Effects of different nitrogen treatments on the fungal community in the root system and rhizosphere of the budded seedlings of rubber tree

本研究试验于2023年4月20日至2023年7月20日在海南省儋州市那大镇中国热带农业科学院试验场橡胶树籽苗芽接示范基地（北纬19°30′8″，东经109°29′40″）进行。

供试材料为橡胶树籽苗芽接示范基地内温室砂床生长3个月龄、炼苗完成且长势一致的橡胶树幼苗，品系为热研7-33-97，采用盆栽培育方式，使用基质为椰糠（广州启信环境科技有限公司），每盆中含干椰糠0.5 kg，椰糠的全氮、全磷和全钾含量分别为0.62%、0.03%、0.66%。缓苗1个月后进行试验处理。

早期研究发现，当土壤施氮量高于0.08 g/kg时，侧根数开始增加，当施氮量在0.64-1.28 g/kg时，侧根数达到最大量，但高于此浓度侧根数量则迅速下降^[25]。鉴于椰糠基质作为一种有机栽培基质，其物理结构（如孔隙度、持水性）和化学性质（如阳离子交换量CEC、本底养分矿化速率）与传统土壤存在一定差异，但目前鲜有针对椰糠基质氮肥施用的研究。因此，本研究在设计施氮量时，参考在土壤栽培体系中研究同类作物氮素需求的文献范围，采用单因素4水平设计，以不施氮肥为对照（CK），另设3个施氮水平处理，分别为低氮（LN）0.32 g/kg、中氮（MN）0.64 g/kg、高氮（HN）1.28 g/kg。采用水肥方式施肥，氮肥用尿素（N≥46%，海洋石油富岛有限公司），磷肥和钾肥用磷酸二氢钾（P₂O₅≥52%，K₂O≥34%，海南儋州），每个处理磷钾肥施用量相同，均为0.5 g/kg。每个处理3次重复，每个重复10盆，共30株橡胶苗。每株苗每两天浇水100 mL。

施肥处理后第90天进行整株橡胶苗及根际椰糠基质的采集，每个氮素梯度处理随机采集3株橡胶苗，使用灭菌不锈钢剪刀沿茎基部切断植株，通过抖落法收集距根系表面0-3 mm的根际基质，将5 g新鲜根际基质及部分根系分装至无菌冻存管，立即液氮速冻后转移至−80 ℃超低温冰箱，后续用于测量微生物指标。盆栽所用的椰糠基质将同一处理的3株苗培养基质混匀，按四分法取500 g椰糠样品装入自封袋带回实验室。

（1）根系形态指标：利用纯水清洗干净根系表面的附着椰糠基质，用吸水纸吸干表面水分，利用WinRHIZO（杭州万深检测科技有限公司，浙江）图形分析软件测定橡胶幼苗根系根长、根体积、根表面积等根系形态指标，具体操作如下：将橡胶苗根系均匀铺在装有少量纯水的根系扫描仪扫描盘中，避免橡胶根系交叉及重叠，扫描图片设定分辨率为300 ppi，扫描面积长宽分别为50 cm、30 cm，扫描完成图片用WinRHIZO图形分析软件进行测量根系形态指标。

（2）将椰糠基质70 ℃恒温烘干至恒重后用磨样机磨成粉末，用于养分含量的测量。磨好的粉末称取0.06 g-0.07 g利用H₂SO₄-H₂O₂消煮法+AA3流动注射分析仪法测定样品的氮、磷含量，H₂SO₄-H₂O₂消煮法+火焰光度计法测量样品的钾含量^[26]。

（3）根际微生物样品处理：将上述处理后的无菌冻存管中，挑出橡胶苗根系放入保温盒中进行保存，去除椰糠基质中的其他植物根系、动物残骸及杂质，20目筛网（孔径0.85 mm）过筛处理，然后将样品混合均匀，全部保存在无菌离心管中。低温运至实验室置入干冰后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序,通过Illumina Mi Seq平台上进行等摩尔和配对测序。

（4）根系微生物样品处理：将（3）处理中的橡胶苗根系在实验室用无菌刷轻轻刷去根系表层附着的椰糠基质，将根系置于无菌离心管中，浸没于无菌PBS溶液，180 rpm清洗20 min；用无菌镊子取出根系组织，将根系再次置于无菌离心管中加入无菌PBS溶液，180 rpm清洗20 min；取出根系组织，将根系再次置入无菌离心管中加入无菌PBS溶液，超声波洗涤10 min（160 W，30 s/30 s）。将三次洗涤液置于无菌离心管中，用12000 g离心10 min，收集沉淀并至于−80 ℃冰箱保存，将根表微生物取样后的根系用无菌棉吸干水分，放入离心管中，后将保存沉淀及根系无菌离心管放入保温盒中并置入干冰后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序，通过Illumina Mi Seq平台上进行等摩尔配对测序。

采用Excel 2010软件进行数据统计，运用R统计软件（版本3.4.2）中“vagen”包的Bray-Curtis距离算法对细化后的OTU数据进行主坐标分析（PCoA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）（p<0.001），确定不同施氮水平下根系及根际真菌β多样性，揭示不同氮水平和不同区域对橡胶苗真菌落差异的解释度及显著性。应用R统计软件中“vagen”包进行Mantel分析不同氮水平真菌群落与橡胶苗根系形态指标及椰糠基质养分的关系，确定对根系及根际真菌群落有较大影响的指标。橡胶苗根系及根际真菌α多样性指标（香农指数等）通过SPSS 17.0中用Duncan检验进行方差分析（p<0.05）检验处理效果。用R统计软件（版本3.4.2）中“ggplot2”包进行数据可视化作图。

不同施氮水平对橡胶苗根系形态指标影响较大（表1），其中CK处理根长最长，达823.30 cm，较HN处理增加18.51%。根系表面积在CK处理最大，达176.09 cm²，较HN处理提升26.36%。根体积随着施氮量增加，根体积持续下降，在CK处理最大（9.38 cm³），其中LN、MN、HN处理较CK处理分别显著下降28.15%、34.89%、40.91%。综上所述，不同施氮水平显著影响橡胶苗根系形态，随着施氮水平的增大，根系形态指标均呈下降的趋势，其中高氮处理对根系生长产生强烈抑制作用。

由表2可知，椰糠的钾含量受施氮水平的影响较小，椰糠氮含量随施氮水平的增大而上升，在HN处理最大（1.12%），分别较CK、LN、MN处理显著增加51.35%、45.46%和12%。椰糠磷含量随施氮水平的增加呈不断下降趋势，在CK处理最高（0.07%），CK较HN显著提升40%。因此，随施氮水平的增大，椰糠氮含量不断提高，椰糠磷含量逐渐降低。

对根系和根际椰糠样品进行高通量测序，根系和根际的真菌样品共有1018个OTUs。由图1（A）可知，各氮水平橡胶根系样本门水平优势菌门均包括：子囊菌门（Ascomycota，82.34%～90.84%）、未分类的真菌（unclassified-Fungi，6.60%～9.88%）、担子菌门（Basidiomycota，1.91%～9.04%）。其中子囊菌门群落组成随着施氮水平的上升呈现先减少后增加的趋势，在HN处理物种丰度达到最大（90.84%），HN处理较LN处理丰度显著增长10.32%（p<0.05）。担子菌门随着施氮水平的上升呈现先增加后减少的趋势，且在LN最高（9.04%），LN处理较MN、HN处理分别提高2.84倍、3.73倍（p<0.05）。球囊菌门（Glomeromycota，0.0033%～0.25%）在CK处理最大（0.25%），LN、MN与HN较CK处理显著降低98.69%、98.17%、98.05%（p<0.05）。

Figure 1.  Fungal community composition at the phylum/order level in the roots of rubber budded seedlings under varied nitrogen treatments

在目水平方面（图1B），各施氮水平橡胶根系样本中优势菌目包括：肉座菌目（Hypocreales，28.77%～52.14%）、粪壳菌目（Sordariales，8.24%～56.76%）、未分类的真菌（unclassified-Fungi，6.60%～9.88%）、糙孢孔目（Trechisporales，0.40%～8.01%）、酵母菌目（Saccharomycetales，0.68%～5.17%）。其中，肉座菌目相对丰度随着施氮增加总体呈下降的趋势，CK处理最大（52.14%），且CK处理与LN、HN处理有极显著差异（p<0.01）、与MN处理有显著差异（p<0.05），CK处理较其他处理显著提升29.00%-81.20%。粪壳菌目相对丰度随着氮水平的增大呈上升趋势，在HN达到最大（56.76%），且HN与CK、LN、MN有极显著差异，HN较CK、LN、MN显著增长589%、57.93%、38.79%（p<0.01）。糙孢孔目相对丰度随着施氮水平的增加先升高后降低，在LN取得最大（8.01%），且LN处理与其他处理有极显著差异（p<0.01），LN处理较其他处理增大1.36-19.00倍。综上可以看出，中低氮水平（LN）维持担子菌门和糙孢孔目优势地位，而高氮处理（HN）使子囊菌门与粪壳菌目显著提高。

不同施氮水平对橡胶苗根际真菌群落组成也有较大影响（图2）。如图2（A）所示，各施氮水平橡胶苗根际样本中优势菌门均包括：子囊菌门（Ascomycota，79.57%～90.89%）、未分类的真菌（unclassified-Fungi，3.72%～18.54%）、担子菌门（Basidiomycota，0.94%～5.09%）。其中，子囊菌门丰度随着施氮浓度的增加呈现先减少后增加的趋势，但各处理间无显著差异。随着施氮浓度的增加，未分类的真菌丰度呈先上升后降低的趋势，在LN处理达到最大（18.54%），LN较CK处理增长了3.99倍（p<0.05）。而担子菌门丰度随着氮水平的增加呈现不断减少的趋势，在CK处理最高（5.09%）且与MN处理存在显著性差异，MN较CK处理减少81.46%（p<0.05）。球囊菌门（Glomeromycota，0.0017%～0.14%）在CK处理最大（0.14%），LN、MN与HN较CK处理显著降低86.01%、94.09%、98.80%（p<0.05）。

Figure 2.  Fungal community composition in the rhizospheres of rubber budded seedlings under varied nitrogen treatments

在目水平方面（图2B），各根际样品目水平优势菌目包括：粪壳菌目（Sordariales，37.03%～52.50%）、肉座菌目（Hypocreales，14.32%～35.82%）、未分类的真菌（unclassified-Fungi，3.72%～18.54%）、环孢菌目（Atractosporales，0.75%～6.82%）、环囊菌目（Annulatascales，0.05%～4.55%）。其中，随着施氮水平的提高，粪壳菌目丰度先减少后增加，但无显著性差异。肉座菌目丰度呈先增大后减小趋势，且在MN处理最高（35.82%）。CK与LN、MN、HN处理存在显著性差异（p<0.05），其中MN与CK存在极显著差异（p<0.01），LN、MN、HN较CK处理分别显著增长86.07%、150.18%和83.21%。未分类的真菌随着氮水平的增加丰度先增加后减少，在LN处理达到最大（18.54%），LN处理与CK有显著性差异（p<0.05），LN较CK处理增长3.99倍。环孢菌目相对丰度随着氮水平的增加先减后增在HN处理达到最大为6.82%，HN处理与MN存在显著差异，HN较MN处理增长8.13倍。环囊菌目丰度随氮水平的增加先增加后减少，在LN取得最大（4.55%），LN与MN处理有极显著差异（p<0.01），MN较LN处理减少91.09%。综上所述，中低氮处理（LN-MN）增大根际未分类真菌与肉座菌目的相对丰度，高氮则显著抑制担子菌门与环囊菌目的丰度。

不同施氮水平对橡胶根系与根际真菌α多样性有较大影响。其中香农（Shannon）指数和辛普森（Simpson）指数代表真菌多样性，其数值越大真菌多样性越高。在香农指数方面（图3），橡胶苗根系真菌的香农指数随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，在LN处理最高（3.22），LN较CK、MN、HN处理显著提升18.82%、12.13%、14.82%（p<0.05，下同）。橡胶苗根际真菌的香农指数随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，在LN处理最大（3.13），但各处理间无显著性差异，LN较CK处理增长了18.11%。

Figure 3.  Shannon index of fungi in roots and rhizosphere under different nitrogen treatments

在辛普森指数方面（图4），橡胶苗根系及根际真菌的辛普森指数随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，橡胶苗根系真菌的辛普森指数在LN处理最大（0.904），LN、MN、HN分别较CK处理显著增长了12.26%、9.01%、8.42%。橡胶苗根际真菌的辛普森指数在LN处理最高（0.914），LN较CK处理的辛普森指数增长了16.46%。综上所述，橡胶苗根系与根际真菌的香农和辛普森指数都随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，而且都是在LN处理（0.32 g/kg）达到峰值。

Figure 4.  Simpson index of root and rhizosphere fungi under different nitrogen treatments

Chao1指数与ACE指数代表真菌丰富度，其数值越大物种丰富度越高。根系真菌的Chao1指数受氮素影响较大（图5）。橡胶苗根系真菌的Chao1指数随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，在LN处理最大（385.97）。LN、MN、HN处理橡胶苗根系真菌Chao1指数分别较CK处理显著增大了1.16倍、1.01倍、1.03倍（P<0.05，下同）。橡胶苗根际真菌的Chao1指数随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，在MN处理最高（393.65），LN、MN、HN处理橡胶苗根际真菌Chao1指数较CK处理显著增大了72.01%、85.70%、76.15%。

Figure 5.  Chao1 index of fungi in roots and rhizosphere under different nitrogen treatments

ACE指数随施氮水平的提升变化明显（图6），橡胶苗根系真菌的ACE指数随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，在LN处理达到峰值（391.43），LN、MN、HN处理根系真菌ACE指数较CK处理分别显著增大1.27倍、1.14倍、1.13倍。橡胶苗根际真菌的ACE指数随着施氮水平的增加呈现先增大后减少的趋势，在MN处理最大（379.90），LN、MN、HN处理根际真菌ACE指数较CK处理分别显著增大68.61%、78.02%、77.49%。

Figure 6.  ACE index of fungi in roots and rhizosphere under different nitrogen treatments

综上所述，橡胶苗根系与根际真菌的Chao1和ACE指数随着施氮水平的增加都是呈现先增大后减少的趋势，CK处理都显著低于其他施氮处理，中氮水平（LN）处理显著提升橡胶苗根系与根际真菌群落丰富度，其Chao1与ACE指数较CK处理增幅达68.61%-127%。

距离矩阵与主坐标分析结果显示坐标轴所能解释的样本差异数据（距离矩阵）的比例为60.04%。不同施氮水平处理的根系及根际真菌分开聚集，其中LN、MN、HN处理聚集的更加明显，可见这三个处理的根系与根际真菌β多样性更加相似，CK与其它三个处理的相较远（图7）。置换多元方差分析（PERMANOVA）结果显示，不同施氮处理之间β多样性有极显著差异（p<0.001，R²=49.10%），根系与根际真菌β多样性也存在极显著差异（p<0.001，R²=16.65%）。不同施氮水平R²值大于不同区域的R²值，可以推测出橡胶苗根系及根际真菌β多样性受不同施氮量影响大于不同区域的影响。不同施氮水平对根系真菌和根际真菌β多样性都有极显著差异（p<0.001），根系真菌R²值为67.94%，根际真菌R²值为74.01%，根际真菌的R²值更大，说明不同的施氮水平对根际真菌β多样性的影响比对根系真菌的影响要更大。综上所述，不同施氮水平和不同区域位置对橡胶根系与根际真菌β多样性都存在极显著差异，且不同施氮水平影响更大；不同施氮水平使根系与根际真菌β多样性均存在极显著差异，且在根际中的影响大于在根系真菌。主成分分析表明，施氮处理（LN-HN）的菌群呈现趋同性聚类，而缺氮对照处理（CK）形成独立分支；根际真菌群落对氮素响应敏感性高于根系真菌，表现为R²差值达6.07%。

Figure 7.  Beta diversity analysis of fungi in root and rhizosphere of rubber budded seedlings under different nitrogen treatments

通过不同施氮水平下橡胶苗根系真菌门水平与根系形态、椰糠基质养分含量的相关性分析可以看出（图8），球囊菌门与根体积极显著正相关；担子菌门与椰糠基质氮含量极显著负相关，随着施氮水平的提升担子菌门相对丰度呈下降趋势；被孢霉门与椰糠基质钾含量呈显著负相关。在根际真菌门水平方面（图9），壶菌门与椰糠基质氮含量显著负相关；担子菌门与根体积显著正相关；球囊菌门与椰糠基质钾及磷含量、根体积显著正相关，与椰糠基质氮含量极显著负相关。氮是影响根系及根际门水平真菌群落的重要因素，显著影响担子菌门、壶菌门与球囊菌门。

Figure 8.  Correlations of root fungal phyla with root morphology and coir dust substrate nutrients under varied N application levels

Figure 9.  Correlations of fungal phyla in the rhizosphere with root morphology and coir dust substrate nutrients under different N treatments

通过不同施氮水平下橡胶苗根系真菌目水平与根系形态、椰糠基质养分含量的相关性分析可以看出（图10），糙孢孔菌目与椰糠基质氮含量极显著负相关；肉座菌目与基质钾含量极显著正相关，与根体积显著正相关，与基质氮含量显著负相关；粪壳菌目与椰糠基质氮含量极显著正相关，与基质钾含量极显著负相关，与根体积显著负相关。在根际真菌目水平方面（图11），比索孢菌目与椰糠基质磷含量显著负相关；肉座菌目与椰糠基质氮含量显著正相关；环囊菌目与椰糠基质磷含量显著正相关，与椰糠基质氮含量显著负相关。

Figure 10.  Correlations of root fungal orders with root morphology and coir dust substrate nutrients under different N treatments

Figure 11.  Correlations between rhizosphere fungal orders, root morphology, and coir dust substrate nutrients under different N treatments

影响真菌群落组成的因素很多，如土壤类型^[27]、土壤理化性质和植被类型^[28]等。施氮可以改变根系与根际真菌的多样性、丰度和群落结构^[29]，导致特定真菌富集，从而改变真菌群落的结构^[30]。本研究中不同施氮水平下橡胶苗根系与根际真菌群落组成存在显著性差异；在门水平上，在根系与根际均检测到2个优势菌门，即子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），分别占根系与根际真菌总丰富度的89.74%～92.96%和81.29%～95.98%。这与前人在土壤真菌微生物的研究结果一致^{[31, 32]}。这可能是以上主要菌门是土壤真菌群落的核心优势类群，具有极强的环境适应性，施氮引起的环境变化可能更有利于这两大类群中特定耐受性或偏好性菌株的生长与竞争，使其在群落中占据绝对主导地位，而非优势菌门则受到抑制。

有研究表明子囊菌门的丰度主要受土壤中氮含量的调节^[33]，与低施氮水平相比，高施氮水平增加了子囊菌门的相对丰度^[34]，但该结果与本试验结果存在差异。在本研究中，随着施氮水平的增加橡胶苗根系与根际中子囊菌门的相对丰度均呈现先减少后增加的趋势，一方面可能是少量氮素的输入刺激部分竞争性更强的腐生真菌（如担子菌门Basidiomycota）的生长，导致子囊菌的相对丰度被稀释；另一方面可能是在低氮水平下，橡胶苗根系分泌物会富集担子菌门，而土壤中微生物间的竞争排斥作用导致子囊菌门的相对丰度降低^[35]。本实验结果显示随着氮素水平的增加根系真菌担子菌门的相对丰度呈现先增加后减少的趋势，与子囊菌门变化趋势正好相反，这与上述竞争作用相一致。也有研究发现，高产橡胶林中担子菌门的相对丰度高达82.92%，显著高于其他橡胶林，而子囊菌门和被孢霉门的相对丰度则显著降低，这在一定程度上有利于橡胶树的生长和胶乳产量^[36]。本研究试验中低氮处理时根系与根际真菌担子菌门最高，而子囊菌门最低。因此，低氮处理的幼苗可能有高产潜力。

土壤微生物多样性在维持土壤功能方面起着至关重要的作用。微生物多样性的丧失会对土壤肥力、有机质含量和生物防治产生不利影响，从而降低土壤的多功能性^{[19, 37]}。研究表明，作物土壤微生物群落的差异可能与土壤的理化性质、作物的品种和栽培方式有关^[38]，不同管理措施、植被类型、土壤肥力、pH、温度和降水等综合因素的改变会对真菌群落组成及其多样性产生一定的影响^[39]。Sun等^[40]关于长期施用化肥对土壤真菌群落影响的研究发现，施肥会增加土壤真菌多样性，这与本研究结果存在一定的差异。本研究真菌群落的多样性指数（如香农指数等）呈现先增大后减少的趋势，这可能是由于本试验周期仅有3个月，试验处理时间较短，真菌群落变化在短期内不稳定，存在波动的情况。α多样性主要受两个方面的因素影响：其一是种类数目，即种群的丰富度；而另一个是多样性，其反映了群落中个体分配的均匀性。与群落丰富度相关的指数主要包括Chao1指数和ACE指数。群落多样性的指数包括香浓指数和辛普森指数。其中，Chao1和ACE指数越大，代表群落的丰富度越高。香浓和辛普森指数越高，说明群落的多样性越高。施氮对根系与根际真菌多样性有显著影响，施氮显著增大了Ace和Chao1指数，表明施氮增加了群落丰富度^[41]，Liao等^[42]发现适量施氮使土壤真菌Chao1指数最高，与本研究结果相同，这一方面可能是由于低氮土壤中，真菌群落受氮饥饿抑制，适量施氮解除营养限制，激活更多稀有和休眠真菌（如子囊菌门等），显著提升丰富度，另一方面，可能由于氮素的输入促进橡胶苗根系生长，使根系分泌物增多，使更多种类的真菌富集，增加了群落丰富度。本研究表明，随着施氮水平的提高，根系及根际真菌的香浓指数和辛普森指数呈现先增大后减少的趋势，LN处理显著高于CK处理，且都是在LN处理最高，这说明不施氮肥和过量施氮肥都会降低橡胶苗根系与根际的真菌群落物种多样性。这与刘思博^[43]等在不同浓度氮肥对首年紫花苜蓿产量及其根际土壤真菌群落结构的影响研究中的结果一致。出现该现象的原因可能是由于少量氮输入缓解绝对氮饥饿状态，激活更多寡营养型真菌（如AMF、部分子囊菌等）；另一方面，可能在低营养压力下无单一菌群垄断资源，竞争排斥减弱，允许稀有菌种共存。综上所述，适量施氮（LN）可以增加橡胶苗根系与根际真菌群落的多样性，使橡胶苗根系生长环境更加适宜，促进根系生长进而促进橡胶苗对于土壤中养分的吸收，加强地上部分的生长，光合作用增强，最终导致橡胶苗养分吸收与积累增大，起到橡胶苗壮苗的目的，使其有更高的发展潜力。

施氮水平显著影响橡胶苗根系与根际真菌群落的组成及多样性。在根系真菌方面，施氮水平提升显著增大子囊菌门相对丰度；而担子菌门在低氮处理（0.32 g/kg）达到峰值。同时，橡胶苗根系与根际真菌群落多样性均在低氮处理最大，真菌群落丰富度也是施氮处理显著高于不施氮处理。不同施氮水平对根系真菌与根际真菌β多样性都存在极显著差异，且受不同施氮水平影响大于在不同区域的影响，不同的施氮水平对根际真菌β多样性的影响比对根系真菌的影响更大。相关性分析表明基质氮含量是影响根系及根际门水平与目水平真菌群落的重要因素。因此，在椰糠基质盆栽培育橡胶苗的生长初期（3-6月）采用低氮处理对提高根系与根际真菌多样性均有较好的效果。本研究的结论在一定程度上受到以下因素的限制：试验周期短、试验品种单一，以及环境因子（如温湿度）波动对微生物群落的潜在影响。同时，本研究基于椰糠基质自身养分特性进行的施肥设计尚有优化空间。因此，后续长期、多品种的研究，并结合环境因子监控与动态施肥策略，以获得更普适的结论。