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香蕉(Musa spp.)是我国南亚热带地区重要的经济作物。香蕉灰纹病(又称香蕉暗双孢霉叶斑病)已成为我国香蕉产区常见且危害严重的病害之一,严重威胁着香蕉产业健康持续发展[1-6]。该病主要危害叶片,且常和Sigatoka叶斑病混合发生,造成多种病原的复合侵染[7-9]。目前国外已报道的引起香蕉灰纹病的病原真菌有Neocordana musae(Cordana musae)、N. johnstonii(C. johnstonii)、N. musicola、N. musarum、N. musigena及N. malayensis等[10-15],国内已报道的有C. musae[4, 16-18],但国内相关报道只是进行形态与培养性状观察,未进行分子生物学的进一步验证。为了进一步明确海南香蕉灰纹病病原菌的种类及其生物学特性,本研究从海南香蕉主产区采集多份病叶进行组织分离纯化和致病性测定,采用传统形态学特征观察、rDNA-ITS测序及其系统发育树分析等方法对该病害病原进行鉴定,并在此基础上测定了该菌在不同培养基、温度、pH、碳源、氮源、光照、通气等条件下的生物学特性,以期为深入研究海南香蕉灰纹病的发生流行及防控提供理论依据。
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采用组织分离法从发病香蕉叶片分离获得6株纯化的真菌菌株,菌落形态观察及镜检表明,6株分离菌形态特征一致,为同一种真菌。接种后第3 d,叶片刺伤处(6个菌丝块接种点)均开始发病,发病率为100%,而PDA琼脂块接种的对照叶片均未发病。菌丝块接种点病斑为短椭圆形,随叶脉方向扩展,外围具黄色晕圈,中间灰褐色,有轮纹,其发病症状(图1A)与田间发病症状相似(图1B)。根据柯赫氏法则,从接种发病的香蕉叶片上重新分离到与原接种菌株形态特征一致的真菌,确认6株分离菌株为香蕉灰纹病的致病菌。
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病原菌在PDA培养基上的菌落正面呈圆形,灰白色,绒毛状,边缘不整齐,有轮纹;基底中菌丝灰褐色至灰黑色,质地紧密,生长旺盛(图1C);菌落背面呈黑褐色,同心轮纹状,边缘明显,有淡黄色晕圈(图1D)。经显微镜观察发现,分生孢子梗褐色、直立、无分枝;分生孢子梗顶端突出膨大,产孢(图1E);分生孢子双胞、倒卵形,隔膜处有缢缩,透明或微褐色,孢子顶端具脐点(图1F)。根据病原菌的培养性状与形态学特征,参考HERNÁNDEZ-RESTREPO等[12]、戚佩坤[16]及PLOETZ等[22]的描述,将海南的香蕉灰纹病病原初步鉴定为暗双孢属真菌(Neocordana sp.)。
提取6株病原菌的基因组DNA,利用rDNA-ITS通用引物对ITS1/ITS4进行PCR扩增,PCR产物经测序及序列多重比对,发现6株病原菌的rDNA-ITS区扩增片段长度均为575 bp,且相似性为100%。选择1号菌株的ITS序列提交到GenBank(登录号:MN960387),并命名为CATAS-CM01。经GenBank数据库Blantn比对分析,CATAS-CM01与GenBank中公布的Neocordana musae(LN713276-LN713278,LN713280-LN713282,KP770138)相应片段最相近,相似性达99.28%~99.65%,与N. malayensis(MK442593)、N. musarum(KY173424-KY173425)、N. musigena(KY979749-KY979750)及N. musicola(LN713283-LN713285)相应片段序列相似性为95.6%~98.58%,而与其他属菌株同源性较低,约87%的相似性。以Magnaporthe grisea(登录号:MH864859、FN555111)、Pyricularia pennisetigena(登录号:MN889450、MH412638)、Pyricularia angulata(登录号:MT071757、JF719830)作为外群构建菌株CATAS-CM01的rDNA-ITS基因系统发育树,结果显示CATAS-CM01与香蕉暗双孢菌云南分离株XJ13-12-01(登录号:KP770138)及6株N. musae模式菌株CPC 19605、CPC 16362、CPC 17293、CPC 17237、CPC 16298和CPC 18127(登录号:N713276-LN713278,LN713280-LN713282)以81%的置信度聚在同一分支,遗传距离最近(图2)。结合6株病原菌的形态学特征,最终将病原菌鉴定为香蕉暗双孢菌Neocordana musae( Cordana musae)[12]。
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病原菌在7种培养基上均能生长,其中生长最快的是LEDA和CMA培养基,平均生长速率分别为0.56 cm·d−1和0.55 cm·d−1,满皿时间分别为18 d和19 d,菌落边缘规则,但气生菌丝轻薄;其次是OA培养基和PDA培养基,平均生长速率均为0.49 cm·d−1,满皿时间为21 d,菌落边缘虽不规则,但气生菌丝较紧密,PDA培养基上的菌落有轮纹;生长较慢的培养基依次为PSA、CA和CDA,平均生长速率分别为0.44、0.39、0.35 cm·d−1,满皿时间分别为23、26、29 d(表1)。OA、PDA、LEDA及CMA培养基上的菌落平均生长速率无显著差异(P<0.05),结合菌落形态及满皿时间,最适合菌落生长的培养基为OA和PDA。病原菌菌丝的生长速率随天数的增加而逐渐减慢,在7 d时各培养基上菌丝的生长速率逐渐趋于稳定(图3)。
培养基
Medium菌落直径/cm Colony diameter 平均生长速率/ (cm·d−1)
Average growth rate满皿时间/d
Day of full dish3 d 5 d 7 d 9 d PDA 1.63± 0.05 bc 2.58±0.20 bc 3.14±0.11 bc 3.89±0.13 bc 0.49±0.03ab 21 PSA 1.54±0.10 c 2.18±0.14 cd 2.90±0.11 cd 3.56±0.14 cd 0.44±0.02 bc 23 OA 1.65±0.11 bc 2.58±0.20 ab 3.20±0.26 bc 4.00±0.27 bc 0.49±0.03 ab 21 CA 1.27±0.05 d 1.91±0.07 d 2.65±0.10 de 3.25±0.13 de 0.39±0.01 cd 26 CMA 1.95±0.05 a 2.67±0.09 ab 3.53±0.08 ab 4.47±0.08 ab 0.55±0.07 a 19 CDA 1.09±0.09 d 1.82±0.12 d 2.37±0.16 e 2.93±0.25 e 0.35±0.01 d 29 LEDA 1.84±0.08 ab 2.80±0.10 a 3.69±0.14 a 4.66±0.15 a 0.56±0.04 a 18 注:表中数据均为3次重复的平均值。同列数据后小写字母不同者表示在5%水平时差异显著(Duncan氏新复极差检验),下同。
Note: The data are the average of the 3 replicates. Different lowercase letters in the same column show significant difference at a 5% level (Duncan’s multiple-range test), similarly hereinafter.Table 1. Effect of different culture mediums on mycelial growth of N. musae
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病原菌在10~40 ℃范围内均能生长,适宜生长温度为25~30 ℃,与其他处理温度有显著差异(P<0.05),且最适生长温度为30 ℃。温度≤15 ℃或者≥35 ℃时,病原菌生长受抑制(图4)。
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病原菌在pH 4~10范围内均可生长,pH 5~7时生长较好,pH 为6时生长最佳,与pH 7差异不显著,但与其他pH有显著差异(P<0.05)。pH大于8时,菌丝扩展受抑制(图5)。
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病原菌在不同碳源的培养基上均可生长,其中对乳糖利用效果最好,与其他碳源有显著差异(P<0.05),其次是蔗糖和淀粉,果糖利用效果最差(图6)。
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病原菌在不同氮源的培养基上均能生长,其中对蛋白胨、酵母膏及硝酸钠利用较好,与其他氮源有显著差异(P<0.05),且以酵母膏最佳,其次是脲、磷酸氢二铵和牛肉膏,氯化钠和硫酸铵的利用最差(图7)。
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病原菌在5种光照条件下均能生长,其中24 h全光照条件下菌落直径最大,为4.06±0.14 a(a、b、c、d表示差异显著性,下同);其次是16 h光照8 h黑暗(长日照)和12 h光照12 h黑暗,菌落直径分别为3.80±0.05 ab,3.39±0.03 c;在24 h全黑暗条件下菌落直径最小,为2.96±0.09 d;8 h光照16 h黑暗(短日照)条件下菌落直径为3.53±0.08 bc。全黑暗与全光照及光暗交替培养有显著差异,说明光照利于菌丝生长。
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通气与不通气对菌丝生长均有一定影响,在4种转速梯度中,均以24 h振荡培养的菌丝湿质量、干质量最大,与其他处理差异最显著(P<0.05),其中以转速200 r·min−1时,菌丝湿质量、干质量分别达4.50 g和2.91 g;其次是12 h振荡12 h静置;24 h静置处理条件下,菌丝湿质量、干质量最低(表2)。
转速/(r·min−1) 处理 Treatment 菌丝平均质量 Average mycelia mass/g 湿质量 Wet mass 干质量 Dry mass 50 24 h 静置 24 h quiet 0.85±0.05 c 0.25±0.08 b 24 h 振荡 24 h shaking 2.14±0.04 a 0.55±0.04 a 12 h 振荡12 h 静置 12 h shaking and 12 h quiet 1.49±0.03 b 0.36±0.03 b 100 24 h 静置 24 h quiet 0.77±0.07 c 0.18±0.04 b 24 h 振荡 24 h shaking 2.53±0.37 a 0.86±0.05 a 12 h 振荡12 h 静置 12 h shaking and 12 h quiet 1.76±0.20 b 0.68±0.02 b 150 24 h 静置 24 h quiet 0.86±0.05 b 0.22±0.02 c 24 h 振荡 24 h shaking 3.29±0.18 a 2.15±0.17 a 12 h 振荡12 h 静置 12 h shaking and 12 h quiet 3.24±0.07 a 1.68±0.06 b 200 24 h 静置 24 h quiet 0.93±0.08 c 0.33±0.09 c 24 h 振荡 24 h shaking 4.50±0.41 a 2.91±0.41 a 12 h 振荡12 h 静置 12 h shaking and 12 h quiet 2.87±0.20 b 1.73±0.21 b Table 2. Effect of ventilation condition on mycelial growth of N. musae
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病原菌菌丝在60 ℃下水浴10 min后仍能在PDA平板上正常生长,但在60 ℃及以上温度处理15 min后不能生长,说明病原菌菌丝的致死温度为60 ℃ 10 min(表3)。
处理 Treatment/min 温度 Temperature/℃ 室温 (Room temperature) 40 45 50 55 60 65 70 5 + + + + + + + − 10 + + + + + + − − 15 + + + + + − − − 20 + + + + + − − − Table 3. The lethal temperature on mycelial growth of N. musae