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气单胞菌（Aeromonas）属于革兰氏阴性菌，主要存在于各种水生环境中，分为致病菌株和非致病菌株，致病菌株可感染两栖类、鱼类、鸟类、哺乳类、爬行类等动物，常引起水产养殖动物的细菌性败血症[1]，导致养殖的动物大量死亡，对水产养殖产业造成严重的危害。此外，气单胞菌还可引起人类的败血症、胃肠炎、伤口感染、腹腔感染、呼吸道感染等疾病[2-3]，引发严重的公共健康问题。因此，探讨鳄鱼源气单胞菌毒力基因携带和耐药特性的关系，对其致病机制的理解，控制气单胞菌对鳄鱼养殖的危害有着重要的意义。自2016年以来，海南陵水、文昌等地多家鳄鱼养殖场发生了多起暹罗鳄死亡事件，研究人员己从发病鳄鱼体内分离到多株气单胞菌[4-6]。笔者对10株临床分离到的鳄鱼源气单胞菌菌株进行了相关的毒力基因和耐药基因的检测以及抗生素药物敏感性测定，旨在了解鳄鱼中气单胞菌毒力基因携带和耐药特性，为探讨鳄鱼源气单胞菌的致病机制，以及在鳄鱼养殖中该病的有效防治提供科学依据。
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酵母提取物，蛋白胨来自英国OXOID公司；抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒（Bacterial DNA Isolation Kit）购自北京华越洋生物科技有限公司；2×F8 Fast Long PCR Master mix为北京艾德莱生物科技有限公司产品；DNA 5000 Marker和DNA 2000 Marker来自广州东盛生物科技有限公司；琼脂糖凝胶为法国Biowest公司产品。
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病料样品来自于2016—2018年间海南文昌、陵水地区鳄鱼养殖场的18月龄以内的患病暹罗鳄鱼，经过分离培养、生理生化及分子生物学鉴定，获得了10株气单胞菌临床菌株，其中，包括5株嗜水气单胞菌，3株达卡气单胞菌，1株简达气单胞菌和1株维氏气单胞菌。
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分别挑取10株气单胞菌单菌落于LB液体培养基中在30 ℃下培养16 h，然后按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明分别对10株气单胞菌的基因组进行提取，通过Nanophotometer仪器测定其浓度和纯度，然后保存于−20 ℃冰箱中。
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以分离得到的10株气单胞菌的基因组为模板，利用毒力基因检测引物（表1）分别进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，47.4～55.4 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 终延伸10 min。9种毒力基因分别为：Ⅲ型分泌系统内膜组分基因（Type Ⅲ secretion system inner membrane component, ascV）、ADP−核糖基化毒素基因（ADP-ribosylating toxin, aexT）、胞外毒力因子气溶素基因（Aerolysin, aer）、细胞兴奋性肠毒素基因（Excitatory enterotoxin, alt）、细胞毒性肠毒素基因（Cytotoxic enterotoxin, act）、热稳定肠毒素基因（Heat stable enterotoxin, ast）、磷脂酶基因（Lipase, lip）、弹性蛋白酶基因（Elastase, ela）、鞭毛蛋白基因（Flagella, fla）。
基因
Gene序列（5′−3′）
Sequence（5′−3′）长度/bp
Length退火温度/℃
Annealing temperature参考文献
ReferencesascV CTCGAACTGGAAGAGCAGAATG 577 52.2 [7] GAACATCTGGCTCTCCTTCTCGATG aexT ATGCAGATTCAAGCAAACAC 226 47.4 [7] TTGCCGATCCACTCTTTGAT aer CCTATGGCCTGAGCGAGAAG 430 54.7 [8] CCAGTTCCAGTCCCACCACT act AGAAGGTGACCACCAAGAACA 232 52.3 [9] AACTGACATCGGCCTTGAACTC ast TCTCCATGCTTCCCTTCCACT 331 52.5 [9] GTGTAGGGATTGAAGAAGCCG alt TGACCCAGTCCTGGCACGGC 442 55.4 [9] GGTGATCGATCACCACCAGC lip ATCTTCTCCGACTGGTTCGG 382 53.3 [9] CCGTGCCAGGACTGGGTCTT ela ACACGGTCAAGGAGATCAAC 513 51.0 [9] CGCTGGTGTTGGCCAGCAGG fla TCCAACCGTYTGACCTC 608 50.0 [9] GMYTGGTTGCGRATGGT 注：其中fla基因引物中的Y, M, R代表简并碱基，Y=C/T，M=A/C，R=A/G。
Note: Y, M and R in the fla gene primer represent degenerate bases; Y=C/T, M=A/C, R=A/G.Table 1. Primers of Aeromonas virulence genes
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以分离得到的10株气单胞菌的基因组为模板，利用表2中的耐药基因检测引物分别进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，40.0～59.7 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。9种耐药基因包括：喹诺酮类药物耐药基因qnrA、qnrS；四环素类药物耐药基因tetA、tetC；氨基糖苷类药物耐药基因ant3、strA；磺胺类药物耐药基因sul1；β−内酰胺类药物耐药基因tem、ctxM。
基因
Gene序列（5′−3′）
Sequence（5′−3′）长度/bp
Length退火温度/℃
Annealing temperature参考文献
ReferencesqnrA ATTTCTCACGCCAGGATTTG 519 49.4 [10] GATCGGCAAAGGTCAGGTCA qnrS ACGACATTCGTCAACTGCAA 417 51.0 [10] TAAATTGGCACCCTGTAGGC tetA GTAATTCTGAGCACTGTCGC 956 50.2 [10] CTGCCTGGACAACATTGCTT tetC TCTAACAATGCGCTCATCGT 588 50.5 [10] GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC ant3 GTGGATGGCGGCCTGAAGCC 526 58.7 [10] ATTGCCCAGTCGGCAGCG sul1 CGGCGTGGGCTACCTGAACG 433 59.1 [10] GCCGATCGCGTGAAGTTCCG Tem AAAGATGCTGAAGATCA 425 45.0 [10] TTTGGTATGGCTTCATTC ctxM GTGCAGTACCAGTAAAGTTATGG 538 49.4 [10] CGCAATATCATTGGTGGTGCC strA TTGAATCGAACTAATAT 1640 40.0 [10] CTAGTATGACGTCTGTCG Table 2. Primers of antibiotic-resistant genes of Aeromonas
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利用纸片扩散法（Kirby-Bauer法）进行气单胞菌的抗生素药物敏感性测定，通过产生的抑菌圈直径大小判定病原菌对药物的敏感性，根据美国临床和实验室药敏操作标准[11]可分为耐药（R）、中度敏感（I）和高度敏感（S）。抗菌药物药敏纸片主要包括β−内酰胺类抗生素中青霉素类氨苄西林、阿莫西林以及头孢菌素类头孢噻吩、头孢唑啉、头孢曲松；氨基糖苷类抗生素卡那霉素、链霉素、庆大霉素；四环素类抗生素米诺环素、四环素；喹诺酮类抗生素依诺沙星、萘啶酸、恩诺沙星、环丙沙星；磺胺类抗生素磺胺异恶唑、甲氧苄啶；糖肽类抗生素万古霉素；氯霉素类抗生素氯霉素、氟苯尼考；碳青霉烯类抗生素亚胺培南。
1.1. 主要试剂
1.2. 气单胞菌菌株
1.3. 细菌基因组提取
1.4. 毒力基因的检测
1.5. 耐药基因的检测
1.6. 药敏试验
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以10株气单胞菌基因组为模板，利用9种毒力基因的引物分别进行PCR扩增，结果如表3所示，除ascV和aexT基因阳性检出率较低外，其余7种毒力基因检出率均大于50%，其中，lip和ela基因检出率高达100%。相比之下，嗜水气单胞菌中C1、C2、C3以及维氏气单胞菌C4这4株菌株毒力基因携带率较高，可以达到77.8%。
气单胞菌 Aeromonas 编号 Number ascV aexT aer act ast alt lip ela fla 嗜水 A.hydrophila C1 − − + + + + + + + C2 − − + + + + + + + C3 − − + + + + + + + C6 − − + − + + + + + C10 − − + − + + + + + 达卡 A.dhakensis C5 − + − + − − + + − C8 − − + − − + + + + C9 − + + − − + + + + 简达 A.jandaei C7 − − − − + + + + + 维氏 A.veronii C4 − − + + + + + + + 检出率/% 0 20 80 50 70 90 100 100 90 注：“+”表示检出，“−”表示未检出，下同。
Note: “+”represented detected, “−”represented non-detected, the same below.Table 3. Identification of virulence genes of Aeromonas
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以10株气单胞菌基因组为模板，利用9种耐药基因的引物分别进行PCR扩增（表4）。从表4可知，9种耐药基因阳性检出率偏高，均大于50%。其中，嗜水气单胞菌C2和C3以及简达气单胞菌C7这3株菌里9种耐药基因携带率高达100%。
气单胞菌 Aeromonas 编号 Number qnrA qnrS tetA tetC ant3 strA sul1 tem ctxM 嗜水 A.hydrophila C1 + + + + + − + + + C2 + + + + + + + + + C3 + + + + + + + + + C6 + + + − − + + + + C10 + − + − + + + + + 达卡 A.dhakensis C5 + + + − + + − + + C8 + + + − + + + + + C9 + − + + + + + + + 简达 A.jandaei C7 + + + + + + + + + 维氏 A.veronii C4 + + + − + + + + − 检出率/% 100 80 100 50 90 90 90 100 90 Table 4. Identification of antibiotic resistant genes of Aeromonas
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从表5可知，10株气单胞菌对喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、氯霉素类抗生素和碳青霉烯类抗生素的敏感率较高，均大于60%，其中对庆大霉素、四环素、卡那霉素、依诺沙星、环丙沙星和氟苯尼考的敏感率高达90%以上；而对于β−内酰胺类抗生素、磺胺类抗生素和糖肽类抗生素耐药率较高，其中，对于阿莫西林、头孢噻吩、头孢唑啉和万古霉素的耐药率超过80%，但对三代头孢中的头孢曲松敏感率较高。
抗生素种类
Class of antibiotics药品名称
Antibiotics嗜水 A. hydrophila 达卡 A. dhakensis 简达 A.jandaei 维氏 A.veronii C1 C2 C3 C6 C10 C5 C8 C9 C7 C4 β−内酰胺类 头孢噻吩（30 μg·片−1） R R R R R R R R S I 头孢唑啉（30 μg·片−1） R R I R R R R R I R 阿莫西林（20 μg·片−1） R I R I R R R R R R 氨苄西林（10 μg·片−1） R R R R I I I R R I 头孢曲松（30 μg·片−1） S I I S S S I S S S 氨基糖苷类 链霉素（10 μg·片−1） R S S R S S S S S S 庆大霉素（10 μg·片−1） S S S S S S S S S S 卡那霉素（30 μg·片−1） S S S I S S S S S S 四环素类 米诺环素（30 μg·片−1） S I S S S I R I S S 四环素（30 μg·片−1） I S S S S S S S S S 喹诺酮类 依诺沙星（10 μg·片−1） S S S S I S S S S S 萘啶酸（30 μg·片−1） R I I I R S S S S S 环丙沙星（10 μg·片−1） S I S I S S S S S S 恩诺沙星（10 μg·片−1） S S S S S S S S S S 磺胺类 磺胺异恶唑（30 μg·片−1） R R R R R S R S I R 甲氧苄啶（5 μg·片−1） I R R R R R R S I R 糖肽类 万古霉素（30 μg·片−1） R R R R R R R R R R 氯霉素类 氯霉素（30 μg·片−1） S S S I I S S S S I 氟苯尼考（30 μg·片−1） S S S S S S S S S I 碳青霉烯类 亚胺培南（10 μg·片−1） S S S S I S S I R S 注：S. 高度敏感；I. 中介；R. 耐药。
Note: S: Sensitive; I: Intermediary; R: Resistant.Table 5. Identification of antibiotic sensitivity
2.1. 毒力基因检测结果
2.2. 耐药基因检测结果
2.3. 药物敏感性
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目前，普遍认为气单胞菌致病机制主要通过伤口与黏膜系统感染，参与感染的致病因子主要是具粘附作用的鞭毛、菌毛、外膜蛋白。气单胞菌的致病性强弱与其携带的多种毒力因子有关，毒力因子主要包括胞外毒素（气溶素、溶血素、细胞兴奋性肠毒素、细胞毒性肠毒素）、胞外蛋白酶、S层、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等[12]。本研究中，10株气单胞菌中的ascV和aexT基因检出率较低，而另外7种毒力基因检出率均大于50%，其中，磷脂酶基因lip和弹性蛋白酶基因ela检出率高达100%，不同种的气单胞菌毒力基因携带率均偏高。
胡萌[13]和吴亚锋[14]报道了气单胞菌中经检测发现肠毒素相关基因alt、act阳性率在68%以上，携带率也较高，而气溶素基因aer检出率为47%；范腾飞[15]发现，58株气单胞菌中含肠毒素相关基因的菌株占24.1%～81%，磷脂酶基因lip检出率为75.9%，气溶素基因aer为41.4%；SEN等[9]研究发现，气单胞菌中lip基因检出率为88%，alt、act、ast基因检出率在30%～70%。笔者在本次研究中发现，气溶素、肠毒素、蛋白酶等几种主要毒力基因检出率较高，都在50%以上，有些甚至达到100%。多种毒力基因的存在会大大增强气单胞菌病原菌的致病性，很可能对鳄鱼养殖业造成严重危害，应当引起高度重视。
本研究中，耐药基因检测结果表明，气单胞菌中9种耐药基因阳性率都大于50%，其中嗜水气单胞菌C2和C3以及简达气单胞菌C7耐药基因检出率高达100%。对应的抗生素药物敏感性检测结果与耐药基因结果有所不同，药敏试验中10株气单胞菌对喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、氨基糖苷类抗生素、氯霉素类和碳青霉烯类抗生素的敏感率较高，但在耐药基因检测中，均有检测出10株气单胞菌对这几类抗生素的耐药基因。这可能是由于细菌体内复杂的作用机制，耐药基因并没有得到顺利表达，这种情况在TRUDEL等[16]的研究中也有相似的结果。马辰婕等[1]通过检测气单胞菌的耐药基因，发现检出率最高的是β−内酰胺类耐药基因，阳性率高达83.7%，其次是磺胺类、氨基糖苷类和四环素类耐药基因，均高于40%，而喹诺酮类耐药基因qnrB和qnrS未检测到。在本次实验中，5类耐药基因检出率都偏高，除tetC外，其余8种耐药基因阳性率都高于80%。
由于气单胞菌种类繁多，水产养殖动物受外界环境以及所用的抗菌药物种类和频率不同，所以即使同一种气单胞菌对药物的敏感性也有差异。何秋丽[17]发现，气单胞菌对阿莫西林、氨苄西林等耐药性强，对二、三代头孢和碳青霉烯类抗生素敏感；李皇[18]等的研究结果表明，大多数气单胞菌对青霉素耐药，对氨基糖苷类、碳青霉烯类、四环素类、喹诺酮类和氯霉素类抗生素敏感；CARNAHAN等[19]报道了气单胞菌对氨苄西林、头孢唑啉以及头孢噻吩耐药，这些研究结果与本次实验结果基本一致。暹罗鳄的养殖环境以及抗生素使用的种类和次数都会影响到气单胞菌的药物敏感性。因此，在鳄鱼细菌性疾病的防治中，应加强耐药情况的监测，选择有效的抗菌药物并交替使用，以减少病原细菌耐药率的发生。
在国内，鳄鱼养殖还是一个新兴产业，暹罗鳄病原菌方面的研究报道很有限，鳄鱼养殖业要健康发展，鳄鱼病害研究的重要性不言而喻。本研究从患病暹罗鳄体内分离出的10株气单胞菌进行毒力基因、耐药基因以及药物敏感性的检测和分析，可为暹罗鳄病害防治及有效的抗菌药物筛选提供参考。
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