Cloning and expression analysis of AsABCG1 gene in Aquilaria sinensis

本次实验所用的白木香材料来源于中国热带农业科学院热带生物技术研究所基地，选取生长一致的3年生白木香进行胁迫处理。对于机械伤害处理，利用电钻对白木香茎干钻孔处理（图1-A）；对于茉莉酸甲酯处理，使用溶解于体积为0.1%乙醇溶液的180 μM 茉莉酸甲酯浸湿纸巾包裹白木香茎干（图1-B）。每个处理3个生物学重复，并于处理后0 h、3 h、6 h、24 h、72 h、120 h后分别取样，立即放于液氮冷冻研磨，并于−80℃冷冻保存，以供后续实验使用。

Figure 1.  Aquilaria sinensis mechanical damage treatment (A)and methyl jasmonate treatment (B)

采用诺维公司RNA提取试剂盒并按照说明书方法提取白木香茎干总RNA，提取后利用琼脂糖凝胶跑电泳评估其质量。RNA样本质量经检测条带正确后，使用RNA反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA后置于−80℃保存。

结香剂处理能够激活白木香茎干次生代谢物合成并促进沉香的形成。先前研究中对白木香茎干进行结香剂处理并在0 d、3 d、6 d、9 d对处理的白木香进行采样，之后对采取的白木香样品进行转录组测序得到白木香转录组数据^[17]。基于转录组注释数据和FPKM的表达值分析，筛选出一条结香剂处理差异表达基因，将其命名为AsABCG1。并通过SPSS 20.0软件分析差异表达基因与6种已知2-（2-苯乙基）色酮类化合物含量的皮尔逊相关系数。根据AsABCG1的CDS序列，使用CE Design V1.01软件设计其特异性引物（表1）。以逆转录获得的cDNA为模版进行PCR扩增，得到与目的基因大小一致的条带后，使用Agarose Gel DNA Recovery Kit[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]对扩增产物进行纯化。将纯化后的目的基因构建到PMD-19T载体上，并转入大肠杆菌感受态DH5α中，经菌液PCR鉴定为阳性后提取质粒后送测序。序列正确的质粒冻存于-20°C冰箱供后续实验。

用ExPASy在线软件（Expasy-SIB Swiss Institute of Bioinformatics）对AsABCG1蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽、磷酸位点进行预测，利用NPS@:SOPMA（ibcp.fr）在线预测蛋白二级结构，使用SWISS-MODEL（expasy.org）在线预测蛋白三级结构；运用PlantCARE（ugent.be）在线软件查找启动子区顺式作用元件；使用DNAMAN软件对不同物种的蛋白序列进行对比分析，通过MEGA10.0软件建立系统发育树。

依据荧光定量试剂盒说明书中的方法，设计用于检测AsABCG1基因表达的荧光定量引物和内参基因的荧光定量引物（表1）。根据说明书中反应体系进行加样，并在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，设置程序为二步法。对每种处理条件的样品均进行三次生物学重复实验，并采用2^−ΔΔCt法计算并分析该基因的相对表达水平。

根据课题组梅文莉等专利结香技术处理的白木香转录组数据库^[18]，共筛选出10个差异表达的ABC转运蛋白基因。利用TBtools V2.056 软件分析其FPKM值并绘制表达量热图（图2-A），结果显示， evm.model.Scaffold2.763 基因的表达在结香剂处理后上调最为明显，将其命名为 AsABCG1。将色酮类化合物含量与ABC基因表达进行相关性分析（图2-B），结果显示，10个具有差异表达的AsABC基因中5个与色酮类具有不同程度的正相关性，另外5个则具有不同程度的负相关性，而AsABCG1与几种主要的色酮类化合物均表现出较高的正相关性，说明AsABCG1可能参与沉香色酮等代谢物的积累。

Figure 2.  Correlation analysis of AsABC gene expression and chromone content after treatment with agarwood inducer

根据白木香转录组中的序列设计 AsABCG1 基因的特异性引物并进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测显示获得一条清晰的条带（图3）。测序结果表明，该基因的 CDS序列全长为1986 bp，编码一个包含661个氨基酸的蛋白质。

Figure 3.  PCR amplification product of AsABCG1 from Aquilaria sinensis

AsABCG1蛋白（分子式：C₃₃₂₇H₅₂₂₂N₈₇₂O₉₃₁S₃₈）相对分子量约为73.56 kDa，理论等电点（pI）值为8.64。其脂肪系数为96.07，不稳定系数为40.98。电荷分析显示该蛋白含有56个负电荷残基（Asp + Glu）和62个正电荷残基（Arg + Lys）。平均亲水性系数为0.139，结合其多肽链存在显著的非亲水性区域，表明AsABCG1属于疏水蛋白（图4-A）。TMHMM server V2.0跨膜结构在线预测表明编码该蛋白的661个氨基酸中共包含6个跨膜结构域，确认为跨膜蛋白图（4-B）。

Figure 4.  Physicochemical properties and structural analysis of AsABCG1 protein

信号肽在线预测显示AsABCG1蛋白C-score、S-score、和Y-score分值都较低，且不存在信号肽剪切位点，为非分泌性蛋白（图4-C）。此外，NetPhos 3.0预测揭示AsABCG1存在较多的潜在磷酸化位点，其中丝氨酸（Ser）最多共有33个，苏氨酸（Thr）为21个，酪氨酸（Tyr）为6个（图4-D）。

蛋白二级结构有α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和延伸链等。SOPMA在线预测AsABCG1蛋白二级结构（图5-A）结果显示，其结构主要为α-螺旋（48.26%）、无规则卷曲（39.49%）另还有较少的延伸链（12.25%）。α-螺旋是蛋白质二级结构的主要形式，主要由其精确的原子级结构决定，具有高度的规律性和稳定性，能够构成跨膜通道并转运蛋白；无规卷曲是由主链骨架无规律排列形成的构象，能够介导分子识别与结合、构成催化位点、作为翻译后修饰和调控的位点；延伸链指的是构成 β-折叠的肽链构象，也称为β-构象，为蛋白质提供了独特的刚性、平坦和抗拉伸的结构基元。AsABCG1中α-螺旋为其主要结构，结合该结构的功能，可进一步证实该蛋白属于跨膜蛋白。

Figure 5.  Prediction of the structure of the AsABCG1 protein

使用SWISS-MODLE预测三级结构（图5-B），结果表明，该结构与已知榴莲中ABC-G基因家族成员（LOC111308351）的GMQE值为0.81。证实了AsABCG1属于ABC-G亚家族成员，且该结构中存在较多的α-螺旋，这也印证了二级结构的预测结果。二级结构和三级结构的预测结果均表明，AsABG1符合ABC转运蛋白的结构特征。

从NCBI中下载与AsABCG1同源性较高的氨基酸序列，并做同源性对比（图6）。结果显示AsABCG1具有典型的植物ABC转运蛋白结构特征，包含两个保守结构域（MotifA和MotifB）。AsABCG1与木槿（Hibiscus syriacus）HsABCG、陆地棉（Gossypium hirsutum）GhABCG、榴莲（Durio zibethinus）DzABCG、可可树（Theobroma cacao）TcABCG、哥伦比亚锦葵（Herrania umbratical）HuABCG中ABC蛋白同源性分别为69.39%、69.77%、69.77%、69.24%、69.20%。

Figure 6.  Comparison of sequences between AsABCG1 and other plant ABCG proteins

将10个具有差异表达的AsABC蛋白与其他植物中的ABC蛋白氨基酸序列进行系统发育树构建（图7），结果表明，有4个AsABC蛋白（AsABCG1、em.model.Scafold158.5、ev.model.Scafold407.6和evm.model.Scafold1.667）属于ABC-G亚家族，该家族成员在调控植物次生代谢物转运过程中具有重要的调控作用。

Figure 7.  Phylogenetic tree of sequences of AsABCG1 and ABC amino acids of other species

用PlantCARE对AsABCG1基因启动子区进行分析，结果（图8）显示，该区域存在多种参与植物表达调控的顺式作用元件，包括参与光响应调控（G-box cis-acting element）G-box；参与茉莉酸（Jasmonic acid response element）TGACG-motif、生长素 （auxin response element）AuxRR-core、赤霉素（Gibberellin Response Element）GARE-motif、脱落酸（abscisic acid response element）ABRE 等多种激素调控；参与胁迫响应如厌氧诱导反应（Anaerobic Response Element）ARE、机械损伤响应元件（Wound Responsive Element 3）WRE3以及参与植物生长发育等相关元件。以上结果表明，AsABCG1基因的表达可能受到这些因素的调控。

Figure 8.  Analysis of regulatory elements in the promoter region of the AsABCG1 gene

采用RT-qPCR技术分析了AsABCG1在茉莉酸甲酯和机械伤害处理下的表达模式，结果显示，AsABCG1基因对两种处理均表现出显著的应答反应。在茉莉酸甲酯处理下（图9-A），AsABCG1的表达在各时间点均明显上调，其中在处理6 h后表达量达到最高，为对照组的21.1倍。而在机械伤害处理中，基因表达量在处理5 d后才达到峰值，为对照组的4.5倍（图9-B）。上述结果表明，AsABCG1可能参与了茉莉酸信号通路和机械伤害应答的生理过程。

Figure 9.  The effects of methyl jasmonic acid (A)and mechanical damage (B)treatment on the expression of the AsABCG1 gene

ABC转运蛋白参与植物体内多种次生代谢产物的运输，在促进次生代谢物积累中起着关键作用，现已成为植物次生代谢工程领域的研究热点之一^[18]。本研究基于课题组的白木香转录组数据，克隆出一条编码ABC转运蛋白的基因AsABCG1。并对其理化性质、蛋白结构及基因表达量进行分析，旨在阐明ABC转运蛋白对白木香中次生代谢物的转运机制，为揭示沉香特征性成分积累机制和提高人工诱导沉香中特征性成分含量奠定基础。

近些年来，关于ABC转运蛋白对植物次生代谢产物转运功能的研究，已有了很大的进展。已有研究表明，ABC转运蛋白能够参与萜类化合物的转运，例如，丹参中SmABCG1参与二萜类化合物丹参酮的转运^[19]；ElABCG39是续随子（Euphorbia lathyrism）大环二萜类化合物的关键转运蛋白^[20]；青蒿（Artemisia annua）AaPDR3具有转运半萜类化合物β-石竹烯的功能。此外，ABC转运蛋白也参与黄酮类化合物的转运，例如，拟南芥中AtABCC1、AtABCC2、AtABCC14参与花青素的转运^[21]；佛手（Citrus medica）中CmABCB19、CmABCC10参与蜜桔黄素、橙皮素、柚皮苷等黄酮类次生代谢物的转运^[22]。倍半萜类和2-（2-苯乙基）色酮类化合物是沉香中的特征性成分和主要生物活性成分，其中2-（2-苯乙基）色酮类化合物与黄酮类化合物结构相似^[23]。据此推测ABC转运蛋白在沉香倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮类化合物的转运和积累过程中发挥重要的调控作用。蛋白结构预测结果表明，AsABCG1为跨膜蛋白，具有ABC转运蛋白的基本特征；在结香剂处理下，该基因表达与色酮类化合物物积累正相关，表明AsABCG1可能参与沉香色酮类等次生代谢物的转运。

通常健康的白木香树不会产生沉香，只能在损伤后诱导才能形成^[24]。研究表明，伤害处理和茉莉酸甲酯处理可诱导沉香中倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮类化合物产生并促进次生代谢物形成^[25-27]。本研究发现AsABCG1启动子存在多个茉莉酸和防御胁迫相关响应元件，进一步表达分析显示茉莉酸甲酯处理和伤害处理均可显著诱导AsABCG1基因的表达，说明AsABCG1参与了白木香伤害和茉莉酸信号转导，可能介导倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮类化合物的转运。本研究不仅为沉香属植物研究提供了一个新的候选基因，也为深入揭示AsABCG1在沉香特征性成分转运与积累中的功能奠定了重要基础。后续将对该基因是否参与次生代谢物的转运等功能进行验证，并进一步解析其表达调控机制，以系统阐明ABC转运蛋白在沉香特征性成分转运过程中的功能及调控网络。相关研究结果有望为开发新型结香诱导技术、提升沉香特征性成分的积累水平提供理论依据和技术支撑。在此基础上可对该基因是否具有转运次生代谢物等功能进行验证，以期探究ABC转运蛋白对调控沉香特征性成分转运的分子机制并进一步揭示沉香特征性成分的转运和调控机理。