The toxic effect of water extracts from five plants on the Bursaphelenchus xylophilus

供试虫源分离自广西壮族自治区钦州市浦北县的马尾松（22°5′1″N, 109°17′37″E），由广西大学林学院实验室传代保存。在25 ℃条件下，将松材线虫置于长满灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的PDA培养基上培养7 d。根据刘慧琳等人^[26]的方法对松材线虫进行同龄化处理，收集得到大量的同龄松材线虫。

2024年3～5月广西壮族自治区南宁市境内采集健康良好的苦楝、马缨丹、辣蓼、油茶、薇甘菊五种植物。其中，草本植物薇甘菊、马缨丹和辣蓼取全株，木本植物苦楝和油茶取叶片。将供试植物烘至恒重后过400目筛，精确称取50 g粉末，加入250 mL蒸馏水中浸提24 h（温度25 ℃），重复浸提3次。合并浸提液后使用旋转蒸发仪（温度85 ℃，转速150 r·min⁻¹）浓缩至膏状物，放置于4 ℃冰箱中保存备用。

将五种植物分别配制成浓度为40、20、10、5、2.5 g·L⁻¹的水提物溶液，按照倪安顺等人^[27]的方法测定松材线虫毒力测定。分别在24 h、48 h、72 h后统计死亡数量，计算其死亡率、校正死亡率，绘制并处理48 h的毒力回归方程，得到LC₅₀值。其中：死亡率（%）=处理组死亡数/处理组总数×100%；校正死亡率（%）=（处理组死亡率–对照组死亡率）/（1−对照组死亡率）×100%。

选取1.3实验所得到的半致死浓度LC₅₀，参考程乐^[28]的松材线虫运动能力测定方法分别统计处理0 h、1.5 h、3 h、6 h、12 h和24 h下的松材线虫30 s内头部摆动和身体弯曲频率。

选取1.3实验所得到的半致死浓度LC₅₀，参考程乐的方法^[28]测定松材线虫产卵量。分别使用5种水提液随机处理一日龄的未交配的松材线虫雄虫和雌虫各10条，将其转移到无菌水中进行交配、产卵。记录48 h后每个处理组的产卵量。

将一日龄的松材线虫雌虫和雄虫各10条转移到具有灰葡萄孢的平板上生长24 h后将卵分离，使用蒸馏水制成卵悬浮液（每100 μL约含150粒）。选取1.3实验所得到的半致死浓度LC₅₀，参考程乐的松材线虫孵化率方法^[28]分别使用5种水提液处理48 h后统计卵孵化率。其中：卵孵化率（%）=[幼虫/（卵+幼虫）]×100%。

选取1.3实验所得到的半致死浓度LC₅₀处理24 h后的松材线虫雌虫和雄虫各10头，放至长满灰葡萄孢菌的平板上培养48 h后分离，统计各处理线虫种群繁殖数量。

使用Microsoft Excel 2019软件录入实验数据并整理；使用Graphpad Pism9.5软件制作图表；使用IBM Statistic SPSS 27.0软件进行单因素方差分析和双因素方差分析，对药剂进行毒力回归分析，计算LC₅₀值及其95%置信限。

五种植物水提液在不同浓度及时间下对松材线虫的毒杀活性表明（图1），药剂效果随着质量浓度的增加和处理时间的延长而增强，但不同药剂之间也存在差异（p<0.05）。在72 h处理时间和40 g·L⁻¹浓度下，马缨丹对松材线虫的毒杀活性最强，校正死亡率最高（95.05%），其次为油茶（91.41%）和苦楝（91.25%），其余三种植物处理组之间对松材线虫的毒杀效果没有显著性差异（p>0.05）。

Figure 1.  Corrected mortality of Bursaphelenchus xylophilus treated with five plant water extracts with different mass concentrations under different treatment time

测定处理48 h时5种植物提取物的半致死浓度（LC₅₀）表明（表1），苦楝的杀线虫效果最好（LC₅₀=5.91 g·L⁻¹），其次为油茶（LC₅₀=5.97 g·L⁻¹）和马缨丹（LC₅₀=7.74 g·L⁻¹）。5种植物提取物毒力回归方程的相关系数均大于0.9，说明5种植物提取物的浓度和松材线虫校正死亡率之间的相关性密切，植物提取物浓度的对数和松材线虫的校正死亡率成正相关。

与对照组相比，马缨丹、油茶、苦楝对松材线虫的头部摆动频率具有明显的抑制作用（p<0.01），随着处理时间的增加，松材线虫头部摆动频率呈下降趋势（图2−A）。其中，马缨丹对松材线虫头部摆动频率表现出较好的抑制效果。与对照组相比，马缨丹、油茶、苦楝对松材线虫的身体弯曲频率具有显著抑制作用（p<0.01），随着处理时间的增加，松材线虫身体弯曲频率呈下降趋势（图2−B）。其中，马缨丹对松材线虫身体弯曲频率表现出较好的抑制效果。

Figure 2.  Effects of five plant water semi-lethal concentration LC₅₀ (g·L⁻¹) treatment on the locomotion behavior of Bursaphelenchus xylophilus

五种植物水提液处理48 h后，松材线虫产卵量和卵孵化率均显著低于对照组（P<0.05），有明显的抑制作用（图3−A）。其中，苦楝处理组的松材线虫产卵率和卵孵化率最低。将五种植物水提液处理后的松材线虫移至长满灰葡萄孢菌的PDA培养基后，油茶、苦楝和马缨丹处理组松材线虫种群繁殖量有着显著的影响（P<0.05），显著低于对照组。其中，苦楝处理组对松材线虫种群繁殖量的抑制作用最明显。

Figure 3.  Effects of five plant water semi-lethal concentration LC₅₀(g·L⁻¹) treatment on the reproductive ability of Bursaphelenchus xylophilus

植物水提法因其高效、简便且经济的特点而被广泛应用于新型植物源药剂的开发。已有研究报道发现部分植物水提液有明显的杀松材线虫活性。束成杰等^[29]通过研究发现，2.5 g·L⁻¹的青花椒（Zanthoxylum schinifolium）水提液能在4 h内完全杀灭松材线虫。Taba等^[30]发现，将白花鬼针草（Bidens pilosa）水提液稀释10倍后用于处理松材线虫，其死亡率可达92.2%。本研究发现，高浓度（40 g·L⁻¹）水提液处理72 h后，马缨丹、油茶、苦楝处理组的校正死亡率均在91%以上，表明这三种植物水提液对松材线虫表现出较强的毒杀活性。

有机溶剂如乙醇、乙酸乙酯和石油醚等，在植物活性成分提取中同样得到了广泛应用^[31]。然而，值得注意的是，一些研究已经表明，与有机溶剂相比，同一植物以水为溶剂时其对松材线虫的毒杀效果表现出更强的效力。例如，秦丹等^[32]研究发现，银杏（Ginkgo biloba）外种皮水提液在200 g·L⁻¹时对松材线虫的杀灭率均比甲醇、乙醇和丙酮的提取物高，在48 h的校正死亡率可达100%。王猛等^[33]研究发现，浓度为1.2 g·L⁻¹的夹竹桃（Nerium oleander）叶片水提液对松材线虫的校正死亡率高达97.1%，高于相同浓度下的乙醇提取物。江奕等^[15]使用乌蔹莓（Causonis japonic）的4种提取物（石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水）对松材线虫毒杀活性进行研究，结果发现，处理72 h时，乌蔹莓水提取物的毒杀活性最强，校正死亡率为100%。焦宏伟等^[34]、江奕等^[15]使用质量浓度为10 g·L⁻¹的苦楝和辣蓼的乙醇提取物处理松材线虫，48 h后苦楝和辣蓼的校正死亡率分别为24.96%和51.84%。相比之下，本研究中相同质量浓度、处理时间的苦楝水提取物对松材线虫的毒杀活性更强，而辣蓼水提液毒杀效果相似。在开发新型植物源杀松材线虫剂的过程中，选择最合适的溶剂以提高其毒杀效果是一个关键步骤。基于现有研究，可以推测，在提取特定植物杀松材线虫活性成分时，水作为溶剂可能具有独特优势。水作为提取溶剂不仅能够有效提取植物活性成分，而且具有良好的环境相容性和安全性，同时成本较低、易于获取，是一个经济实用的选择。综上，植物水提液在防治松材线虫方面将有广阔的应用前景，后续可以深入研究不同植物活性成分在水中的提取效益，进一步优化提取工艺，这对提高杀线虫活性成分的利用效率至关重要。

本研究结果表明，马缨丹对松材线虫展现出强大的灭杀效果，并且能够有效地抑制其活动能力。然而，在影响松材线虫繁殖率方面，马缨丹的作用略弱于苦楝。马缨丹是外来入侵物种，在广西有着广泛的分布。其叶、枝及未成熟的果均有毒，在防虫除虫、污染修复、药用价值等方面有一定的应用价值，以此为杀虫植物提取材料具有很大的可行性。De Sousa等^[35]证实，马缨丹对蜱虫（Ixodoidea）表现出杀灭活性。另外有研究发现，马缨丹的提取物也可抑制腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）的活性^[36]。苦楝不仅是中草药植物，还是常见的生物农药原料，被誉为“天然杀虫剂”，是制作杀虫剂的不错的选择。巨云为等^[24]用苦楝树皮和苦楝果实的乙醇提取物对松材线虫进行生物活性实验时，发现两种提取物对松材线虫皆具很强的致死作用。徐晓莉^[37]通过植物粗提物室内杀线虫活性粗筛，结果表明苦楝的95%乙醇粗提物对松材线虫具有强致死活性，校正死亡率达到85%以上。于金英^[38]从苦楝内生真菌发酵液的乙酸乙酯提取物中分离得到Cytochalasin H，该化合物对松材线虫具有显著的毒杀活性。综上所述，马缨丹和苦楝皆可作为良好的水提液原料，用于开发针对松材线虫的植物源药剂。且苦楝与马缨丹在自然界中资源丰富，获取便利，是良好的杀虫药剂，开发应用前景广阔。后续可将二者水提液结合，探究其是否可对松材线虫起到更好的灭杀效果。

本研究选取的广西五种常见植物的水提液对松材线虫表现出一定程度的毒杀活性，但不同植物之间的毒杀效果存在显著差异。其中，马缨丹和苦楝显示出较好的毒杀效果，是开发松材线虫绿色防控药剂的候选原料。建议进一步优化这两种植物的提取工艺，提高其作为新型绿色防控药剂的应用潜力。