌实验，由于药物在机体中会受到吸收、代谢、机体免疫情况等多种干扰，其在体内是否起效、作用机制是否与预测一致将是未来研究工作的核心内容。此外，作为深入探究海南产火炭母抗菌机制的重要延伸，对筛选出的单一活性成分进行体内外抗菌实验，不仅能进一步明确单一成分的抗菌效能，还能与粗提物的整体作用相互印证，有助于完善海南产火炭母抗菌体系，为其在鸡白痢防治中的应用提供更全面、扎实的理论依据。

综上所述，网络药理学预测海南产火炭母可能通过槲皮素、山奈酚等多种活性成分调控MMP9、PPARG等多个靶点，从而影响MAPK、Toll样受体信号通路等多条途径发挥抗鸡白痢作用。通过以70%乙醇为溶剂，在料液比（m/v）为1︰60，70 ℃提取45 min，提取2次的条件下获得的海南产火炭母粗提物在质量浓度为128 g·L⁻¹时，能直接杀灭鸡白痢沙门氏菌，证明海南产火炭母以黄酮类成分为主、多成分协同效应为辅起抗鸡白痢作用。