Cloning and analysis of sodium channel of Megalurothrips usitatus

豆大蓟马于2018年12月采自海南省海口市美兰区海南大学海甸校区基地，并在实验室内长期饲养，期间未施用任何药剂。饲养方法如下：将豆大蓟马成虫及若虫转移至240 mL养虫罐中，将新鲜豇豆洗净，切成长度约5 cm的豆荚放入20%蜂蜜水中浸泡1 min，晾干，放入养虫罐中，置于人工气候箱（PYX-400Q-A，广东韶关科力实验仪器有限公司）中饲养。成若虫的饲养温度为26 ℃，湿度为60 %～65 %，光周期16 L∶8 D。

取豆大蓟马成虫30～40头，通过Trizol法提取RNA，并用1 %的琼脂糖进行凝胶电泳。随后进行反转录，方法参照Prime ScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（东洋纺生物科技有限公司，上海）说明书。根据NCBI西花蓟马（Frankliniella occidentalis）（XM_026422864.1）和棕榈蓟马（Thrips palmi）（XM_034385472.1）Na_v序列，使用Primer 5软件对MuNa_v进行通用引物设计，正向引物为：ATGCCGAGTGTCCGGGAGTCG，反向引物为：TCAGACATCCGCAAGGGCCGGAG。以上述cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：cDNA 1 μL、dNTP Mix 1 μL、上下游引物各2 μL、ddH₂O 18 μL、2×Phanta Max Buffer (Mg²⁺plus) 25 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Ploymerase 1 μL。PCR反应条件如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃延伸6.5 min，共35个循环；72 ℃反应后延伸8 min。

用Cycle-Pure Kit（OMEGA, America）将上述PCR产物进行纯化回收，用NanoDrop 2000分光光度计（赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海，中国）对回收产物进行浓度测定，并置于−20 ℃备用。分别用HindⅢ-HF和X maⅠ对PGH 19进行双酶切，反应时间为2 h，温度为37 ℃，将纯化回收产物和PGH 19链接，反应条件为：37 ℃、45 min，取出后在冰上冷却5 min，将连接好的产物导入感受态细胞stbl 2中并涂板，方法参照stbl 2感受态细胞（吐露港生物科技有限公司，上海）说明书，将平板倒置在22 ℃的保温箱中培养。在96孔板每孔中加入200 μL LA培养基，并挑取单克隆置于其中，密封后180 r·min⁻¹，30 ℃摇菌12 h。取50 μL菌液加入5 mL LA培养基中于30 ℃、180 r·min⁻¹ 2次摇菌16 h，使用Plasmid mini Kit（OMEGA, America）试剂盒进行质粒提取，并进行测序。

克隆得到MuNa_v全长，并上传至NCBI（GenBank accession number: MZ043856），用Simple Modular Architecture Research Tool预测其保守性结构域。同时，从NCBI上下载得到其他58种昆虫的Na_v全长（表1）。随后，用Clustal Omega软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行多序列比对，并利用Mega 7 (DNASTAR, America)软件，采用最大似然法构建系统发育树，自举值设置为1 000。

克隆得到MuNa_v，其全长为6279 bp，编码2093 aa (GenBank：MZ043856) （图1），含有4个同源结构域，结构域 Ⅰ~Ⅳ，每个同源结构域含有6个跨膜片段，第3和第4结构域之间含有“MFM”疏水性残基，符合昆虫Na_v的典型特征（图2）。

将MuNa_v的氨基酸序列与西花蓟马、棕榈蓟马、绿盲蝽（Apolygus lucorum）、美洲大蠊（Periplaneta americana）Na_v进行同源性比对，发现其与棕榈蓟马Na_v序列的相似度高达94.88%，与西花蓟马Na_v序列的相似度同样高达94.68%，而与美洲大蠊和绿盲蝽Na_v的相似度分别仅为80.74%和80.19%，表明豆大蓟马与蓟马类昆虫的亲缘关系较近，而与其他目昆虫则发生了分化(图3)。

进化树的结果表明（图4），MuNa_v与其他昆虫均存在一定的亲缘关系。其中，豆大蓟马与棕榈蓟马（T. palmi）、烟蓟马（Thrips tabaci） 和西花蓟马聚为一类，显示蓟马类昆虫Na_v符合进化过程，即同一类昆虫聚类在相近位置。反之，豆大蓟马与其他目的昆虫，如黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、德国小蠊（Blattella germanica）、绿盲蝽等则发生了较大程度的分化，亲缘关系相对较远。

大部分昆虫仅编码1条或2条Na_v，昆虫Na_v由1个分子量约为260 kD的α亚基和5个辅助小亚基组成，α亚基具有Na_v活性，而辅助小亚基则起到调节Na_v表达的作用。本研究通过PCR的方法克隆得到了MuNa_v全长序列，发现其与其他昆虫Na_v结构类似，有4个同源性极高的跨膜结构域，即结构域I、结构域II、结构域III和结构域IV组成，且每个结构域均包含6个疏水性跨膜螺旋体（S1～S6）。在MuNa_v的P-LOOP环上同样鉴定到与其他昆虫类似的4个保守性氨基酸残基D、 E、 K、A和1个关键失活阀门MFM，这些结果均表明，MuNa_v具有昆虫Na_v特有的全部结构特征，这为后续MuNa_v功能研究奠定了基础。

本研究的序列比对结果表明，豆大蓟马与其他目昆虫，如蜚蠊目美洲大蠊和半翅目绿盲蝽Na_v的序列相似性均高达80%以上，这为MuNa_v功能研究提供了重要参考。值得一提的是，豆大蓟马与其他蓟马类昆虫序列的相似性极高，如西花蓟马和棕榈蓟马的序列相似性高达94%以上，表明缨翅目蓟马类昆虫Na_v的结构与功能极为保守。另外，基于NCBI上获取得到的59种昆虫Na_v序列，构建了系统发育树。与上述序列比对结果类似，进化树结果表明虽然昆虫Na_v具有一定的保守性，但豆大蓟马与其他蓟马类昆虫聚为一类，表明且它们在进化过程中极为保守，即发生的变异较小，而与其他昆虫则形成了不同的分支，表明它们发生了一定程度的分化。

昆虫Na_v可通过转录后修饰，即选择性剪切和RNA编辑实现其功能的多样性^[17-18]。RNA编辑是mRNA在转录水平上通过碱基插入、缺失或替换，从而引起氨基酸改变，扩大了生物的遗传信息，增加Na_v结构与功能的多样性，从而帮助其迅速适应外界环境的变化，其研究在过去的几年里逐渐得到重视^[17,19-20]。昆虫Na_v RNA编辑存在2种形式：一种是腺苷A去氨基转变为次黄嘌呤I，即A至I编辑，另外一种是U至C编辑。其中A至I的RNA编辑在昆虫中尤为常见，可导致蛋白质的结构和功能发生改变。如在黑腹果蝇、德国小蠊和绿盲蝽中均被鉴定到，并可引起昆虫神经性兴奋^[21-23]。昆虫RNA编辑存在组织特异性，A-I RNA编辑主要发生在编码离子通道、神经递质受体或G蛋白偶联受体的神经系统基因转录本中^[24-25]。例如，在黑腹果蝇钠通道转录本中发现了11个A-I编辑^[26]，在拟果蝇中发现了3个A-I的RNA编辑，分别是Q52R、C189Y和N1260D^[27]，而在德国小蠊和绿盲蝽Na_v中也分别发现了2个和1个A-I RNA编辑^[21,23]。此外，昆虫Na_v还存在U-C编辑，该类型的RNA编辑一般存在卵巢和肠道中，如黑腹果蝇和德国小蠊体内F¹⁹¹⁹S位点的U-C编辑可产生持续电流^[20]。

近年来，随着田间用药量的增加，昆虫对拟除虫菊酯的抗药性不断增加，Na_v突变也越来越频繁，在很多高抗药性种群中发现多个突变位点。大部分昆虫中最常见的突变发生在 1 014位点，该位点在家蝇中最早被发现，由L突变为F，使家蝇对氯菊酯的敏感性降低了至少10倍，并且增加了拟除虫菊酯诱导的钠尾电流的衰减率^[28]。除了家蝇外，在冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）、人蚤（Pulex irritans）、中华按蚊（Anopheles sinensis）、致倦库蚊Culex quinquefasciatus）等昆虫中也发现了L1014突变^[29-32]。除了1 014位点外，918位点氨基酸发生改变也会影响拟除虫菊酯药剂的敏感性。1999年，LEE等^[33]对家蝇钠通道918位点进行定点修饰，用苏氨酸代替甲硫氨酸，通过双电极电压钳进行验证，发现其对高浓度的氯氰菊酯完全不敏感。在白纹伊蚊体内发现了I1532T和F1534S/L，当这2个突变单独出现时显著降低了对I型拟除虫菊酯类药剂氯菊酯和联苯菊酯的敏感性，但是对Ⅱ型拟除虫菊酯类药剂敏感性没有显著影响^[34]。本研究未在MuNa_v中发现918和1 014位点突变，但在对序列分析时发现了T929I突变，其在对拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性过程中的具体作用还需进一步实验探究。

在高抗种群中，突变点往往都不是单个出现的，它们会同时出现2个突变点，大部分情况下该类型突往往比单点突变更高的抗药性。在蚊子中，Na_v中单独的N1575Y突变不会改变昆虫对拟除虫菊的敏感性，但N1575Y和L1014F双突变的种群对氯氰菊酯的抗性是野生型的80倍，对溴氰菊酯的抗性是野生型的53倍，相较于单突变分别增加了3.4倍和9.8倍^[35]。在烟蓟马中，T929I的单突变会导致烟蓟马对氯氰菊酯产生中等水平抗性，当T929I和K1774N双突变共同出现会导致烟蓟马对氯氰菊酯产生高等水平抗性（RR=2 700）^[36]。反之，某些Na_v双突变时，并不会降低钠通道的抗性，例如在埃及伊蚊体内，无论是V1023G/S996P还是V1023G/D1794Y对拟除虫菊酯的抗性都没有单一突变体高^[37]。此外，有些位点单独突变不会改变钠通道的敏感性，但会显著降低其他位点对拟除虫菊酯杀虫剂的敏感性。例如，蟑螂体内E434K和C764R单独出现不会改变钠通道对溴氰菊酯的敏感性，但是E434K或C764R与L993F双突变时钠通道对溴氰菊酯的敏感性会降低100倍^[38]。除单突变，双突变外，昆虫钠通道有时还会出现三突变，例如在蟑螂Na_v中引入V409M突变，可使其对溴氰菊酯的敏感性降低了10倍，而当V409M、E434K、C764R 3个突变同时出现时，蟑螂对溴氰菊酯的敏感性降低了100倍^[39]。除上述突变类型，昆虫体内Na_v突变还会出现连锁反应，在致倦库蚊中，M943V和I973T就存在着明显的连锁反应，但是其生理意义还需进一步探索^[40]。虽然在MuNa_v中未发现918和1 014位点突变，但豆大蓟马钠离子通道出现众多潜在的抗性位点（未发表），仍需用双电极电压钳技术进一步验证。

本研究克隆了豆大蓟马钠离子通道全长序列，不仅扩展了昆虫钠离子通道的遗传信息，也为后续豆大蓟马抗性位点的鉴定，kdr抗性突变位点分子诊断技术的研发和探明化学杀虫剂与MuNa_v的结合能力奠定了基础，同时为延缓豆大蓟马抗药性的发展及抗药性治理指明了方向。