Isolation and identification of 14 Bacillus strains in aquaculture ponds and analysis of their bacteriostatic effect on aquatic pathogens

LB固体培养基（1 L）：1 000 mL纯净水，胰蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，NaCl 10 g，琼脂粉18 g，pH调至7.3～7.5。LB液体培养基（1 L）：1 000 mL纯净水，胰蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，NaCl 10 g， pH7.3～7.5。

从广州市南沙区的3个拟穴青蟹（Scylla paramamosai）养殖池溏采集水样，每个池塘在池塘4个角各采集水样500 mL，共得到12个水样。每个水样取50 mL于50 mL无菌试管，沸水浴15 min；将沸水处理的养殖水样经灭菌生理盐水10倍倍比稀释至10⁻¹、10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶ 等6个梯度；取100 μL稀释水样分别涂布至LB固体平板（每个稀释度做3个平行）；28 ℃静置培养48 h后取出平板观察；挑取表面干燥扁平状的单菌落，LB平板划线纯化2次后用LB液体培养基，28 ℃、200 r·min⁻¹培养过夜，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，利用16S rDNA 通用引物（表1）进行PCR扩增，并进一步测序和Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析鉴定，同时利用MEGA7软件构建系统进化树。对鉴定为芽孢杆菌的菌株进行后续实验。

芽孢杆菌制备：芽孢杆菌于LB平板划线活化，然后挑取单克隆于2 mL LB液体培养基中，28 ℃、摇床（200 r·min⁻¹）培养24 h。指示菌制备：从实验室菌库中挑选出25种共计40株水产病原菌株作为指示菌（表2），水产病原菌株于LB平板划线活化，然后挑取单克隆于2 mL LB 液体培养基中，28 ℃、摇床（200 r·min⁻¹）培养24 h。正方形LB平板制备：12 cm边长的正方形平板用50 mL LB固体培养基配置；取200 μL指示菌涂布平板，晾干后用10 μL枪头倒置钻孔，每个平板14个孔，每孔加入50 μL芽孢杆菌，每株指示菌3个重复，正置28 ℃培养24 h，观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径。

芽孢杆菌上清液制备：将1.3中过夜培养的芽孢杆菌离心2 min (8 000 r·min⁻¹)，取上清液。指示菌制备：选取1株有明显指示效果的菌株挑单克隆于2 mL LB液体培养基中，28 ℃、摇床（200 r·min⁻¹）培养24 h；取200 μL过夜指示菌涂布LB平板，晾干后用10 μL枪头倒置钻孔，每个平板14个孔，每孔加入50 μL芽孢杆菌上清液，每株指示菌3个重复，正置28 ℃培养24 h，观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径。抑菌率=抑菌数量/总指示菌数量×100%。

芽孢杆菌制备：挑取单克隆于2 mL LB 液体培养基中，28 ℃、摇床（200 r·min⁻¹）培养24 h和48 h。指示菌制备：选取1株有明显指示效果的菌株挑单克隆于2 mL LB 液体培养基中，28 ℃、摇床（200 r·min⁻¹）培养24 h；取200 μL过夜指示菌涂布LB平板，晾干后用10 μL枪头倒置钻孔，每个平板14个孔，每孔加入50 μL芽孢杆菌，每株指示菌3个重复，正置28 ℃培养24 h，观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径。

采用SPSS 19.0 软件对不同芽孢杆菌的抑菌率进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，对同一芽孢杆菌24 h全菌液和24 h上清液的抑菌圈直径进行student’s t 检验，对同一芽孢杆菌24 h全菌液和48 h全菌液的抑菌圈直径进行student’s t 检验。P<0.05被认为差异显著。

从养殖水体水样中共分离得到14株芽孢杆菌，经16S rDNA测序以及Blast比对分析（图1）发现，SCS-158、 SCS-163、SCS-165和SCS-166为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；SCS-159和SCS-164为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）；SCS-160、SCS-162和SCS-170为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）； SCS-167为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；SCS-161、SCS-168、SCS-169和SCS-171为其他芽孢杆菌。

从图2可知，SCS-160和SCS-162对40株水产病原菌的抑菌率最高（20%），但SCS-171的抑菌率为0。从表3可知，SCS-160、SCS-162和SCS-170对指示菌中的全部维氏气单胞菌（A. viridis）都有抑制效果，SCS-161可以抑制2株维氏气单胞菌（A. viridis），其余芽孢杆菌则对所测试的维氏气单胞菌（A. viridis）无抑菌效果；SCS-164对所测试的溶藻弧菌（V. alginolyticus）（A32，E36）均有抑制作用，抑菌圈直径分别为（10.67±0.58 ）和（11.33±2.08）mm，SCS-159、SCS-160和SCS-162有仅对溶藻弧菌（V. alginolyticus）E36有抑制作用，抑菌圈直径分别为（9.67±1.53）、（8.67±1.15 ） 和（8.67±1.15）mm，其余没有抑菌效果；SCS-160、SCS-161、SCS-162和SCS-170都表现出对葡萄球菌（Staphylococcus spp.）、异杆菌（Heterobacilli spp.）和不动杆菌（Acinetobacter spp.）的抑制效果，而SCS-167、SCS-168和SCS-169仅对异杆菌（Heterobacilli spp.）有抑制效果；14株芽孢杆菌中有10株对白葡萄球菌有抑制效果，其中，SCS-160和SCS-162的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到23.33 mm，其次为SCS-170，抑菌圈直径为21 mm。

根据前面实验，白葡萄菌的指示效果最好，14株芽孢杆菌中有10株对白葡萄菌有抑制效果，因此选用白葡萄球菌作为指示菌，进行后续实验。如图3所示，SCS-167、SCS-168、SCS-169、SCS-171芽孢杆菌全菌液和上清液都没有抑菌效果；与全菌液相比，芽孢杆菌上清液的抑菌效果有所下降，抑菌圈有所缩小；SCS-160和SCS-162抑菌圈的缩小幅度最大，抑菌圈直径分别减少27.13 %和28.55 %，SCS-159和SCS-164的缩小幅度最小，抑菌圈直径分别减少7.44 %和5.35 %。全菌液和上清液中，SCS-160和SCS-162的抑菌效果最好。SCS-160、SCS-163和SCS-166芽孢杆菌24 h全液的抑菌效果和24 h上清液的抑菌效果差异显著（P<0.05）。

如图4所示，SCS-167、SCS-168、SCS-169、SCS-171芽孢杆菌全菌液在培养24 h和48 h后对白葡萄球菌都没有抑菌效果，SCS-160和SCS-162芽孢杆菌全菌液在培养24 h时，抑菌效果最好，抑菌圈直径均为23.33 mm；培养48 h后，SCS- 160抑菌圈直径较24 h时缩小42.86 %，而SCS-162抑菌效果最好，抑菌圈直径为16.33 mm，较24 h时下降30.00 %；SCS-163芽孢杆菌的抑菌效果在24 h和48 h之间变化幅度最小，为4.19 %。SCS-158、SCS-160、SCS-161、SCS-162和SCS-170芽孢杆菌的24 h和48 h抑菌效果差异显著（P<0.05）。

芽孢杆菌是水产养殖中一种常见的微生物制剂，可以分解养殖过程中残留的各种废物，并抑制病原菌生长^[32]。杨世平等^[33]在研究产酸芽孢杆菌对对虾养殖水环境影响时发现，投入芽孢杆菌可以使水体中弧菌的密度显著降低。张皎皎等^[34]从养殖池塘中筛选出对嗜水气单胞菌（A. hydrophila）有拮抗作用的甲基营养型芽孢杆菌。张维娜^[35]在异育银鲫体外实验中发现，凝结芽孢杆菌（B. coagulans）对温和气单胞菌（A. solutes）和嗜水气单胞菌（A. hydrophila）有抑制作用。单金峰^[15]在养殖水体中添加凝结芽孢杆菌（B. coagulans）使得青虾体内弧菌数量显著下降。本研究从拟穴青蟹（S. paramamosai）养殖池溏水体中分离、鉴定了14株芽孢杆菌，并利用40株水产病原菌作为指示菌，对14株芽孢杆菌的抑菌效果进行初步研究，发现14株芽孢杆菌对水产病原的抑菌率最高为20.00%，其中，芽孢杆菌SCS-160、SCS-162、SCS-170对病原菌中的全部维氏气单胞菌（A. viridis）有抑菌效果。由此可知，芽孢杆菌在水产病害防控中具有广阔的应用前景。

芽孢杆菌可以产生许多具有抑菌活性的物质，例如脂肽抗生素、细菌素、拮抗蛋白、抗菌肽等^[36-39]。但芽孢杆菌进入衰亡期，部分菌体自溶释放的蛋白酶会降解部分抑菌物质，或者发酵液中有害产物积累过多，导致细菌浓度降低，抑菌物质活性降低，抑菌圈直径下降^[40]。这就解释了为什么实验中24 h的抑菌效果会好于48 h的抑菌效果。此外，芽孢杆菌在生长和繁殖过程中产生的挥发性物质对病原菌也具有一定的抑制作用^[41]，这也在一定程度上解释了芽孢杆菌24 h全菌液的抑菌效果要好于48 h。韩旭东等^[42]的研究结果表明，芽孢杆菌ZYCHH-01在发酵时间为27 h时，细菌浓度和抑菌物质活性最高，发酵时间27 h后，细菌浓度和抑菌物质活性持续下降。这些都与本研究的结果相同。但范永瑞^[43]在研究枯草芽孢杆菌抑菌作用时发现，抑菌效果先下降再上升，在24 h时最低。其主要原因可能在于抑菌物质的不同所导致的，这需要进一步研究。

本研究发现，与24 h培养的菌液抑菌效果相比，芽孢杆菌的24 h培养的上清液的抑菌效果有所下降，但不同各芽孢杆菌的抑菌效果不同。芽孢杆菌SCS-160和SCS-162上清液抑菌效果下降最明显，芽孢杆菌SCS-159下降幅度最小。陈成等^[44]在研究枯草芽孢杆菌对桑椹采后致腐微生物的抑菌作用时发现，菌悬液的抑菌效果最好。这可能与其中有效成分有关，因此，可以对菌液中的有效成分进行进一步分析。