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抗生素种类繁杂,现已达到几千种,按照其化学结构主要分为β−内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、氨基糖苷类和氯霉素等,并且在多种环境介质中广泛存在。水体中抗生素污染的来源主要有医用、养殖业及制药工业废水排放。抗生素被使用后并不会被生物体完全吸收。残留抗生素以多种形式经各种途径排入水体等环境中,造成环境污染。国内的其他水环境(如地表径流、地下水、海洋等)中都能检测到抗生素的残留。不同水域间的抗生素残留量差别很大,残留量最高的是养殖废水。磺胺类、喹诺酮类、四环素类及氯霉素类等4类抗生素由于具有较好的防治疾病和促生长等作用而被广泛使用于水产养殖等行业,以达到治疗、预防动物传染性疾病和促进动物生长的目的[1-3]。水产养殖废水的排放是水环境中抗生素污染的重要的人为来源。陵水新村、黎安港和万宁小海海域是海南省重点海水养殖集中区,具有重要的生态及经济价值[4]。新村港位于海南省陵水县新村镇的东南部,港内南北长4 km,东西宽6 km,面积24 km2,拥有上千家鱼排,养殖着金鼓鳗鱼、珍珠龙胆等鱼类。万宁小海现面积约43 km2,周长约43 km,小海物产丰富,著名的和乐蟹、港北对虾和后安鲻鱼均产于此。调查区域主要为浅海养殖中的网箱养殖。网箱的主要结构是框架和网衣,框架起到支撑固定网衣的作用,网箱面积可达到数十平方米,深度约为2~4 m。网衣上常附着水藻、微生物等多种物质。浮动式网箱能随着水位的变化而上下浮动,在养殖中使用广泛,常用于养殖鱼类、螃蟹[5]。有研究表明,海南省每年每平方米的抗生素排放量处于我国相对较高水平[6],但重要水产养殖区域养殖水体中抗生素的分布特征鲜见系统报道。为此,本研究采集海南岛东部陵水新村、黎安港和万宁小海,海域养殖区的海水样品,通过LC-MS/MS 技术对样品中4类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类及氯霉素类)40种抗生素进行定量分析,以揭示养殖区海水中抗生素残留的分布情况并进行生态风险评估,同时为养殖区生态水质监测和环境保护提供科学支持。
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本研究于2018年8月采集陵水新村、黎安港和万宁小海养殖区海域表层海水样本,共采集样品15个,采样点分布见图1。同一采样点以棕色玻璃瓶采集1 L水样。水样采集时取同一截面水平面0.5 cm以下左中右3个点的混合样,每个样点采集3个重复。水样置于4 ℃冰盒中避光冷藏保存,并于48 h内进行前处理。采样时详细记录监测点位的水温、pH值、溶解氧和盐度等。
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本研究对4类(磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类)40种抗生素进行检测,检测方法参照文献[7]。
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取1 L已过滤水样,用盐酸-水溶液(V盐酸∶V水=1∶1)调节pH至2.5。依次用20 mL甲醇、6 mL超纯水、6 mL盐酸(pH2.5)对HLB柱进行活化。用已活化HLB柱对水样进行富集,流速控制在5 mL·min−1 左右。富集完成后用氮气轻柔吹干富集小柱,将氮吹干燥后的小柱用12 mL甲醇进行洗脱,收集洗脱液。洗脱液氮吹浓缩至近干。用流动相95%A(0.1%甲酸−1 g·L−1甲酸铵水溶液)和5%B(V甲醇∶V乙腈=1∶1)定容至1 mL,过0.22 μm尼龙滤膜,待测。
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进样量10 mL,柱温40 ℃,流速0.30 mL·min−1。流动相A:0.1%甲酸−1 g·L−1甲酸铵水溶液;流动相B:V甲醇∶V乙腈=1∶1。梯度洗脱程序:起始5%B 3 min,然后在18 min内从5%B线性变化至88%B。质谱离子源:ESI+/ESI−切换,MRM数据采集模式。待检抗生素中氯霉素类抗生素采用负离子模式,其余抗生素采用正离子模式。
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为研究抗生素在采样区水体中抗生素对水生生物的生态风险,采用风险熵值(RQs)来评估。风险熵值法(RQs)来自欧盟的技术指导文件(European commission technical guidance document, TGD),药品在环境中的生态风险可以根据风险熵值(RQs)大小来评估,此方法被广泛应用于分析废水和地表水中常检测到的药物环境风险。RQs通过污染物的环境实测浓度与预测无效应浓度的比值获得,公式如下:
式中:MEC为抗生素的实测质量浓度,ng·L−1;PNEC为预测无效应浓度,即不会对生态环境产生不良影响的最大质量浓度,ng·L−1。
有研究[8-11]表明,多种抗生素存在于水体时,产生的毒性效应会加强。因此,用联合风险熵值法(RQsum)来代表多种抗生素对水生生态系统的生态风险,计算公式:
由于不同种类抗生素对不同物种的毒性不同,因此,选用最敏感物种的PENC作为评估值,6种检出的抗生素中丹诺沙星未能找出参考的PENC值,其余如表1所示。
抗生素种类
Type of antibiotic最敏感物种
Most sensitive species毒性数据(mg·L−1)
Most sensitive species毒性
Toxicity评价因子
The evaluation factorsPENC/
(ng·L−1)参考文献
ReferenceCIP M. aeruginosa EC50=0.017 急性 1000 17 [12] DOX Lemna gibba EC50=0.316 急性 1000 316 [13] TC P. subcapitata EC50=3.31 急性 1000 3310 [14] OTC P. subcapitata EC50=1.04 急性 1000 1040 [15] THI M. aeruginosa EC50=0.320 急性 1000 320 [16] Table 1. Toxicological data of antibiotics for the most sensitive species