Preparation and Functional Study of β4 Subunit Double-point Mutant of α6/α3β4 Nicotinic Acetylcholine Receptors

雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）购自美国Nasco公司，在实验室饲养1个月以上。饲养用水经过滤、沉淀处理，饲养温度17 ℃。载有大鼠α6/α3、β4 nAChRs亚基基因的质粒来自美国犹他大学。由于α6亚基表达困难，故使用α6/α3嵌合体亚基替代（α6亚基的胞外配体结合域替换α3亚基的对应区域产生的嵌合体，其胞外结合域的结构和功能与α6亚基相同，且对配体的结合活性研究无影响）^[18-19]，利用该嵌合体构建的α6/α3β4 nAChR能正常表达。

质粒提取试剂盒（FastPure Plasmid Mini Kit）购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DNA纯化试剂盒(MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver. 4.0)、DL 15000 Marker、限制性内切酶Nhe I、Dpn I、Q5超保真聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA体外转录试剂盒（mMESSAGE-mMACHINE® T7 Transcription Kit)、RNA 纯化试剂盒（MEGAclear^TMTranscription Clean-Up Kit）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；DNA marker Ⅳ购自天根生化科技（北京）有限公司；HEPES购自生工生物工程（上海）有限公司；乙酰胆碱（acetylcholine，ACh)、阿托品（Atropine)、胶原蛋白酶 (Collagenase)均购自美国 Sigma-Aldrich 公司；其他生化试剂均为国产分析纯。OR2溶液(NaCl、KCl、MgCl₂和 HEPES分别为82.5、2.0、l.0、5 mmol·L⁻¹，pH7.5)；ND-96溶液（NaCl、KC1、MgCl₂、CaCl₂和 HEPES分别为96、2.0、1.0、1.8、5 mmol·L⁻¹，pH7.5)。引物的合成和基因序列的测定由生工生物工程（上海）有限公司完成。

超微量分光光度计（Nanodrop 2000，美国Thermo Fisher Scientific公司）；PCR仪（Mastercycler X50s，德国Eppendorf)；小型水平电泳仪（美国 Bio-Rad)；Alpha-2200凝胶成像分析系统（美国 ProteinSimple)；Drummond微量注射器（Drummond Scientific，Broomall，PA）；KCL-2000A恒温恒湿培养箱（日本EYELA)；双电极电压钳放大器AxoClamp 900A，数模转换器Axon Digidata1550B(美国 Molecular Devices)。

对比大鼠与人类β4亚基的胞外配体结合域序列，确定3处双突变位点（图1中红色方框圈出的位置）。利用PCR介导的受体定点诱变方法，分别将这3处位点的氨基酸编码序列由大鼠β4亚基替换为人类β4亚基。

使用Primer Premier 5.0软件完成突变位点引物的设计，使正反向引物都携带有突变位点且位于中部，引物长度在25～45 bp之间，保证GC含量大于40%，Tm值大于70 ℃（表1）。

将载有大鼠β4亚基DNA序列的质粒作为模板，与诱导突变引物和Q5超保真聚合酶体系按比例混合，采用PCR方法进行定点诱变（图2）。PCR条件如下：50 μL体系，95 ℃预变性120 s；随后95 ℃变性20 s，60 ℃退火10 s，68 ℃延伸阶段3 min，共循环18次；最后68 ℃延伸5 min。PCR反应完成后，在水浴条件下，在PCR产物中加入1 μL Dpn I，37 ℃反应1 h，水解质粒模板。取少量PCR扩增产物在1.0 %琼脂糖凝胶中90 V电压下电泳20 min，观察电泳结果，验证PCR反应成功。取PCR产物3 μL转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，将菌液涂布于含有氨苄青霉素的固体平板培养基上，37 ℃下培养14～18 h。每个平板分别挑取5个菌落，转入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、250 r·min⁻¹ 培养12～14 h，提质粒后用Nanodrop测定其浓度，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳（条件同上）判断其纯度，测序验证插入序列突变情况。

Figure 2.  Strategy for site-directed mutagenesis

选取测序正确的突变体质粒进行酶切线性化反应。200 μL酶切反应体系如下：突变体质粒20 μg（40～60 μL），限制性内切酶Nhe Ⅰ 10 μL，10×M Buffer 20 μL，剩余体积用ddH₂O 补齐，37 ℃反应4 h。酶切后使用DNA纯化试剂盒回收线性化产物。回收的线性质粒使用Nanodrop测定其浓度，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳判断其纯度。

将线性突变体质粒作为模版，使用试剂盒法进行体外转录。20 μL反应体系如下：线性模版2 μg（5～6 μL）；2×NTP/CAP 10 μL；10×Rxn Buffer 2 μL；Enzyme Mix 2 μL；剩余体积用无RNA酶的ddH₂O 补齐，37 ℃反应 4～6 h。随后在反应液中加入1 μL Dnase，反应30 min，酶解DNA模版。使用RNA纯化试剂盒回收cRNA产物，Nanodrop测定其浓度，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳验证。

选取状态良好的成熟雌性非洲爪蟾，冰冻麻醉1 h，用手术刀在腹侧剖开小口，取出卵母细胞团块。剪碎团块，使用OR2溶液清洗至澄清。将卵母细胞转移至含有0.5 g·L⁻¹ 胶原蛋白酶的OR2溶液中酶解，室温下反应40～50 min，使其完全分离成为互不粘连的单个细胞，再用OR2溶液清洗至少10次后，挑选形态正常饱满的卵母细胞转入含抗ND-96溶液中，在17 ℃、湿度35%的条件下继续培养。

卵母细胞在获取24 h后用于显微注射，实验方法参考熊洋等^[20]对α6/α3β4表达研究的优化结果，将野生型或突变型α6/α3与β4 nAChRs亚基的cRNA以1∶1的比例混合，每个亚基的终浓度≥500 ng·μL⁻¹。将混合后的RNA以每个59.8 nL的体积显微注射入非洲爪蟾卵母细胞，在17 ℃、湿度35%条件下继续培养（图3）。

Figure 3.  Female Xenopus laevis and oocytes

显微注射后2～5 d 使用双电极电压钳检测卵母细胞上受体的表达情况。设置钳制电压为−70 mV，灌流速度2～4 mL·min⁻¹，记录ACh刺激细胞产生内向电流的情况。详细过程如下：每个循环总时长60 s，首先给予2 s Ach脉冲刺激，随后使用含有0.1 g·L⁻¹ BSA的ND-96缓冲液灌流冲洗，每个记录程序含3次循环。数据记录软件为pClamp 11.0.3，采样模式为Episodic stimulation，采样频率为Slow 200 Hz。

使用不同浓度的ACh作为激动剂（1、10、50、100、250、500 μmol·L⁻¹ 和1 mmol·L⁻¹）刺激受体通道开放，检测并记录产生的内向电流值。以1 mmol·L⁻¹ ACh 刺激产生的内向电流作为基准，计算其他浓度的ACh（1～500 μmol·L⁻¹）刺激通道开放的反应率。每组实验数据至少在不同卵母细胞上重复3～6次。所得数据导入GraphPad Prism 6.0 软件使用非线性拟合方程：Response%=100/{1+(EC₅₀/[agonist])^nH}。式中Response代表反应率，agonist代表激动剂的内向电流值，nH代表Hill系数，分析拟合并作图。

琼脂糖凝胶电泳结果表明，经PCR后，3种突变体基因均有条带产生（图4-A胶孔3、4、5），与线性质粒模板（图4-A胶孔2）的位置一致，可以将PCR产物用于转化实验。

Figure 4.  Agarose electrophoresis of PCR site-directed mutation products, linear mutant plasmid after digestion and cRNA

使用质粒提取试剂盒提取突变质粒，所得结果经超微量分光光度计测得浓度（表2）。琼脂糖凝胶电泳结果验证质粒纯度良好。插入基因测序结果使用NCBI网站中的BLAST在线序列比对验证，证实3个突变体质粒均构建成功。将测序正确的β4突变体质粒与本体质粒分别进行酶切反应，琼脂糖凝胶电泳验证。环状质粒（图4-B胶孔1、3、5、7）因呈超螺旋结构，在琼脂糖凝胶中空间位阻小，所以移动更快。而线性化的质粒（图4-B胶孔2、4、6）移动较慢。电泳结果中线性化质粒对应泳道在环状质粒对应位置已无条带，证明酶切完全。经超微量分光光度计测得浓度与A_260/280值（表2），均在正常范围内，可进行后续实验。

测定体外转录获得的cRNA浓度（表3），均达到500 mg·µL⁻¹。琼脂糖凝胶结果显示，图4-C中胶孔1、2、3相同高度均有对应的较为清晰明亮的条带，证明体外转录成功，可用于下一步卵母细胞显微注射。

使用双电极电压钳对野生型和3种突变型受体的功能进行检测。α6/α3β4[S52N, I53V]突变型的受体与其他几种相比，表达时间略有提前，在注射后的第3天即达到正常水平。另外2种突变型与野生型的受体表达时间无明显的差异，均在第4天达到正常水平。结果表明，ACh浓度为1 μmol·L⁻¹时均无电流产生，未达到产生内向电流的最小刺激强度。随着ACh浓度的增大，受体接受ACh刺激产生的电流值也随之增大，呈现出先快后慢的变化趋势。对比图5中A、B、C、D的电流轨迹图，突变受体与野生型对ACh的敏感程度相当，可以初步判断，突变并未影响受体的基本结构及功能。当给予相同浓度ACh刺激时，突变型α6/α3β4[S52N, I53V] nAChR相比于野生型和其他的突变型，电流值明显更大，推测是α6/α3β4[S52N, I53V] nAChR离子通道的开放水平更高。

Figure 5.  Current traces of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR evoked by different concentrations of ACh

使用Graphpad Prism 6.0软件对测定结果进行分析，绘制浓度−反应率曲线图，并计算受体对ACh刺激的EC₅₀。对比图6中A、B、C图中的曲线，结果表明，野生型与突变型受体的变化趋势相似。野生型α6/α3β4 nAChR 的EC₅₀是突变型α6/α3β4[S52N, I53V] nAChR的2倍（表4），证明52、53位双点突变，对ACh的激动活性有一定的提升，使α6/α3β4 nAChR与ACh结合后离子通道的开放程度增加。

Figure 6.  Concentration response curve of wild-type and mutant α6/α3β4 nAChR to the agonist ACh Mean ± SEM, n=3～6.

α6β4*作为一类特殊的nAChRs受到广泛关注，但含α6亚基nAChRs的异源表达却十分困难。烟碱型乙酰胆碱受体与配体结合的主要结构位于细胞膜外的N-端结合域，通过基因改造，构建α6/α3的嵌合体可以辅助受体正常表达，不影响受体的功能活性。

本研究比较了人类和大鼠的α6和β4两种亚基的胞外N-端结合域的序列，发现人类和大鼠α6亚基的同源性较高，而β4亚基的种属差异性更大。芋螺毒素是一类作用于nAChRs的小分子多肽，可以作为分子探针，研究配体与受体结合的关键位点。HONE等进行了人类（Human）和大鼠（Rat）α6/α3和β4亚基的混合表达实验，构建了Hα6/α3Hβ4、Rα6/α3Rβ4、Hα6/α3Rβ4和Rα6/α3Hβ4这4种受体，并选取3种作用于α6/α3β4 nAChR的芋螺毒素PeIA、PnIA和TxIB作为拮抗剂，分别比较配体对突变受体的阻断作用。结果显示，这3种芋螺毒素对受体的阻断作用具有一致性，由强到弱依次为Hα6/α3Hβ4> Rα6/α3Hβ4> Hα6/α3Rβ4> Rα6/α3Rβ4。该实验从一定程度上说明β4亚基对α6/α3β4 nAChR的配体识别和选择具有重要作用^[21]。

本实验利用受体定点突变技术对大鼠β4亚基非保守残基进行受体突变，将其替换人类β4亚基相同位置处的残基，对比序列发现有3处位点均为相邻2个残基的差异。将2个差异位点均设计在突变引物内，经一次突变即得到具有相邻2个残基差异的突变受体，大大缩短了突变体构建的时间，并且为后续大鼠和人类α6/α3β4 nAChR对芋螺毒素活性差异关键位点的筛选，构建了3个双点突变体模型。

在对突变体进行电生理活性检测中，电流值的大小和变化趋势与野生型受体均相似，表明受体基本的结构和功能保持不变。而观察ACh浓度-反应率曲线图，其中1种突变体α6/α3β4[S52N, I53V]相比于野生型，对ACh敏感性更高，EC₅₀值仅为本体的一半。并且在标准浓度(100 μmol·L⁻¹)ACh下，突变体α6/α3β4[S52N, I53V]产生的激发电流值更大。推测可能是由于52位由丝氨酸变为天冬酰胺后更易形成氢键，而53位由异亮氨酸到缬氨酸的改变，导致其空间位阻减小，使得在与ACh结合时，通道的敏感性增加，且开放程度增大。由于在β4亚基上人类和大鼠还存在其他差异位点，因此，α6/α3β4 nAChR对于激动剂ACh和拮抗剂芋螺毒素活性的关键氨基酸位点还有待研究。