Copper stress symptoms and absorption-transport characteristics analysis in rubber tree plants

采用3蓬叶、顶蓬叶稳定、生长均一的‘热研73397’橡胶树组培幼苗，移栽至Hoagland营养液中进行水培预培养一个月（条件详见1.1.2），之后用于正式胁迫试验。

采用水培法，将生长一致的组培苗移栽至容积为5 L的深色塑料桶中，以Hoagland营养液为培养介质，营养液pH值调节至5.5，在培养房进行水培预培养1个月，培养条件设定为：温度25 °C，光周期16 h光照: 8 h黑暗，并使用增氧泵持续向营养液通气，以保证根系氧气供应。对恢复生长后的橡胶苗分别进行铜胁迫处理，以Hoagland全营养液为对照，胁迫培养营养液中的Cu²⁺（以CuSO₄·5H₂O供给）质量浓度和pH值如表1所示（选择pH5.5和7.0作为对照条件主要是排除pH波动对实验结果的影响，对照组铜质量浓度设置为0.1 mg·L⁻¹，此为Hoagland营养液的标准配方浓度^[22]，经已发表的报道和前期预实验证实，此浓度在研究期间并未对橡胶苗生长造成明显抑制作用，故将其设为对照^[23-24]；此外，预实验阶段曾在0.1～6 mg·L⁻¹中设置3 mg·L⁻¹，通过测定相关生长生理指标和表型观察，发现橡胶苗未表现出明显缺铜或铜害症状，无法体现浓度梯度对橡胶苗生长的渐进式影响，未达到预期实验目的，为突出铜胁迫的浓度效应，避免无效梯度对实验结果的干扰，经综合评估后删除，形成重点突出的浓度梯度），胁迫处理3、6、9、12 d每个时间间隔结束时进行叶片与根系的观察与测定各根部、叶片、树皮以及木质部的铜含量，每个处理浓度16株橡胶苗，共计96株。

采用酸性茚三酮染色法测定^[25]。

将采集的样品（橡胶苗各组织）用自来水、二次蒸馏水淋洗干净，阴干后于电热恒温干燥箱60℃烘干，粉碎后过100目筛，装入干燥样品袋内放在干燥器中备用。分别称取其根、叶、木质部及树皮各1 g于烧杯中，加浓硝酸-高氯酸（3+1）的混合酸15 mL，盖上表面皿，消化24 h后进行低温消解，待白烟冒尽，液体成淡黄色或白色沉渣析出，残渣用二次蒸馏水溶解，定容至25 mL，过滤后待测，同时做试剂空白，根据火焰原子吸收光谱仪的说明及实验选择324.75 nm测定，并且吸取铜的储备液，按比例稀释0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、5 ppm成标准溶液，分别测定吸光值^[26-27]，计算出橡胶苗各器官溶液与空白溶液中铜的质量浓度。具体橡胶苗各器官铜含量计算公式为

式（1）中：X——试样中铜的含量；

ρ——试样溶液中铜的质量浓度；

ρ₀——试样空白液中铜的质量浓度；

V——试样消解液的定容体积；

f——试样稀释倍数；

m——试样称取质量或吸取体积；

F——换算系数。

铜转运系数（translocation factor，TF），可反映植物吸收重金属后从根部转移到地上部的能力，具体计算公式如下^[28-29]。

式（2）中：TF——铜转运系数；

C_stem——茎的铜含量；

Dw_stem——茎的干重；

C_leaf——叶片的铜含量；

DW_leaf——叶片的干重；

C_root——根部的铜含量；

DW_root——根部的干重。

使用Microsoft Excel 2019录入和整理原始数据，初步计算各处理组的平均值（Mean）和标准差（Standard Deviation，SD），采用SPSS Statistics 17.0软件进行统计分析，通过Origin 2025b软件进行图表绘制。

不同铜水平处理下，橡胶苗根系生长的形态响应具有显著的浓度与时间依赖性（图1）。对照组和T₁组（pH调控）在整个处理周期（3～12 d）中，根系始终呈现出典型的白色外观。缺铜处理（T₂组）在12 d时和T₃组在处理9～12 d时能观察到有小部分区域出现褐变；T₄组引发了典型的铜毒害症状，仅处理3 d时就能观察到褐化现象，6～9 d的时候褐色逐渐变得更深，到了12 d，出现大面积深黑色病变，并且有根系减少现象，根系组织已经遭受了不可逆的损伤；T₅组则出现了急性毒害效应，处理第3～6 d时候就出现较多根系区域出现黑变现象，9～12 d的时候根系几乎完全变黑，同时伴随着根系死亡现象。

Figure 1.  Variation in root growth performance of rubber tree plants under treatment at different copper concentrations

不同铜水平处理下，橡胶苗叶片生长的形态响应具有显著的浓度与时间依赖性（图2），CK与T₁组叶片生长表型未发生明显变化。缺铜处理（T₂组）表现出典型的缺铜症状，主要表现为叶片黄化，叶尖有干枯现象，在处理12 d时最明显；T₃组在处理6～12 d叶片有所黄化，但与T₄和T₅组相比，程度较轻，T₄和T₅组明显叶片黄化加剧，并伴随老叶枯萎及锈褐色斑块的形成，其中T₅组症状最为严重。

Figure 2.  Change in leaf growth performance of rubber tree plants under treatment at different copper concentrations.

如图3结果显示，从同一质量浓度铜随胁迫时间延长的变化趋势来看，在pH调控处理组（T₁）中，根系与叶片游离脯氨酸含量与对照组（CK）基本没有明显差异；缺铜处理组（T₂）根系和叶片的游离脯氨酸含量在第12 d时达到峰值，在整个处理期内（3～12 d）分别上升到1.59倍和1.24倍；铜过量处理下，T₃组的根系与叶片游离脯氨酸含量呈上升趋势，至第12 d达到峰值分别累计升高到1.65倍和1.54倍；T₄和T₅组则表现出“快速积累-下降的变化特征，在第9 d，T₄组达到峰值后开始明显下降；在第6 d，T₅组出现峰值后开始出现显著下降趋势。从同一胁迫时间下不同质量浓度铜处理组间的差异来看，在第6 d的关键响应期，各处理组脯氨酸积累量显著分化，T₂-T₅根系脯氨酸含量分别是对照组的1.26、1.02、2.35、2.99倍，叶片是对照组的1.08、1.45、2.80、6.01倍。

Figure 3.  Differences in free proline content among rubber seedlings under varying copper levels

如图4结果显示，在不同质量浓度铜处理下，橡胶树幼苗根部、树皮、木质部及叶片中的铜含量随胁迫时间延长呈现出各自的变化动态。根部在正常（CK）和pH调控（T₁）条件下铜含量无明显差异，仅随时间轻微上升；缺铜处理（T₂）则导致根部铜含量在处理后期显著下降；而铜过量处理中，T₃组铜含量在第6 d显著上升后趋于平稳，T₄和T₅组则在整个胁迫期内持续上升，表现出明显的时间依赖性。树皮中，CK与T₁组铜含量始终无显著变化，T₂组后期明显下降，T₃组在第12 d显著上升，T₄和T₅组则从早期开始持续积累。木质部在CK、T₁和T₂组中变化不显著，而T₃-T₅组均出现不同程度上升，其中T₄和T₅组在3～9 d显著上升后趋于稳定。叶片中，CK与T₁组铜含量轻微上升，T₂组在第6 d下降后稳定，T₃组整体无显著变化，T₄和T₅组分别在第6～12 d和第3～12 d时持续显著上升，表现出持续的铜富集效应。在同一胁迫时间下，不同质量浓度铜处理对各组织铜含量的影响存在显著差异。根部在早期（第3 d）仅T₃至T₅组铜含量显著高于对照，随时间推移，T₄和T₅组铜含量持续上升，至第12 d分别达到对照组的6.22倍和11.47倍，而CK、T₁与T₂组间始终无显著差异。树皮中，T₃至T₅组从第3 d起铜含量即显著高于对照，且随处理浓度上升而递增，至第12 d分别达对照的6.47倍、9.07倍和9.67倍，CK与T₂组在多数时间点无显著差异。木质部中，T₃至T₅组铜含量始终显著高于对照，而CK、T₁和T₂组间始终无显著差异。叶片中，T₄和T₅组铜含量自第3 d起即显著高于对照，且随时间延长差异急剧扩大，至第12 d分别达对照的35.17倍和56.17倍，T₃组仅在第6 d略高于对照，其余时间与对照无显著差异。从相同组织在不同处理条件下的铜含量变化中，可观察到相同处理条件下不同组织器官之间的铜含量差异。整体而言，根部是铜积累的主要部位，其铜含量在各处理中普遍高于其他组织；木质部铜含量相对最低，多数时间表现为低积累；叶片和树皮的铜含量介于根部和木质部之间，且在铜过量处理下，叶片铜含量在后期超过树皮，显示出更强的铜积累潜力。这些结果表明，各组织对铜的积累能力存在明显差异，且受外界铜质量浓度和处理时间的共同影响，其中根部表现出极强的铜储存能力，叶片在高铜胁迫下则显示较强的铜积累特性。

Figure 4.  Changes in copper content among various tissues of rubber tree plants under different copper treatments.

CK与T₁组在整个处理期间（3～12 d）的转运系数未出现显著变化，其值始终维持在1.0左右波动；T₂处理组的转运系数在处理第3 d，转运系数为1.28，与对照组无显著差异，至第6 d，其值显著下降至0.90，在第9 d和12 d，转运系数回升至1.05和1.74；T₃和T₄组在整个处理期间，其转运系数均保持在高位（T₃：1.89～2.43；T₄：1.67～1.92），且随时间推移未发生显著变化；T₅组的时间效应最为显著，在处理前9 d，转运系数维持在极高水平（2.33～2.03），然而，至第12 d，其值出现急剧且显著的下降至1.42。从浓度效应来看，在处理初期（3 d），T₃、T₄、T₅处理的转运系数均显著高于对照组；在第6 d和第9 d，浓度效应模式保持一致，T₃-T₅组的转运系数始终显著高于对照组；到12 d，浓度效应格局发生了关键变化，T₃和T₄组的转运系数（2.43，1.89）依然显著高于对照组，最高浓度处理T₅的转运系数（1.42）相较于前几个时间点自身大幅降低。

Figure 5.  Comparison of copper translocation factor in rubber tree plants under treatment at different copper concentrations.

本研究系统分析了不同铜处理浓度、胁迫时间与pH值处理方式对橡胶树幼苗根系与叶片形态、以及铜在根部、树皮、木质部和叶片中积累的动态影响。结果表明，橡胶树幼苗对铜胁迫的响应具有明显的组织特异性和时间-浓度依赖性，其形态与生理变化揭示了铜吸收、转运及毒害的关键过程。从形态学响应来看，根系和叶片对铜胁迫极为敏感。对照组（CK）及pH调控组（T₁）条件下根系保持白色健康状态，叶片未出现明显异常，说明单纯的pH值改变并未引发形态学方面的胁迫，这一结果与多数研究中植物对轻度pH波动具备较强耐受性的结论相吻合^[4]。

铜缺乏处理组（T₂）在试验后期出现了叶片黄化、叶尖干枯以及根系褐变等典型的缺铜症状，符合植物在铜匮乏时光合受阻和氧化胁迫加剧的典型症状^[30]。铜过量处理组（T₃-T₅）则产生了典型的剂量和时间依赖性毒害症状，特别是T₄和T₅组的根系从褐变逐渐发展为黑变，甚至出现腐烂现象，这是高浓度铜毒害的直接表现。高浓度的铜能够引发强烈的氧化胁迫，从而导致脂质过氧化、膜系统遭到破坏以及电解质外渗，最终致使细胞死亡和组织坏死^[7]。此外，铜离子可能会直接抑制根尖分生组织的活性，破坏细胞分裂和伸长功能，进而导致根系减少^[6]，叶片黄化加剧以及出现锈褐色斑块，同样是氧化损伤和叶绿体结构被破坏的结果^[4]，T₅组呈现出急性毒害效应，这意味着当环境中的铜质量浓度超出某一临界阈值时，橡胶苗的防御机制将会瓦解。游离脯氨酸作为植物重要的渗透调节物质，通过维持渗透平衡或细胞膨胀来提高植物胁迫耐受性，从而稳定膜结构，有效减少胁迫对植物造成的损害^[25]，它的积累动态为不同铜处理下橡胶苗的形态响应提供了生理学依据。结果表明，脯氨酸的积累模式与形态损伤的严重程度和发生时间高度一致，在T₂和T₃组中，脯氨酸的持续积累至第12 d达到峰值，为形态观察到的根系局部褐变和叶片轻度黄化等症状提供了内在依据，说明脯氨酸的合成被有效激活，以应对铜稳态失衡所造成的渗透压和氧化平衡挑，橡胶苗具备一定的耐受与适应能力^[31-32]。最具代表性的是T₄和T₅高铜胁迫组，其脯氨酸呈现“快速积累-下降”的特征性变化，尤其是T₅组在第6 d叶片脯氨酸含量急剧升至对照的6.01倍，充分反映了橡胶苗在急性毒害下的强烈生理应激，而峰值后的迅速下降，则从生理层面指示了细胞防御系统的崩溃^[33]，为橡胶苗根系大面积黑变、组织死亡以及叶片黄化加剧、出现锈斑和枯萎等不可逆损伤的最终定性结论提供了定量支撑。后续研究可将系统整合根系总长、根平均直径、叶面积等定量指标，以更深入地解析铜胁迫对橡胶树生长的影响机制。

本研究系统揭示了铜胁迫下的橡胶苗铜吸收、积累及转运特性，不同器官的响应特性存在显著差异，并体现出明显的浓度与时间依赖效应。在对照（CK）和pH调控（T₁）条件下，根部、树皮、木质部和叶片中的铜含量在整个试验期间基本保持稳定，且组间无显著差异，同时转运系数（TF）维持在1.0左右波动，表明在正常铜供应及一定pH波动范围内，植物体内铜稳态调控机制运行有效，能够维持铜含量的动态平衡^[1]，而单纯的pH值改变在并未引发不同器官铜含量和铜转运特性的变化^[4]。缺铜处理（T₂）下，橡胶苗根部与树皮中铜含量在胁迫后期显著下降，叶片中含量也明显降低，表明铜长期缺失情况下橡胶苗启动了资源再分配策略以优先保障关键生理活动；与之相应，T₂组的TF在处理第6 d时TF显著降至0.90，说明植物短期内抑制了铜向地上部的转运，以维持根系基本功能；而在第9～12 d，TF回升至1.74，可能与高亲和力铜转运蛋白（如COPT家族）表达上调有关，反映出植物为满足地上部代谢需求而增强铜吸收与转运的长期补偿机制^[34]。铜过量处理（T₄和T₅）显著促进了铜在各组织中的积累，尤以根部和叶片最为明显，且积累程度随胁迫浓度升高和处理时间延长而加剧，T₄和T₅处理下根部铜含量急剧上升，表明根部是过量铜的主要吸收和富集器官；树皮与木质部中铜含量的持续增加，说明铜过量时可向上运输；特别值得注意的是，T₄和T₅处理叶片中铜含量至第12 d时达到对照的35.17和56.17倍，揭示出铜已大量迁移至地上部，极可能引发严重的光合毒性及氧化损伤^[12]，而T₄组的转运系数在处理期间一直显著高于对照组，也证实了高铜时铜会向地上部运输，这可能源于根部积累饱和后的被动外排^[4]，相比之下，T₅组TF在前9 d处于极高水平（>2.0），但在第12 d急剧下降至1.42，说明长期高强度胁迫已导致根系转运功能严重受损，作为一种终极保护机制限制了铜向上运输的途径，标志着重度铜胁迫下植物生理功能的崩溃^[6]。T₃组的结果展现了一种典型的植物重金属“区隔化耐受”（separtitioning tolerance）策略，其根部铜含量在处理第6 d后达到稳定状态，可能是因为根系通过上调植物螯合素（phytochelatins，PCs）合成和液泡区隔化机制，将过量铜离子固定于根部细胞中，从而限制了其向细胞质关键部位的扩散^[1]；树皮和木质部中铜含量的显著积累，结合持续高于对照组的转运系数，说明铜离子能够向上转移，然而叶片铜含量始终未发生显著变化，这一现象揭示了橡胶苗体内存在保护机制，比如叶片通过调节木质部卸载效率和增强细胞壁固定能力，有效阻止了铜向光合组织的进入^[6]；这种将重金属限制在非光合器官而保护关键生理功能的策略，体现了橡胶苗在此浓度下维持生长与防御平衡的适应性机制^[7]。虽然T₃（6 mg·L⁻¹）下橡胶苗出现了根系褐变和叶片黄化表明橡胶苗确实遭受了胁迫，但没有出现像T₄和T₅（12～24 mg·L⁻¹）那样严重的坏死、黑化和叶片枯萎，说明造成的损伤是轻度的，并没有危及橡胶苗整体生存，因此，6 mg·L⁻¹在本试验条件符合耐受阈值特征，而高于12～24 mg·L⁻¹则导致铜向上运输失控，叶片铜含量急剧升高，造成不可逆的氧化损伤和组织坏死。综上，随着铜质量浓度的增加和胁迫时间的延长，橡胶苗根部铜含量显著增高且向地上部运输，尽管本研究对象为幼苗，尚未形成产胶的乳管系统，但根据转运趋势推测，在成龄橡胶树中，长期高浓度施用铜制剂可能导致胶乳中铜含量升高，后续研究可拓展至成龄树及胶乳中铜的积累动态加以验证，本次研究结果可为该方向提供基础数据支撑。并且，本研究首要目标是建立铜胁迫对橡胶树幼苗影响的基础数据库，明确单一主栽品种的响应规律是后续开展比较研究的前提。当然，未来若能引入对铜敏感性存在差异的不同种质资源进行对比研究，将能更深刻地揭示橡胶树种的铜耐受与排斥机制，为品种选育提供更为全面的理论依据。基于本研究结果，生产环境中高浓度的铜是可以通过根部吸收后向橡胶树地上部分运输的，土壤中过高浓度的铜可能会造成橡胶树胶乳中铜含量的升高影响胶乳质量，并有可能对橡胶树生长造成伤害。在长期使用硫酸铜的橡胶园、土壤酸化严重地区及土壤母质中铜含量高的地区，应定期监测土壤有效铜含量，防范性铜累积风险；在橡胶生产中的应加强铜营养的监测管理；在硫酸铜刺激剂使用中，必须严格将施用浓度控制在安全范围内，可以先通过小范围试验确定最佳用量，避免因盲目追求短期产量而导致铜在树体内累积；在幼苗培育阶段可将铜耐受性纳入品种选育指标，筛选培育具有较强铜排除或耐受能力的优良品种。

铜胁迫对橡胶苗的影响呈现浓度与时间依赖性，长期缺铜（0 mg·L⁻¹）诱发典型缺素症状（叶片黄化、根系褐变），短期缺铜抑制了铜向地上部的转运，以维持根系基本功能后向地上部转运满足代谢需求而增强铜吸收与转运的长期补偿机制；高质量浓度处理下（12～24 mg·L⁻¹）可引发根系黑变、叶片锈斑甚至死亡。根部作为初始屏障，通过固持大量铜来试图保护地上部，但随着胁迫的持续和强度的增加，根部的保护机制被突破，导致铜向地上部（尤其是叶片）的大量运输，研究确定0.1～6 mg·L⁻¹可为本试验条件下橡胶树幼苗的铜耐受浓度。