Effect of combination of Syzygium infrarubiginosum extract and fungicides on disease control

立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）均由海南大学热带农林学院分离、鉴定并备份。立枯丝核菌于PDA斜面上保存于4 ℃冰箱；豇豆白粉菌是一种专性活体营养型寄生真菌，保存于豇豆叶片。

植物褐背蒲桃（S. infrarubiginosum）采集于海南省昌江黎族自治县，由海南大学热带农林学院鉴定并保存。

乙酸乙酯、无水乙醇，无水甲醇（分析纯，西陇科学有限公司），农乳601^＃以及蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40，江苏省海安石油化工厂）。25%乙嘧酚悬浮剂、40%苯醚甲环唑悬浮剂以及30%吡唑醚菌酯悬浮剂（江西益禾化工股份有限公司），240 g·L⁻¹噻呋酰胺悬浮剂（日式化学株式会社）。

马铃薯琼脂葡萄糖培养基（PDA）：蒸馏水1 L，去皮马铃薯200 g，大火煮沸25～30 min，过滤，液体定容1 L，调至小火，缓慢加入葡萄糖18 g，琼脂20 g，待其完全溶解，定容，分装。121 ℃，灭菌20 min，备用。

取褐背蒲桃地上部分，恒温鼓风干燥箱50 ℃烘干后粉碎，将褐背蒲桃粉末放入90%（v/v）的甲醇（MeOH，5 L）溶液中浸泡48 h，重复浸泡3次，褐背蒲桃粉末与甲醇溶液的质量体积比为1∶10，合并3次浸泡液，过滤除去残渣，50～60 ℃减压旋蒸浓缩至膏状，4 ℃保存^[25]。

按照5∶10∶10∶5∶10∶60的比例（质量比），加入5 g褐背蒲桃甲醇提取物浸膏，接着加入10 g乙酸乙酯、10 g无水乙醇，使用磁力搅拌器充分混匀，然后加入5 g农乳601^#、10 g EL-40，最后加入无菌水，定量至100 g，充分搅拌混匀，得到5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液，4 ℃保存。

25%乙嘧酚悬浮剂、40%苯醚甲环唑悬浮剂、30%吡唑醚菌酯悬浮剂，240 g·L⁻¹ 噻呋酰胺悬浮剂均用无菌水配制，现配现用。

选择菌丝生长速率法^[26]进行室内毒力测定。根据预实验各药剂的抑制率，设置6个浓度梯度，实验步骤参照王鑫雨等^[27]的真菌培养和菌丝生长测定的方法，将药液根据设置浓度，加入冷却至45～50 ℃ 的PDA 培养基中，充分混匀，均匀倒入90 mm培养皿中，每个处理重复3次。使用无菌打孔器于预培养2 d的立枯丝核菌菌落边缘打孔取直径5 mm的菌饼，并将其接种于PDA 平板中心，封口。接种平板置于（27±1） ℃培养箱，黑暗培养2 d。根据下列公式计算褐背蒲桃甲醇提取物、乙嘧酚、噻呋酰胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯以及复配药剂对水稻纹枯病菌菌丝生长抑制率。

式中，D_ck为对照组菌落直径（mm）；D_t为药剂处理组菌落直径（mm）。

5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液与4种单剂按照质量比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1混合配制。用Wadley方法^{[30 − 31]}评价二元复配药剂的联合毒力，该方法可以估计任何浓度杀菌剂之间的互作，评价的可靠性与病害的防治水平相互独立。通过比较增效系数（SR）来评价复配剂的联合作用，联合作用分为拮抗作用（0～0.499）、相加作用（0.500～1.499）、增效作用（1.500以上）。混剂理论抑制中浓度EC₅₀（th）^{[28 − 29]}和增效系数（SR）^[32]的计算公式如下：

式中，A和B分别为复配的试剂；a和b代表复配试剂中A和B所占的体积比；EC₅₀（A）、EC₅₀（B）分别为A、B的EC₅₀实际抑制中浓度，mg·L⁻¹；EC₅₀（th）为复配剂的EC50理论抑制中浓度，mg·L⁻¹；EC₅₀（ob）为混配药剂实际抑制中浓度，mg·L⁻¹。

将水稻种子使用温水浸泡 1 h，催芽 24 h，萌发的种子培养在育苗盘中，当苗高约10 cm 时移栽至塑料盆中，每盆 1 株，待苗达到分蘖中期时，挑选长势一致的水稻植株进行活性测定，水稻培养和水稻纹枯病菌接种方法参考贺闽等^[33]。选取木片，剪成长宽分别为1 和3 mm的小木片,灭菌烘干备用。吸取PDA培养基于培养皿中，挑取小木片置于培养皿中，待到培养基冷却凝固后于培养皿中间接种水稻纹枯病菌，后置于28 ℃ 恒温培养箱中培养，待木片长满菌丝后进行室内活性测定。药剂使用0.2%吐温−80水溶液配制供试0.2 g·L⁻¹ 的供试药液,各 20 mL备用。药剂保护活性测定时，均匀喷洒供试药液于水稻植株上，24 h后将带菌小木片嵌入水稻植株叶枕下；治疗活性测定时，接种带菌小木片24 h后，喷洒供试药液，处理后的水稻正常培养。0.2%吐温−80水溶液为空白对照，每个处理重复3次，7 d之后观察并记录植株叶鞘发病情况。水稻纹枯病分级参考刘启凤等^[34]（表1），病情指数及其防治效果计算如下。

式中：DI为病情指数；D_N为各级病株数；D_T为调查总株数；G_N为对应的病级；G_T为最高病级；C_E为防治效果；DI_C为对照组病情指数；DI_T为处理组病情指数。

采用文献[35]的方法，培养豇豆苗和接种豇豆白粉病原菌，测定褐背蒲桃甲醇提取物微乳液与乙嘧酚、噻呋酰胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯悬浮液和具有增效的混剂对豇豆白粉病的防治效果。用0.2%的吐温−80水溶液配制0.5 g·L⁻¹的供试药液，20 mL备用。用灭过菌的刷子轻轻将发病豇豆叶片上的白粉菌孢子刷入含无菌水的小瓶子中，采用血球计数法在显微镜下调整浓度为5 × 10⁶ CFU·mL⁻¹的孢子悬浮液，现配现用。播种豇豆于塑料盆中，15 d后，待豇豆苗长到2叶期时，选择大小长势相似的豇豆植株进行活性测定。测定药剂保护活性，将供试药液均匀喷洒到豇豆苗上，直到液体均匀布满所有叶片，24 h后，均匀喷洒孢子悬浮液；测定药剂治疗活性，在均匀喷洒孢子悬浮液24 h后，均匀喷洒供试药剂，直到液体均匀布满所有叶片。以0.2%吐温−80水溶液为空白对照。每个处理设置5个重复。培养14 d后，观察并记录豇豆叶片发病情况。

参考文献[36]的行业标准进行病情分级（表2），病情指数及其防治效果计算同1.2.5中公式（4）和（5）。

试验数据采用IBM SPSS Statistics 21.0处理系统和Excel处理。单因素方差分析后，显著性最小差异法（LSD）进行显著性分析（P<0.05）。

各药剂对水稻纹枯病菌的生物活性测定结果见表3。吡唑醚菌酯（EC₅₀为0.039 mg·L⁻¹）、噻呋酰胺（EC₅₀为0.043 mg·L⁻¹）和苯醚甲环唑（EC₅₀为0.043 mg·L⁻¹）悬浮液均对立枯丝核菌表现出较好的抑菌效果，褐背蒲桃甲醇提取物EC₅₀为110.719 mg·L⁻¹，乙嘧酚EC₅₀为246.348 mg·L⁻¹。

表3中，在36组混剂处理中有11组混剂的联合毒力表现出增效作用，SR在1.600～2.987；有19组混剂的联合毒力表现出相加作用，SR在0.628～1.483。有6组混剂的联合毒力表现出拮抗作用，SR在0.104～0.305。

褐背蒲桃甲醇提取物与乙嘧酚、噻呋酰胺复配效果优异，均表现出相加作用或增效作用。褐背蒲桃甲醇提取物与乙嘧酚质量比为1∶2、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1时，复配抑菌活性要大于褐背蒲桃甲醇提取物和乙嘧酚单独使用的活性；与噻呋酰胺质量比为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，复配活性要大于褐背蒲桃甲醇提取物和噻呋酰胺单独使用的活性；褐背蒲桃甲醇提取物与吡唑醚菌酯复配质量比为2∶1时，表现出拮抗作用，其余均为相加作用或增效作用；褐背蒲桃甲醇提取物与苯醚甲环唑复配，褐背蒲桃甲醇提取物含量多于苯醚甲环唑，就表现出相加作用，反之则表现出拮抗作用。

5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液与5%的乙嘧酚、噻呋酰胺、吡唑醚菌酯悬浮液及增效混剂对水稻纹枯病的防治效果见图1和图2所示。4种单剂防治效果相比较，存在显著差异，其中5%噻呋酰胺悬浮液的保护活性90.24%和治疗活性65.86%表现最佳。

Figure 1.  Protective activity of 0.2 g·L⁻¹ single agent and six mixtures against rice sheath blight

Figure 2.  Control activity of 0.2 g·L⁻¹ single agent and six mixtures against rice sheath blight

5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液与5%吡唑醚菌酯悬浮液混配，其保护作用防效分别为51.21%、60.98%与单剂防效65.86%相较，未出现增效；治疗活性作用防效分别为56.09%、65.86%与单剂防效51.21%相较，增效明显。与5%乙嘧酚悬浮液质量比2∶1混配的保护活性防效为60.98%，显著高于单剂防效31.70%，质量比4∶1混配时，防效31.70%与单剂相当，而在保护作用中质量比4∶1混配的保护活性防效为51.21%，显著高于单剂防效41.47%。与5%噻呋酰胺悬浮液混配，保护作用无明显增效；在治疗作用中，混配防效分别为85.37%、90.24%，显著高于其单剂防效65.86%，增效明显。（表4）。

褐背蒲桃甲醇提取物与3种单剂及复配增效比例药剂对豇豆白粉病的防治效果如图3和图4所示。4种单剂防治效果存在一定差异，其中5%乙嘧酚悬浮液和5%吡唑醚菌酯悬浮液的保护活性和治疗活性表现最佳，能够有效抑制白粉病的发生，5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液的保护活性80.97%优于治疗活性73.81%。在保护活性测定中，混剂防效显著高于5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液防效80.97%，其保护作用防控效果与化学单剂旗鼓相当，而混配化学药剂使用浓度低于单剂浓度，有效实现化学农药减量；在治疗活性测定中，5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液与5% 吡唑醚菌酯悬浮液按质量比5∶1混配防效97.62%优于5% 吡唑醚菌酯悬浮液防效95.24%；其与5%噻呋酰胺悬浮液混配，防效均为95.24%高于5%噻呋酰胺悬浮液防效90.47%。以上混配组合的防治效果较单剂防控相当，而混配药剂中化学药剂使用浓度低于单剂浓度，而有效实现化学农药减量的同时可作为延缓抗药性发生的选择（表5）。

Figure 3.  Protection effect of 0.5 g·L⁻¹ single agent and six mixtures on cowpea powdery mildew

Figure 4.  Control effect of 0.5 g·L⁻¹ single agent and six mixtures on cowpea powdery mildew

本研究主要探讨了褐背蒲桃甲醇提取物与4种化学杀菌剂（乙嘧酚、吡唑醚菌酯、噻呋酰胺、苯醚甲环唑）混配室内联合毒力的增效配比及对水稻纹枯病和豇豆白粉病的室内防治效果。通过菌丝生长速率法测定了褐背蒲桃甲醇提取物与4种化学杀菌剂在不同体积配比下对水稻纹枯病菌的联合毒力，结果显示，在36组混剂处理中，有11组表现出增效作用，其中褐背蒲桃甲醇提取物与吡唑醚菌酯在4∶1、5∶1混配时的SR分别为2.349、2.987，与噻呋酰胺在1∶3、1∶4、1∶5混配时的SR分别为2.714、2.455、2.167，以上5组混配剂组合均展现出优异的增效作用。豇豆白粉病和水稻纹枯病室内盆栽活体实验结果表明，褐背蒲桃甲醇提取物与3种化学杀菌剂混配的防治效果能实现减少化学农药使用量，同时有效抑制病斑的大小。在水稻纹枯病盆栽实验中，5%褐背蒲桃甲醇提取物微乳液的保护活性与治疗活性无明显差异，但其与化学药剂混配时，防治效果与单一药剂施用相比，其治疗活性增效的整体表现优于保护活性。室内毒力测定实验结果显示，当效果相当时，混配中化学杀菌剂使用浓度低于单剂浓度，能有效减少化学农药使用量的混配中化学药剂的使用浓度低于单剂浓度，能有效实现减量化学农药的目的并有利于延缓抗药性的发生。

植物源农药与化学农药复配后对植物致病真菌协同毒力作用，突破了以化学农药为主的防治对策的局限性^[37]。利用植物源农药与化学农药复配可显著增强对病原菌的毒力作用，达到增效作用^{[38 − 39]}。目前对复配药剂增效机理尚不明确，据各种已有是褐背蒲桃甲醇提取物中存在促进药剂渗透的物质，在联合作用下提高了复配药剂的防治效果，下一步工作可以聚焦在褐背蒲桃甲醇提取物的活性成分进行分离鉴定。

综上所述，本研究筛选出了一系列褐背蒲桃甲醇提取物与化学杀菌剂的增效配比，这些复配药剂不仅能有效防治水稻纹枯病和豇豆白粉病，还能减少化学农药的使用，延缓抗药性的发展，对环境友好，并为植物源农药的开发和应用提供了新的策略和理论依据。