Screening and identification of lactic acid bacteria with bacteriostatic activity from Wenchang Chicken in Hainan

试验用海南文昌鸡4只经处死后，采集肠道粘膜及内容物，分别放于不同编号的10 mL试管内，4 ℃保存备用。

MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基和LB肉汤培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。细菌基因组提取试剂盒购自北京全式金生物有限公司。Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×) 购自北京擎科生物科技有限公司。

菌株均由本实验室提供，信息如表1所示，标准菌株于−80 ℃低温保存，保存完好，未被污染。

电子天平（PA2004C，上海佑科仪器仪表有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ.L-75，鸡西市辰丰医疗器械制造有限公司）；恒温培养摇床（FS-70B，黄骅菲斯福实验仪器有限公司）；微波炉（20MX34-L，中山东菱威力电器有限公司）；冰箱（BCD-218STPS，海尔智家股份有限公司）；电热鼓风干燥箱（WGL-230B，黄骅菲斯福实验仪器有限公司）；超净工作台（SW-CJ-2F，苏州净化设备有限公司）；医用低温箱（MDF-U5386S，松下健康医疗器械有限公司）等。

按照试剂盒说明书提取菌株的DNA，保存于−20 ℃备用。

扩增菌株16S rRNA基因序列所用的引物如表2所示。

取1 g肠道内容物，溶入到生理盐水中，摇匀，以10倍为梯度，逐渐稀释到10⁻⁵，取最后2～3个稀释梯度的液体20 μL，利用涂布棒涂到已加入2% CaCO₃的MRS固体培养基上，利用封口膜封口，37 ℃下放置2 d。挑选形态较好且产生钙圈的单菌落置于MRS肉汤培养基中，继续培养16～24 h，将菌液接种到平板上培养2 d，即完成1次纯化。纯化3次之后，获得形态较为一致的菌落。取已培养16～24 h的菌液与50%的灭菌丙三醇等量，加入到2 mL小离心管中进行混合，设置3个重复，做好标记，放超低温冰箱内备用。

观察分离的菌株，挑选在培养基上产生溶钙圈且呈乳白色、凸起、边缘整齐、稍大的单菌落，进行过氧化氢和革兰氏染色鉴定。

在干净的载玻片上滴加2滴10%H₂O₂溶液，从培养的菌板上利用移液枪挑取单菌落置于H₂O₂溶液中。观察是否产生小气泡，出现气泡为阳性，不产生为阴性。保留结果为阴性的菌株，用于革兰氏染色鉴定。

将1.3.2中的不产生气泡的菌按照革兰氏染色试剂盒的说明进行操作，在光学显微镜下观察其特性。紫色为革兰氏阳性，蓝色为阴性。保留阳性菌。

rRNA基因序列鉴定 PCR扩增采用通用引物27F和1 492R，使用Golden Star T6 Super PCR Mix (1.1×)进行PCR扩增，模板选用1.1.5中保存的菌株DNA。具体要求见表3、4。

扩增后配制2%的琼脂糖凝胶进行电泳。PCR产物送至生工生物公司进行测序分析。将16S rRNA基因序列测定的结果上传到NCBI网站，进行BLAST同源性比对，确定菌株种类。

（1）配制固体LB培养基，灭菌并置于60 ℃的水浴锅中进行保温备用。

（2）将乳酸菌的单菌落移入MRS培养基中，于37 ℃培养16～24 h作为种子液。取0.1 mL种子液接种到0.9 mL灭菌的MRS培养液中，在37 ℃培养16～24 h。将标准菌株（大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）接种于LB培养液中进行过夜培养。

（3）待步骤（1）准备的LB琼脂培养基降到50 ℃后分别加入标准菌株作为指示菌。按照0.25%的比率进行添加，混合充分后倒入已安放好4个牛津杯的一次性培养皿中，每个皿加入14 mL培养基。20 min后，将牛津杯取出，4个孔各自注入不同的乳酸菌上清液100 μL。乳酸菌上清液加入后，常温放置2～3 h，待液面下降到培养皿皿底后，移到培养箱中培养。

（4）24 h后，利用千分尺测量抑菌圈的直径，记录数据。

（1）将MRS液体培养基配置好，使用稀盐酸和氢氧化钠溶液调节pH到2.5。

（2）将初步抑菌试验获得的菌株接种到培养液中，于37 ℃培养12～24 h。

（3）将已培养好的菌液涡旋40 s，以10为倍数进行梯度稀释（0.1 mL菌液加入到0.9 mL 0.9%氯化钠溶液中），逐步稀释到10⁻⁶，取100 μL菌液进行涂布，做3次重复试验，涂好的培养皿用封口膜进行封口，培养36～48 h。

（4）取100 μL上述的菌液接种到900 μL pH 2.5的培养液中，培养2 h后取出。

（5）2 h后取出，以10为梯度进行稀释，逐渐稀释到10⁻⁶，取100 μL涂板。同样，每个菌重复3次以上操作，用于对照。

（6）培养36～48 h后，统计菌落的数量。

试验方法同1.3.6。将pH 2.5的MRS溶液替换为0.25%的PBS胆盐溶液进行试验，同样设置3个重复。

通过MRS琼脂培养基培养，进行分离纯化获得了可以产生溶钙圈、形态为圆形、边缘整齐、呈乳白色等的单菌落。经过氧化氢阴性和革兰氏染色阳性鉴定，共筛选到17株菌株，其鉴定结果见表5。

提取经初筛获得的17株乳酸菌的基因组DNA,利用通用引物扩增其16S rRNA基因序列。经测序后，在NCBI上进行BLAST同源性比对，结果如表6。表6显示本实验筛选的17株菌的相似度均达到97%及以上，其中，13株菌为植物乳杆菌，4株菌为粪肠球菌。

如表7所示，这些菌株对标准菌株的抑菌圈直径之和均在41～45 mm之间，抑菌效果接近，其中编号为S4-1的菌株抑菌圈直径之和最大，为44.3 mm。

由图1可得，筛选所获得的13株植物乳杆菌对3种病原菌均有抑制作用，抑菌圈直径接近14 mm，为中度敏感^[11]的类型。不同植物乳杆菌对不同病原菌的抑菌效果存在一定的差异，其中植物乳杆菌S4-1对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径超过15 mm。

乳酸菌在pH 2.5 的培养液中培养2 h的存活率如图2所示。植物乳杆菌K1-6的耐酸性能最好。不同的菌株存活率差异较大，植物乳杆菌均有一定的耐pH的特性。

乳酸菌在胆盐浓度为0.25%的情况下保持2 h的存活率，如图3所示。S4-5和H3-6的乳酸菌存活率较高，K3-7的菌株存活率较低，不同菌株间的差异较大。

海南岛地处热带，具有高温高湿的环境。这种炎热潮湿的气候一方面利于细菌的滋生，影响动物的健康养殖；另一方面高温高湿环境会影响动物肠道微生物的组成^[12-13]，影响益生菌功效的发挥。目前针对热带地区益生菌筛选鉴定的研究较少，因此本研究选择海南文昌鸡的肠道内容物，通过16S rRNA基因序列测序、耐受试验和抑菌试验等一系列体外评价，筛选出在当地环境下抑菌效果较好的乳酸菌株，为开发热带畜禽养殖乳酸菌制剂提供材料。

目前研究表明，乳酸菌在畜禽肠道中，能够形成一层菌膜，帮助机体抵抗病原菌的侵袭，提高畜禽的抵抗力。养殖环境中存在的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌是引起畜禽肠道疾病的主要病原菌^[11]。因此在本试验中选择了这3种菌作为评价益生菌体外抑菌能力强弱的指示菌。试验的结果也表明文昌鸡肠道源的多株植物乳杆菌对这3株病原菌均具有抑菌活性。这符合前人大量关于乳酸菌抑菌的理论研究的结论，如乳酸菌会释放一些有机酸、细菌素等小分子物质，这些物质具有一定的抑菌能力^[14]。本试验中筛选到植物乳杆菌S4-1对大肠杆菌、 鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌效果，其对金黄色葡萄球菌的抑菌能力最强，具有开发为饲用乳酸菌的潜力。

拥有良好抑菌特性的外源乳酸菌要在畜禽肠道内发挥其生物学效应，还必须保证其能通过畜禽的胃进入肠道。畜禽的胃中具有低的pH环境，因此益生菌必须具有较高的酸耐受性^[5]。而不同的菌株耐受低pH值的能力也不同，因此本试验对初步筛选的益生菌也进行了酸耐受性的试验。此外，畜禽肠道中具有较高浓度的胆汁，胆汁对细菌有较强的破坏能力,胆盐对乳酸菌的细胞膜具有溶解性，导致乳酸菌的死亡^[15]。因此为了保证较多数的活菌能在肠道中生长和繁殖，发挥其生物学效应，必须筛选出对胆盐具有一定耐受力的乳酸菌。因此本研究在体外也评价了益生菌的胆盐耐受性。结果表明，植物乳杆菌S4-1具有较高的酸耐受性和一定的胆盐耐受性，综合抑菌效果最好。笔者认为该菌具有作为热带及其他地区畜禽饲用乳酸菌的潜力。

不同来源的益生菌具有不同的温度适应性，谢曈^[16]等通过对10种益生菌研究发现其耐高温能力存在差异。菌株的高温耐受性有助于其在畜禽肠道生长和后期工业应用，也是优良益生菌的特性之一。相较于其他地区的乳酸菌，本实验所筛选出的植物乳杆菌S4-1来源热带地区，在耐高温方面具有先天优势。此外，前人研究表明，在鸡和猪的日粮中添加乳酸菌，均能有效改善肠道菌群结构，降低肠道中大肠杆菌数量^[17-18]。但本实验尚未进行动物体内实验，植物乳杆菌S4-1对机体的影响有待进一步验证。