Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation system for Hydrocera triflora

于2023年4月份在海南省海口市羊山地区采集生长健康及健壮的水角的幼嫩枝条。

将幼嫩的枝条剪成长约7 cm的插穗，顶端切口平切或保留顶芽，下端切成45 °斜口；保留插穗上部叶片2 ～ 4片。每片叶子剪去1/2 ～ 2/3。

双元表达载体pCambia1301由中国热带农业科学院热带生物技术研究所言普博士所提供。pCambia1301含有由CaMV35S启动子驱动β-葡糖苷酸酶（GUS）基因。参考已报道的热击法^[17]将pCambia1301分别转入MSU440、C58C1和K599 等3种发根农杆菌菌株，具体的操作方法如下：① 取1 μg pCambia1301于100 μL发根农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；② 菌液置于冰上先预处理5 min，再置于液氮处理5 min，37℃水浴处理5 min，冰上静置5 min，加入700 μL TY液体培养基28℃ 200 rpm振荡培养2 h；③ 将菌液涂布于含50 mg·L⁻¹卡那霉素（Kana）和50 mg·L⁻¹ 链霉素（Strep）的TY固体培养基上，28℃培养2 d；④ 将单克隆菌落接种于含有相应抗生素的TY液体培养基中，28℃ 200 rpm振荡培养过夜，PCR检测阳性克隆，获得含GUS基因的发根农杆菌菌株，用于下面的水角遗传转化实验。

采用土培扦插转化法和水培扦插转化法2种转化方式对水角插穗进行转化处理。土培扦插转化法的操作步骤如下：① 在水角插穗下端斜面处涂布上含有GUS目的基因的K599菌体，移植于湿润的无菌土壤基质（蛭石∶泥炭土∶椰糠=1∶1∶1），再向移植好的插穗浇灌1 mL 相应的发根农杆菌发酵液。② 保持环境相对湿度90%，控制温度28℃，遮光度70%，培养15 d后，观察转化效果。水培扦插转化法的操作步骤：① 对水角插穗下端斜面处蘸上含有GUS目的基因的K599菌体。② 在含有50 mg·L⁻¹ Kana、50 mg·L⁻¹ Strep TY液体培养基中加入1%（v/v）的活化的带有GUS基因载体的K599菌株，28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.8，4000 rpm离心5 min，收集菌体。②将菌体稀释于清水中，直至OD₆₀₀为0.1。③将插穗置于含有菌体稀释液的水培育苗箱中，确保约1/3插穗的下部浸于溶液中，培养温度为28℃，培养15 d后，观察转化效果。

为了比较这2种转化方法的效果，对获得的水角植株的毛状根进行GUS组织化学染色，来确定阳性的转基因水角复合植株，并统计转化率。为了数据的准确性，我们统一用带顶芽的水角插穗作为转化材料。每个处理侵染10个插穗，每个处理重复3次。根据GUS检测结果来统计转化率，转化率（%）=（阳性转基因植株数量/检测的植株总数）×100，比较这2种转化方法的转化效果。作Student t-test检验，P< 0.05为显著差异。

用上面制备好的带GUS目的基因载体的MSU440、C58C1和K599 等3种发根农杆菌菌液，采用水培扦插转化法分别转化带顶芽的水角插穗。每个处理侵染10个插穗，每个处理重复3次。根据GUS检测结果来统计各处理转化率，比较各菌株的转化效果。作ANOVA方差分析, P< 0.05为显著差异。

用前面制备好的带GUS目的基因载体的K599菌液，采用水培扦插转化法分别处理带顶芽的和没顶芽的水角插穗。每个处理侵染10个插穗，每个处理重复3次。根据GUS检测结果来统计2种类型插穗的转化率，比较它们的转化效果。作Student t-test检验，P< 0.05为显著差异。

GUS组织化学染色应用商业化的GUS试剂盒（北京,中科瑞泰），实验操作按试剂盒说明书进行。剪取水角复合植株的毛状根，用dH₂O清洗干净，滤纸吸干根上的水珠后置于含GUS染色液的离心管中，离心管用锡箔纸包扎好后于50 rpm振动培养30 min，将材料转至无水乙醇中脱色，体视显微镜下观察染色情况。

采用高效植物基因组DNA提取试剂盒（北京，天根）提取样品DNA。剪取100 mg复合植株的根部，用清水清洗3遍，无菌滤纸吸干水珠后置于研砵中，加入液氮进行研磨，再根据试剂盒说明书进行DNA提取。设计GUS基因引物，GUS-F:5'- CTGGGTGGACGATATCACCG- 3',GUS-R: 5'- GCGAAATATTCCCGTGCACC-3'。1%（m/v）凝胶电泳检测PCR扩增产物。

（1）海藻糖-6-磷酸合成酶基因MeTPS6的克隆

取盆栽2个月的木薯品种Ku50的根部，采用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒（北京，天根）提取木薯根的总RNA，再用TransScript一步法gDNA去除及cDNA合成试剂盒（北京，全式金）反转录合成一链cDNA。从GenBank中查找到木薯的海藻糖-6-磷酸合成酶基因MeTPS6序列（登录号：MF684374.1），设计MeTPS6引物（MeTPS6-1-F: 5'-ATGGTGTCAAGGTCATACTC-3'， MeTPS6-1-R: 5'-CACTGCAACTGTTTGTTCTG-3'），以木薯根cDNA为模板DNA扩增MeTPS6。采用pMD19-T载体（北京，宝生物）对PCR扩增产物进行T载体克隆，将克隆好的T载体送至华大基因测序，确保MeTPS6序列正确。

（2）构建海藻糖-6-磷酸合成酶MeTPS6基因过表达载体

参考所报道的Nimble Cloning（NC分子克隆）技术^[18]构建海藻糖-6-磷酸合成酶基因MeTPS6过表达载体。以上面构建好的含有MeTPS6基因的T载体质粒为模板，对MeTPS6基因进行扩增，所用的引物为：MeTPS6-2-F: 5'- agtggtctctgtccagtcctATGGTGTCAAGGTCATACTC-3'，MeTPS6-2-R: 5'- ggtctcagcagaccacaagtCACTGCAACTGTTTGTTCTG-3'（小写字母为NC框接头序列）。对PCR扩增产物进行1%（m/v）凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒（南京，诺唯赞）纯化回收目的条带。采用NC克隆试剂盒（海南，壹田）将纯化回收后的PCR产物与带有NC克隆框的载体pNC-Green-SubC（由中国热带农业科学院热带生物技术研究所言普博士馈赠）进行NC克隆反应。将反应产物通过热击法导入感受态E.coli TOP10菌株中，菌液涂布在含有50 mg·L⁻¹ Kana的LB固体培养基上，转化平板于37℃过夜培养后，挑选阳性克隆于含50 mg·L⁻¹ Kana的液体LB培养上37℃振荡培养16 h，用菌液作模板扩增MeTPS6基因，PCR扩增产物送至华大基因测序，确定序列正确的阳性克隆为构建成功的新载体，命名为pGreen-35s:MeTPS6-EGFP。

参照前面所建立的优化的转基因水角复合植株技术体系进行MeTPS6基因过表达载体转化水角研究，具体操作如下：① 采用热击法将载体pGreen-35s:MeTPS6-EGFP导入感受态发根农杆菌K599中。② 对带有顶芽的水角插穗下端斜面处涂上携带pGreen-35s:MeTPS6-EGFP的发根农杆菌K599菌株。③ 在含有50 mg·L⁻¹ Kana、50 mg·L⁻¹ Strep TY液体培养基中加入1%的活化的携带目的基因的K599的菌液，28℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.8，离心收集菌体。④ 用清水稀释菌体至OD600值为0.1，将下端斜面处已涂抹发根农杆菌的插穗置于含有菌体稀释液的水培育苗箱中，28℃培养40 d。

将手持荧光电筒（LUYOR-3415RG，美国）的发射光波调至绿色荧光波长500 nm，在黑暗条件下照射pGreen-35s:MeTPS6-EGFP转化的水角植株，检测阳性转基因植株。用高效植物基因组DNA提取试剂盒分别提取阳性转基因植株的根部基因组DNA，设计EGFP基因引物（EGFP-F:5'-AGGACGACGGCAACTACAAG-3'， EGFP-R:5'-TCTCGTTGGGGTCTTTGCTC-3'），以根部基因组DNA为模板进行PCR扩增，1%（m/v）凝胶电泳检测PCR产物。

配制好浓度为3%（m/v）的polyethylene glycol-6000（PEG-6000）水溶液，将过表达MeTPS6基因的转基因和非转基因水角植株的根部浸泡于装有3%（m/v）PEG-6000的水溶液玻璃瓶中，28℃自然光照条件培养，观察它们的耐旱性。

参考Han等^[16]报道的方法测定转基因水角复合植株海藻糖含量。剪取转基因植株的根1 g，用液氮研磨至粉末，加入15 mL 80%（v/v）乙醇，在80℃水浴中处理30 min，6000 rpm离心10 min，取上清。再向沉淀物中加入15 mL 80%（v/v）乙醇，重复抽提2次。将重复抽提的上清与前面的上清合并，80℃烘干乙醇，加无离子水定容至5 mL，用0.22 um滤膜过滤滤液。准备好0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·L⁻¹的海藻糖标准液。将样品进样至高效液相色谱仪（Waters e2695）中，每次进样10 uL，采用的流动相为乙腈∶水（含0.1%（m/v）的NH₄OH）（70∶30），流速1.0 mL·min⁻¹，柱温为25℃，xbridge-NH₂为色谱柱。检测器的条件是氮气流速2 L·min⁻¹，漂移管温度85℃。

我们采用了土培扦插转化法和水培扦插转化法对水角插穗进行转化处理，结果发现这2种方法均能获得具有毛状根的植株（图1）。在土培扦插转化法中，在插穗斜面处涂布K599菌体，将插穗移植于湿润的含蛭石、泥炭土、椰糠的基质中，再浇上K599菌液，培养15 d后插穗基部长出毛状根（图1-A）。在水培扦插转化法中，插穗斜面处预先蘸上K599菌体，再插入K599菌液稀释液，培养15 d后，插穗基部也长出毛状根（图1-B）。

Figure 1.  Establishment of Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation system for Hydrocera triflora

GUS组织化学染色结果显示，阳性转基因植株的毛状根显示蓝色（图2-A），而阴性非转基因植株的毛状根颜色没有任何变化（图2-B）。对这2种转化方法的转化率进行分析，结果显示土培扦插转化法的转化率为43.3%，而水培扦插转化法的转化率为63.3%，后者显著高于前者（图2-C）。随机选取GUS检测阳性的植株10株，提取其根部基因组DNA，PCR检测，结果发现均能扩增出GUS基因片段的目的条带，目的条带大小为732 bp（图2-D），因此再一步证实GUS检测阳性植株为转基因水角复合植株。上述结果表明水培扦插转化法优于土培扦插转化法。

Figure 2.  Comparison of transformation rates between soil cultivation and hydroponic cutting transformation methods

为了进一步优化发根农杆菌介导的水角转基因技术体系，我们采用水培扦插转化法试验MSU440、C58C1、K599等3种发根农杆菌对带顶芽的水角插穗的转化效果。这3种菌株均携带载体pCambia1301。对各处理植株的毛状根进行GUS染色检测，根据检测结果统计转化率。结果表明，菌株MSU440和C58C1转化率最低，分别为36.7%和33.3%（图3）；菌株K599的转化率显著高于另二个菌株，达到63.3%（图3）。因此，在发根农杆菌介导的水角转基因技术体系中选用菌株K599转化效果最佳。

Figure 3.  The effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on Hydrocera triflora transformation efficiency

水角的插穗存在2种类型，一种是带顶芽的，另一种是没顶芽的。为了验证这2种类型的插穗是否对水角转化率存在影响，从而更进一步优化发根农杆菌介导的水角转基因技术体系，我们采用水培扦插转化法，并选用携带了表达载体pCambia1301的发根农杆菌K599菌株来进行该研究。结果表明，没顶芽的插穗转化率为40.0%；而带顶芽的插穗转化率高达63.3%，显著高于没顶芽的插穗（图4）。这些结果表明，带顶芽的插穗的转化率优于没顶芽的插穗。

Figure 4.  The effect of different types of cuttings on Hydrocera triflora transformation efficiency

NC克隆技术是一种简单高效的分子克隆技术^[18]。基于该技术逐渐被广泛应用，NC克隆技术的开发者随后开发一套基于Nimble Cloning的植物表达载体，其中包括pNC-Green-SubC^[19] 。植物表达载体pNC-Green-SubC中的CaMV 35s启动子连接NC克隆框和标记基因EGFP。我们从木薯根部扩增到不带终止密码子的MeTPS6基因序列，长度共计2562 bp，T载体克隆该基因序列，以此T载体质粒为模板，用带NC克隆框接头的引物MeTPS6-2扩增MeTPS6基因序列，获得两端带NC克隆框接头的MeTPS6基因序列。将MeTPS6基因序列与pNC-Green-SubC载体进行NC克隆反应，获得新的载体pGreen-35s:MeTPS6-EGFP（图5）。在新载体中，CaMV 35s启动子驱动MeTPS6和EGFP进行融合表达。

Figure 5.  Construction of pGreen-35s:MeTPS6-EGFP

本研究构建了MeTPS6基因过表达载体pGreen-35s:MeTPS6-EGFP，应用所建立的发根农杆菌介导的转基因水角复合植株技术体系转化至水角植株中，获得了转基因水角复合植株。非转基因与转基因的水角植株在形态上没有表现差异（图6-A、C）。对转基因植株进行绿色荧光检测，结果发现在发射光波长500 nm照射下，非转基因植株的根、茎、叶均显示红色（图6-B）；阳性转基因复合植株的毛状根显示绿色，而其茎和叶均显示红色（图6-D）。随机选取10株经荧光检测为阳性转基因的复合植株，分别提取它们的毛状根DNA，经PCR检测，它们均能扩增出EGFP基因片段（图6-E），进一步证实它们是转基因复合植株。

Figure 6.  pGreen-35s:MeTPS6-EGFP transformed Hydrocera triflora using Agrobacterium rhizogenes mediated method

将转基因水角复合植株和非转基因水角植株的根部浸泡于3%（m/v）PEG-6000溶液中，培养3d后，非转基因水角植株叶片出现萎蔫（图7-A），转基因水角复合植株生长正常（图7-B）。选取3株转基因植株检测其毛状根的海藻糖含量，发现它们的海藻糖含量在0.032-0.053 mg·g⁻¹ FW（图7-C）；而对照的根部由于海藻糖含量太低，超出仪器检测的灵敏度范围，因此没有检测到海藻糖含量。这些结果表明转基因水角复合植株的耐旱能力得到显著改善。

Figure 7.  Drought tolerance testing of transgenic Hydrocera triflora

有关水角组织培养的报道极少。王景飞等^[20]以水角的种子和茎段为外植体，通过优化培养基组分来诱导这些外植体上的芽点形成不定芽和丛生芽，获得水角再生植株。这种不经过愈伤组织获得再生植株的组织培养方法不能应用于根癌农杆菌介导的遗传转化技术上。目前发展出不依赖组织培养的发根农杆菌介导的遗传转化方法，这些研究均是通过携带目的基因的发根农杆菌侵染种子下胚轴，获得由转基因毛状根和野生型茎叶组成的转基因复合植株，这些转基因复合植株可用来改良性状和研究相关基因的功能^{[6 − 9]}。这种遗传转化方法具有操作简单、转化率高、不依赖组织培养和基因型等优势。为此本研究借鉴该技术来尝试建立水角的高效、便捷、不依赖组织培养的转基因技术体系。由于水角种子萌发率极低，我们便选用水角插穗来代替种子幼苗作为农杆菌侵染外植体，并成功建立了基于发根农杆菌介导的水角转基因技术体系。本研究的结果为其他水生植物以及极难获得种子或种子萌发率低的植物的性状改良和基因功能验证提供了技术参考。

不同的发根农杆菌菌株对植物转化率存在一定的影响。在柱花草遗传转化研究中，菌株K599和Arqual的转化率达95%，均显著高于MSU440菌株，而ArA4和Ar1193菌株不能诱导产生转基因毛状根^[9]。本研究也得到相似的结果。我们发现菌株K599的转化率达到63.3%，显著高于菌株SU440和C58C1（图3）。在鹰嘴豆^[6]、大豆^[21]等植物的发根农杆菌介导转化研究中，菌株K599被证明是最合适的转化菌株。因此菌株K599可能适合较多种植物的转化。

发根农杆菌能够在无激素促进、无抗性筛选的条件下诱导植物被侵染部位产生毛状根^[22]，因此被广泛应用于基因功能验证、次生代谢产物等方面的研究^[6,9,23]。发根农杆菌诱导被侵染部位产生的毛状根其阳性率在不同的物种中存在差异。Wang等^[9]发现柱花草阳性复合转基因植株的毛状根阳性率达到100%。而Fan等^[8]发现大豆阳性复合转基因植株的毛状根阳性率与转化方法相关，其中二步转化法最高，为53.85%。在本研究中，水角阳性复合转基因植株的毛状根阳性率达到100%（图6-D），与柱花草的相似。

海藻糖-6-磷酸合成酶是海藻糖生物合成代谢的关键酶，在植物干旱等非生物胁迫中起到重要作用^[11,24]。MeTPS6基因主要在木薯的根中表达，且参与了木薯的抗旱等胁迫响应^[25]。本研究构建了MeTPS6基因过表达载体，并转化至水角的毛状根中，获得转基因复合植株（图6）。目前所报道的植物耐旱实验基本上采用PEG-6000溶液处理来作为模拟干旱胁迫处理 ^[16,26,27]。本研究也采用PEG-6000溶液处理过表达MeTPS6基因的转基因复合植株，培养3d后发现转基因复合植株生长正常，而对照出现萎蔫（图7-A、B），说明转基因复合植株的耐干旱胁迫能力得到明显提升。

本研究采用NC分子克隆^[18]这一新的克隆技术来构建植物表达载体，与当前广泛应用的Gibson assembly^[28]和Gateway cloning^[29]分子克隆技术相比，具有如下优势：① Gibson assembly需要将目标载体质粒酶解线性化后，目的基因才能克隆至目标载体上，而NC不需要将目标载体质粒酶解线性化，目的基因片段可直接克隆至环状的质粒上；② Gibson assembly的插入片段限制于PCR产物，Gateway cloning需要入门克隆，而NC比较灵活，可以直接使用PCR产物或者入门克隆；③ Gateway cloning在重组位点上会留下一个25 bp的缝，而NC能进行完全无缝克隆；④ 多片段组装时，Gateway cloning的克隆效果极差，而NC的克隆效果不受影响。此外，研究者还开发出一套基于Nimble Cloning的植物表达载体^[19]，可用于基因异位表达、基因沉默、亚细胞定位、蛋白互作、启动子活、CRISPR/Cas9基因编辑等研究。

首次建立了高效、不依赖组织培养的水角遗传转化体系。对该转化体系进行优化研究，以水角插穗为发根农杆菌侵染外植体，发现水培扦插转化法的转化率显著高于土培扦插转化法；发根农杆菌菌株K599转化率最高；选用带顶芽插穗作为侵染外植体，其转化效果优于无顶芽插穗。经优化的水角转化体系其转化率高达63.3%。此外，构建了过表达海藻糖-6-磷酸合成酶MeTPS6基因的载体pGreen-35s:MeTPS6-EGFP，通过转化获得了过表达MeTPS6转基因水角复合植株。3%（m/v）PEG-6000溶液处理3d后，发现转基因植株生长正常，而对照出现萎焉现象；转基因植株毛状根的海藻糖含量为0.032～0.053 mg·g⁻¹ FW，显著高于对照，表明过表达MeTPS6转基因水角复合植株的耐旱能力得到显著改善。