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黄瓜（Cucumis sativus L.）是世界上广泛种植的一种蔬菜，在我国种植面积高达128×104 hm2，总产量居世界首位[1]。据《海南统计年鉴2024年》数据显示，海南省的黄瓜种植面积达
8000 公顷，总产量23.49万t，并呈逐年增加的趋势，已经成为当地一种重要的蔬菜作物[2]。近年来，由尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, Foc）引起黄瓜枯萎病日趋严重，防治困难，可造成10% ～ 20%减产，严重时可导致绝产绝收[3 − 6]。目前，适宜推广种植的黄瓜抗枯萎病品种仍较少，嫁接、轮作等农业防治措施存在操作繁琐、工作量大且成本较高的缺点[7 − 8]，而传统的化学农药[9]、土壤熏蒸等化学防治措施容易带来病原菌抗药性增加、残留毒性及环境污染等问题[10]。利用有益微生物防治黄瓜枯萎病具有操作简单、绿色高效等优点，并在生产实践中得到了应用，已成为镰刀枯萎病绿色防治的一项重要措施[11]。目前，多种有益微生物被报道用于黄瓜枯萎病的防治，主要包括芽孢杆菌（Bacillus）等生防细菌[12]，木霉（Trichoderma）等生防真菌[13]和链霉菌（Streptomyces）等生防放线菌[14]。其中，芽孢杆菌具有抗逆性强、易于土壤定殖且具有防病促生等多种功效，已被广泛被报道用于黄瓜枯萎病的防治[15]。目前，已分离出解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等多种能有效拮抗黄瓜枯萎病的菌株[16 − 18]。贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新成员，具有广谱的抑菌活性和促生能力，可用于枯萎病的防治。例如，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株F9能拮抗病原菌丝生长，盆栽试验对黄瓜枯萎病有42.86%的防效[19]；菌株FJ17-4影响镰刀菌菌丝生长的同时还能抑制孢子萌发[20]。
尽管包括芽孢杆菌在内的多种生防微生物被报道用于黄瓜枯萎病的防治，但商品化的菌株仍然有限，在生产中常用解淀粉芽孢杆菌防治该病。现有生防菌株往往具有环境依赖性强、田间防效不稳定的弊端，因此从不同生境中挖掘高效的生防菌资源一直是该领域的一项长期重要的基础性工作。本研究从海南热带土壤生境中分离并鉴定黄瓜枯萎病拮抗菌，研究高活性菌株的生防潜力，以期拓展现有黄瓜枯萎病高效生防菌资源库。
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本试验所使用的尖孢镰刀菌黄瓜专化型，由海南大学热带农林学院试验室分离保存；供试土壤样品采自海南大学儋州农科基地的黄瓜发病土壤。
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在海南省儋州市黄瓜枯萎病发生地，采集不同植株根际土壤样品，用稀释涂布法进行土壤细菌分离，最后根据形态特征归类并纯化保藏。
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以Foc作为靶标菌，采用平板对峙法对分离得到的土壤细菌进行抑菌活性筛选。平板对峙法使用打孔器挑取0.5 cm直径的植物病原菌菌饼置于9 cm的培养皿中央，在菌饼2 cm两侧挑取纯化的细菌画菌线，以仅接种病原菌的培养基为空白对照，在（25 ± 0.5） ℃的黑暗条件下进行培养；待对照培养皿中病原菌直径长到培养皿直径约三分之二时，用十字交叉法测量病原菌菌落直径并计算抑菌率，采用SPSS 26 软件进行数据统计分析，利用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。
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将LTB49菌液于NA固体培养基上稀释并涂布培养，（28 ± 0.5） ℃培养24 h，在自然光下观察单菌落形态特征；生理生化特性测定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》的相关标准对菌株LTB49进行测试[21]，所涉及内容为：革兰氏染色反应、过氧化氢酶试验、明胶液化试验、甲基红试验、V-P试验、淀粉水解试验、果聚糖生成试验、二羟基丙酮生成试验、硫化氢生成试验、酪朊水解试验、酪氨酸水解试验、苯丙氨酸脱氨酶试验，以上测试均设置三组生物学重复。
利用细菌DNA提取试剂盒（Cat：YZ-D3350, 北京索莱宝科技有限公司）提取芽孢杆菌LTB49的DNA，选用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，测序结果使用Ezbiocloud网站（
https://www.ezbiocloud.net ）与相似模式菌株序列对比分析，根据MEGA 11软件的N-J法构建16S rDNA基因序列的系统发育树。 -
采用菌丝生长速率法及孢子萌发法探究芽孢杆菌LTB49滤液对Foc的抑菌活性，所有测试均设置三组生物学重复。生长速率法试验：将LTB49接种在LB培养液中，（28 ± 0.5） ℃下振荡24 h得到发酵液，调整其OD600为1，4 ℃、
5000 r·min−1离心10 min，取上清液用0.2 µm滤膜过滤得到无菌发酵滤液，将其按照1∶9的体积比混于PDA培养基，挑取0.5 cm直径的病原菌菌饼，在（25 ± 0.5） ℃的黑暗条件下进行培养，以无滤液处理为对照组，待对照组病原菌直径长到培养皿直径三分之二时，十字交叉法测量测试组直径并按照公式（1）计算抑菌率；孢子萌发试验中，收集Foc孢子悬液并调整浓度至1×105 ～1×106 CFU·mL−1，设置对照组（无生防菌）和处理组（LTB49发酵菌液）。将孢子悬液和处理菌液（OD600 = 1）等量混合，滴加到载玻片上，用盖玻片覆盖后放入密封培养皿，在（28 ± 0.5） ℃恒温培养箱中培养12 h，随后使用光学显微镜观察孢子萌发结果并按照公式（2）计算孢子萌发抑制率；判断标准为芽管长度大于孢子半径则表明孢子萌发。 -
选取长势基本一致的黄瓜苗进行盆栽试验，在黄瓜苗移栽前1 d进行灌施：空白对照组为50 mL Foc孢子液（1×107 CFU·mL−1）与50 mL蒸馏水；阳性对照组为50 mL Foc孢子液（1×107 CFU·mL−1）与50 mL解淀粉芽孢杆菌（1×108 CFU·mL−1）；处理组为50 mL Foc孢子液（1×107 CFU·mL−1）与50 mL芽孢杆菌LTB49菌悬液（1×108 CFU·mL−1）。每组重复10株苗，所有处理均设置三个重复。然后在室温16/8 h昼/夜光照下培养30 d，统计每组黄瓜的发病情况并测量黄瓜生长期的生物指标（株高、茎粗、根长、地上地下部新鲜质量），使用公式（3）和（4）计算防治效果，严重度分级标准参考行业标准[22]。阳性对照为拜尔卓润微生物菌剂分离得到的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens, QST713），试验采用SPSS 26软件进行数据统计分析，利用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。
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不同处理组如1.2.5所述，待培养30 d时对不同黄瓜处理植株相同位置的叶片、主根和侧根进行取样，每组将10棵苗样品混匀保存于−80 ℃冰箱中，使用试剂盒（Cat：BC5165, BC0090, 北京索莱宝科技有限公司）对各处理黄瓜叶片和根部的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和过氧化物酶（peroxidase, POD）活性进行测定。
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分离纯化得到一株编号为LTB49的细菌，其对Foc表现出良好的抑菌效果（图1所示），对峙试验结果表明其抑菌率为55.26%。相较于对照组，处理组显著抑制了菌丝的生长。
Figure 1. Inhibitory effect of bacterial strain LTB49 on Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum（Foc）
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LTB49在NB培养基培养24 h后所得菌落形态如图2-A所示，LTB49菌落呈浅乳白色、近圆形且表面粗糙；其革兰氏染色为紫色（图2-B），为革兰氏阳性菌；生理生化鉴定结果如表1所示，结果显示LTB49在明胶液化试验、V-P试验、淀粉水解试验、硫化氢生成试验、酪朊水解试验中都呈阳性，表明LTB49可以利用糖类物质水解淀粉。
Figure 2. Colony morphology（A）, Gram-staining characteristics（B）and phylogenetic tree reconstruction of strain LTB49 based on 16S rRNA gene sequences（C）
生理生化特性
Physiological and biochemical characteristics结果
Results过氧化氢酶 + 明胶液化Gelatin liquefaction + 甲基红Methyl red − V-P + 淀粉水解Starch hydrolysis + 果聚糖生成Fructan production − 二羟基丙酮生成Dihydroxyacetone formation + 硫化氢生成Hydrogen sulfide generation + 酪朊水解Casein hydrolysis + 酪氨酸水解Tyrosine hydrolysis − 苯丙氨酸脱氨酶Phenylalanine deaminase − 注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。 Note: “+” indicates positive reaction; “−” indicate negative reaction. Table 1. Physiological and biochemical characteristics of the bacterial strain LTB49
分子鉴定结果显示，菌株LTB49的16S rDNA序列在Ezbiocloud网站比对与模式菌株Bacillus velezensis的相似性为99.79%。使用MEGA11.0软件对LTB49及其相似序列进行比对分析，然后选择邻接法进行系统进化树构建，结果如图2-C所示，菌株LTB49处于芽孢杆菌（Bacillus）大的分支中，与贝莱斯芽孢杆菌聚合在一起。通过将形态学观察、生理生化特性与分子学鉴定结合分析，菌株LTB49被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。
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芽孢杆菌LTB49发酵滤液对Foc菌丝生长及孢子萌发的抑制效果如图3所示。菌丝生长试验结果表明，LTB49发酵滤液稀释10倍浓度时具有较为显著的抑菌活性，相较于空白对照组（图3-A），抑菌率为42.16%（图3-B）。孢子萌发试验结果表明，在正常浓度（OD600 = 1）下，经过LTB49发酵液处理的Foc孢子萌发受到严重抑制，空白对照组的孢子萌发率为98%（图3-C），而经过LTB49发酵液处理后的Foc孢子萌发率仅为9%，抑制率达到90.82%（图3-D）。结果表明芽孢杆菌LTB49具有优异的抗Foc孢子萌发效果，有作为抗孢子萌发药剂使用的潜力。
Figure 3. Inhibitory effect of strain LTB49 on Foc
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芽孢杆菌LTB49防治黄瓜枯萎病盆栽试验结果如图4-A所示，病情指数及防效在表2中呈现。试验结果表明，贝莱斯芽孢杆菌LTB49处理黄瓜生长状况良好，相较于施加了枯萎病原菌的空白对照组，处理组长势较为优异。其中空白对照组发病严重，大部分植株呈现叶片萎蔫植株枯萎状，该处理黄瓜的病情指数为76.85；而经过生防菌处理的黄瓜盆栽仅有部分植株发病，其中生防菌LTB49处理病情指数降低为43.52，防效达到43.37%，略低于阳性对照组（50.60%）。说明该生防菌在盆栽中起到了明显的抑菌效果，具有作为生防菌的开发价值。
Figure 4. Control of cucumber Fusarium wilt in pot experiments（A）and biomass comparison（B）
处理
Treatment病情指数/%
Disease index相对防治效果/%
Relative control effectCK 76.85±1.60 a – JDF 37.96±3.21 b 50.60±4.17 LTB49 43.52±4.24 b 43.37±5.52 注：同一列中不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P < 0.05水平差异显著。 Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences at P < 0.05 by Duncan's new multiple range test. Table 2. Effect of Bacillus strain LTB49 on control of potted cucumber wilt
每组黄瓜植株生长期的生物指标结果如图4-B所示。试验结果表明，空白对照组植株枯萎病发病率显著升高，普遍表现出典型矮化症状，茎基部开始出现缢缩现象。相比对照，芽孢杆菌LTB49处理组发病程度显著降低，生长状态明显提升：新鲜质量（地上部增加58.36%、地下部增加79.66%）、株高（增加22.62%）、根长（增加33.22%）及茎粗（增加37.28%）。上述数据表明，芽孢杆菌LTB49处理可有效增强黄瓜植株对Foc的抗性并促进植株生长，缓解病原菌侵染引发的植株矮化效应。说明芽孢杆菌LTB49对盆栽的活体具有一定防治效能。
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过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性指标可以用于说明植株的抗逆水平。芽孢杆菌LTB49对黄瓜叶片和根部SOD和POD活性影响结果如图5所示，在图5-A中，相较于空白处理组，在植株施加阳性对照菌剂JDF和生防菌LTB49后黄瓜植株叶片的POD活性显著下降，而主根和侧根的活性均显著上升。不同部位SOD活性在施加生防菌后产生了显著的变化（图5-B），在施加阳性对照菌剂JDF和生防菌LTB49后叶片和侧根的SOD酶活性显著上升，主根JDF和LTB49处理展示出相反的结果，JDF呈现出显著的下降，而LTB49的处理组活性有所上升，这些结果可能与植株的发病及生长情况有关。整体上，LTB49处理后黄瓜根部抗逆酶活性得到了一定的增强，这有助于加强植株对Foc的抵制作用。
Figure 5. Effects of different treatments on POD（A）and SOD（B）activities in cucumber leaves and roots
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由尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Foc）引起的黄瓜枯萎病是一种常见的土传病害，大面积发病对作物生产危害严重。为减少化学农药依赖，筛选新菌株用于丰富生防菌库、筛选黄瓜枯萎病生防菌株和增加生物防治技术手段具有重要意义。本研究从海南热带发病土壤中分离纯化出一种对Foc具有良好抑菌效果的芽孢杆菌LTB49，通过形态学观察和多种生理指标测定以及16S rRNA基因序列比对等手段，最终确定该芽孢杆菌属于贝莱斯芽孢杆菌。所使用的技术手段全面细致可靠，具有一定的说服力。其具体的生防及促生指标如下：
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芽孢杆菌作为生防菌的优势在于其多样的抑菌物质合成能力与环境适应性。本研究中，LTB49对Foc的抑菌率达55.26%，其发酵滤液对Foc的抑菌率为42.16%，发酵菌液对孢子萌发的抑制率高达90.82%，表明该菌株抑菌活性既依赖菌体本身，也与分泌的次生代谢产物密切相关。已有研究发现，贝莱斯芽孢杆菌常通过产生脂肽类物质（如表面活性素、伊枯草菌素）直接抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发[23 − 24]，如Longhao Su从水稻根际土壤分离的贝莱斯芽孢杆菌JLU-1产生多种次生代谢产物拮抗禾谷镰刀菌[25]，推测LTB49的高效抑菌效果可能与其合成核糖体肽、非核糖体脂肽或聚酮化合物等抗菌物质有关。此外，通过盆栽试验评估生防菌有效性是生物防治研究的关键[26]。盆栽试验中，LTB49处理的病情指数较对照降低43.37%，虽低于阳性对照（解淀粉芽孢杆菌剂，50.60%），但仍展现出良好的防治效果，与Tomomi Sugiyama分离到的贝莱斯芽孢杆菌AD-3对菠菜枯萎病44.1%的防效相近[27]，推测其抑菌机制可能包括直接杀菌作用与诱导植物抗性的协同效应[28]。
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LTB49对镰刀菌侵染黄瓜生长的影响（株高、根长、生物量高于对照）与其作为植物促生菌（PGPR）的特性一致[29]。芽孢杆菌可通过分泌铁载体、生长素或分解土壤有机质改善植物营养吸收，本研究中LTB49的生理生化特征（淀粉水解、明胶液化阳性）表明其具备分解复杂有机物的能力，可能为植物提供可利用的养分[30]。防御酶活性分析显示，LTB49处理后黄瓜根部（主根和侧根）的POD和SOD活性显著升高，而叶片POD活性下降、SOD活性上升，这可能反映了病原菌侵染时植物的组织特异性防御响应。根部作为病原菌入侵的首要部位，通过增强抗氧化酶活性（如POD、SOD）清除活性氧，减轻氧化损伤，叶片SOD活性的升高则可能与系统获得性抗性（SAR）的激活有关，通过诱导全身防御基因表达增强抗病性，如Ahmed Soliman通过试验表明，贝莱斯芽孢杆菌GB1提高南瓜多种氧化酶活性来诱导植物系统抗性[31]。阳性对照菌剂处理后叶片POD活性下降、主根SOD活性降低，而LTB49处理使三个部位的SOD活性均显著上升，暗示其诱导抗性的机制可能更全面，或与不同菌株代谢产物的差异相关。
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尽管化学防治仍是当前控制黄瓜枯萎病的主要手段，但其环境风险与耐药性问题亟待解决。大量研究表明，筛选高效生防菌是减少化学农药依赖的可行路径[32]。然而，生物防治的推广面临菌株稳定性、作用持续性及与其他生防措施协同等挑战。未来可通过以下途径优化：（1）利用基因工程技术增强LTB49的抗菌物质合成能力或促生功能；（2）开发复合菌剂，结合多种生防菌的协同作用提高防治效率；（3）探究LTB49与有机肥、抗病品种的配合使用策略，构建综合防治体系。
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1） 从海南黄瓜发病土壤中分离得到1株生防细菌LTB49，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），该菌对黄瓜枯萎病原菌具有拮抗效果，抑菌率达55.26%。
2） LTB49发酵菌液对黄瓜枯萎病原菌孢子萌发抑制活性高，抑制率达90.82%。
3） LB49在活体盆栽试验中对黄瓜枯萎病有43.37%的防治效果，抑制病害对黄瓜生长的矮化影响，同时提高了防御酶活性。
Biocontrol potential of Bacillus subtilis LTB49 against cucumber Fusarium wilt
doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250056
- Received Date: 2025-04-11
- Accepted Date: 2025-04-26
- Rev Recd Date: 2025-04-23
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Key words:
- cucumber Fusarium wilt /
- Bacillus velezensis /
- biocontrol potential
Abstract: To obtain an efficient biocontrol bacterial strain for managing cucumber Fusarium wilt caused by Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum (Foc), a Bacillus strain (LTB49) with strong antagonistic activity (antagonism rate of 55.26%) was isolated and screened from the rhizosphere soil of cucumber plants affected by the wilt disease, using gradient dilution and plate confrontation methods. The strain was subsequently identified as Bacillus velezensis through morphological, physiological and biochemical tests, and molecular biological techniques. The 10-fold diluted fermentation filtrate of the strain LTB49 showed strong inhibition of mycelial growth of the wilt pathogen, with an inhibition rate of 42.16%, and a significant suppression of spore germination, with an inhibition rate of 90.82%. Pot experiment results demonstrated that the strain LTB49 exhibited good biocontrol efficacy against cucumber wilt disease (43.37%), with no significant difference compared to the commercial biocontrol agent Bacillus amyloliquefaciens QST713 (50.60% efficacy). Further studies revealed that this strain enhanced resistance to the wilt disease by inducing increased activities of superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD), and significantly suppressed the effect of the Fusarium species on cucumber plant growth, particularly dwarfing. These results suggest that B. velezensis LTB49 has a high potential for application in the biocontrol of cucumber wilt disease.
| Citation: | QIAN Yunlong, ZHAO Yu, YANG Lin, ZHANG Yunfei, ZHANG Shujing. Biocontrol potential of Bacillus subtilis LTB49 against cucumber Fusarium wilt[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20250056
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