Gene cloning and injury-induced expression pattern analysis of CNTPS18 gene in Chi-Nan germplasms (Aquilaria sinensis)

本研究的植物材料为中国医学科学院药用植物研究所海南分所（E110^o 25'，N20^o 01'）的海口试验地中培育的白木香种质（包括奇楠种质与普通种质），经魏建和研究员鉴定为白木香种质。EASYspin Plus Plant RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根生化）；TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit，pEASY Blunt Simple Cloning Kit，pEASY-T1 Cloning Vector，TransStart Top Green qPCR SuperMix，6×DNA Loading Buffer，2×Ex Taq PCR Super Mix，DNA Marker 2000，DNA Marker 10000（北京全式金生物）；GoldView I（10000×）（北京索莱宝科技）；Agarose（西班牙Biowest公司）；TAE溶液（50×）（合肥兰杰柯科技）；硫酸卡那霉素，IPTG，X-Gal（上海麦克林生化）；Yeast Extract（美国赛默飞世尔）；无水乙醇（广东西陇化工）；化学试剂为分析纯，引物委托生工生物合成（表1）。

取1 ml裂解液RLT和100 μl PLANTaid至装有样品粉末的2 ml RNase free离心管内，立即剧烈振荡混匀。混合物在冰上静置15 min左右，期间颠倒两到三次，充分裂解；裂解充分后，4 ℃条件下，13000 rpm离心10 min；小心吸取上清液加到新的离心管中，加入上清液一半体积的无水乙醇，吹打混匀；取700 µl的混合液至DNA消除柱中，4 ℃条件下，13000 rpm离心1 min，去废液；4 ℃条件下，13000 rpm空离心1 min，将DNA消除柱转入新的离心管中，加入500 μl RLTplus，13000 rpm离心2 min，收集滤液；加入250 μl无水乙醇，并吹打混匀，将混合液加入吸附柱RA中，4 ℃，13000 rpm离心1 min，去废液；再加入700 µl去蛋白液Rwl和500 µl漂洗液清洗吸附柱RA，最后加入85 ℃预热的RNase-free H₂O，室温放置1 min后，4 ℃，13000 rpm离心1 min，重复一遍此步骤即得到总RNA溶液。用1%（w/w）琼脂糖凝胶，1×TAE稀释液为缓冲液，90 V电压下电泳20～25 min，紫外灯下观察RNA的条带完整性。利用分光光度计检测RNA的浓度及质量，当2.2≥OD_260/280≥2.0，OD_230/260≥1时，说明样品RNA合格。

奇楠种质中提取的总RNA样品通过TransScript反转录试剂盒合成第一链cDNA，20 μL反应体系如下：1 μg总RNA，10 μL 2×RT Reaction buffer，1 μL gDNA Remover，1 μL oligo dT Primer mix，1 μL Starscript II RT Mix，补充ddH2O至20 μL。整个体系于42 ℃反应15 min，85 ℃热激5 s失活酶，4 ℃冷却。cDNA保存于−20 ℃备用。

根据白木香与奇楠种质转录组测序数据得到的白木香AsTPS18基因全长序列信息，利用Primer Premier 6软件设计引物进行实验。以上述反转录得到的cDNA为模板，以特异性引物CNTPS18-cloning为引物，进行PCR扩增。20 μL反应体系如下：模板cDNA 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，加ddH2O至20 μL。反应程序为95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，以上程序进行35个循环，72 ℃延伸5 min。PCR扩增得到的目的片段经1%（w/w）琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收，连接至T载体，转化至大肠杆菌Trans T1感受态细胞中，利用蓝白斑筛选转化成功的菌体, 挑选阳性单克隆复苏后在37 ℃摇床过夜培养, 经菌落PCR验证后送菌液测序，测序工作由武汉天一华煜基因科技有限公司完成。

利用软件DNAman对氨基酸序列进行ORF （Open Rending Frame） 预测；使用在线软件Expasy ProtParam和Expasy ProtScale （https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/）分析预测蛋白质的基本理化性质；使用在线网站InterPro （https://www.ebi.ac.uk/interpro）分析氨基酸序列的保守结构域；使用在线分析软件Sopma对蛋白质进行二级结构预测；使用在线分析软件SWISS-MODEL进行蛋白质的三维结构预测；使用在线分析软件SignalP-6.0 Server （https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）分析相应信号肽，使用在线软件TMHMM 2.0对蛋白质进行跨膜结构预测，使用在线网站Wolf Psort （https://wolfpsort.hgc.jp/）分析蛋白质的亚细胞定位；使用在线软件NetPhos3.1预测蛋白质的潜在磷酸化位点；使用软件DNAman对氨基酸序列进行多序列比对，并用MEGE 11软件建立进化树以分析不同物种间的进化关系。

选取奇楠种质三年生生长良好、直径为1.5±0.2 cm的侧枝, 5 mm钻头进行钻孔伤害处理，钻孔贯通茎干，孔与孔间距2 cm。在钻孔处理后的0 h、6 h、1 d、7 d、15 d和30 d收取样本，每个时间点取三个生物学重复，从茎干剪取包括三个孔的长8 cm的茎干，剥皮后迅速浸入液氮中，−80 ℃保存备用。从奇楠种质样品中提取总RNA并反转录合成第一链cDNA。以上述样品cDNA为模板，选择表达量相对稳定的管家基因GAPDH基因为内参基因，0 h样本为对照，在实时荧光定量PCR仪（LC 96，Roch）进行qRT-PCR检测，引物信息见表1。预计GAPDH基因扩增片段大小在200 bp左右；目的基因 CNTPS18扩增片段大小为250 bp左右。反应程序为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40个循环后利用熔解曲线检验扩增产物的特异性。采用2^−ΔΔCT法计算CNTPS18基因相对表达水平^[17]，并使用t检验比较数据间的差异。

从白木香基因组中提取得到AsTPS18基因序列，依据该序列在奇楠种质中进行克隆，成功扩增出一条长为1632 bp的基因序列（基因号：PV764648）（图1），经测序验证确认序列与白木香中AsTPS18基因序列一致，一致率为92.98%。序列对比后发现，CNTPS18相较于普通白木香种质中的TPS18序列，共有131个单碱基变异，其中59个为同义突变，62个为非同义突变，这些突变有可能导致CNTPS18与AsTPS18编码蛋白的酶活性和催化产物的不同（图2）。

Figure 1.  Electropherogram of the full-length sequence of CNTPS18

Figure 2.  Comparison of the full-length sequence of CNTPS18 with that of ASTPS18 of ordinary Aquilaria sinensis

ORF预测显示CNTPS18序列是一个完整的开放阅读框，包含543个氨基酸（图3）。蛋白质理化性质分析表明，该蛋白分子式为C₂₈₄₃H₄₄₄₇N₇₄₁O₈₃₂S₁₇，蛋白质的分子量为62.865 KDa，等电点为5.36；蛋白带有81个负电荷残基和63个正电荷残基，在大肠杆菌中的半衰期大于10 h；蛋白不稳定系数为41.93，属于不稳定性蛋白。Expasy ProtScale预测显示，该蛋白的亲疏水指数范围为−2.622至2.356，总平均亲水性为−0.292，序列在第267位表现出较强的疏水性，在第448位表现出较强的亲水性，属于亲水性蛋白（图4）。

Figure 3.  The sequences of CNTPS18 cDNA full-length and predicted amino acid

Figure 4.  The hydrophilic-hydrophobicity analysis of CNTPS18 encoded protein

InterProScan预测该蛋白的保守结构域有Terpenoid cyclases/protein prenyltransferase（15～212），Terpene synthase, N-terminal domain（16～191），Isoprenoid synthase domain superfamily（15～52，216～526），Terpene synthase, N-terminal domain superfamily（53～215），Terpene synthase family，metal binding domain（246～486），Terpene cyclase-like 1, C-terminal domain（217～540）, Terpene synthase-like（4～523）, Terpene cyclases, class 1, plant（7～539 ）（图5-A），表明该蛋白是一个高度保守的酶蛋白，证实该蛋白属于萜烯合成酶/环化酶家族。Sopma预测二级结构预测该蛋白主要含有α螺旋，无规则卷曲，延伸链。其中α螺旋含量最高，有70.53%；无规则卷曲次之，有27.07%。α螺旋和无规则卷曲在整个氨基酸序列都有分布，延伸链穿插在序列的前后半段部分（图5-B）。CNTPS18编码蛋白的三级结构结果显示，CNTPS18蛋白与A0A411G8M5.1.A蛋白Vetispiradiene synthase一致性85.27%，GMQE值为0.94（图5-C），建模可信度较高（图5-D）。

Figure 5.  Conserved structural domains and structure prediction of CNTPS18 encoded protein

信号肽预测结果表明，CNTPS18蛋白不存在潜在的信号肽剪切位点，为非分泌蛋白（图6-A）；跨膜结构预测结果表明，该蛋白无跨膜结构（图6-B）；亚细胞定位预测该蛋白主要分布在细胞质基质（cyto=9）中，可能在细胞核（nucl=3）中也有少量分布，推测其可能为胞内蛋白。磷酸化位点在线预测显示 CNTPS18蛋白具有9个酪氨酸（Tyr）、17个苏氨酸（Thr）和19个丝氨酸（Ser）潜在磷酸化位点（图6-C）。

Figure 6.  The signal peptide, transmembrane structure and phosphorylation site of CNTPS18 encoded protein

将CNTPS18氨基酸序列进行多序列比对（图7-A），结果发现，CNTPS18与马来沉香（Aquilaria malaccensis）、榴莲（Durio zibethinus）、美国山核桃（Carya illinoinensis）、泡核桃（Juglans sigillata）和哥伦比亚锦葵（Herrania umbratical）等物种相似，其序列一致性均在71.11%以上。系统发育树显示，CNTPS18与马来沉香（Aquilaria malaccensis）和Aquilaria agallochum的倍半萜合酶、榴莲（Durio zibethinus）和哥伦比亚锦葵（Herrania umbratica）的反式大根香叶烯D合酶、巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）的萜类合酶聚为一支，可见这些酶蛋白高度同源，亲缘关系更近。

Figure 7.  Aligment of amino acid sequences and phylogenetic tree of CNTPS18

实时荧光定量PCR技术检测CNTPS18在奇楠种质和普通白木香伤害诱导表达特征。研究发现，CNTPS18在所有组织中都有表达，但表达水平各不相同。CNTPS18在茎中的表达水平最高，其次是根和果实，最低的是叶和种子（图8-A），这表明CNTPS18可能在沉香形成过程中起到了关键作用。通过检测奇楠种质伤害诱导后CNTPS18的表达水平，结果表明，CNTPS18在奇楠种质伤害诱导结香15 d后高度表达，协助奇楠种质稳定积累次生代谢产物抵御伤害胁迫（图8-B）。

Figure 8.  Tissue specific expression and injured induction expression characteristic of CNTPS18.

倍半萜是植物的一种重要的次生代谢产物，可以协助植物抵御生物或非生物的外界胁迫^[16]。而在整个倍半萜类成分的生物合成途径中，倍半萜合酶的参与至关重要^[15]。国内外研究者往往聚焦于农作物、水果和药用植物中倍半萜合酶基因的分子克隆和功能表征，以探索其在植物逆境胁迫下的功能和作用机制^[17]。

一般认为，植物萜类合酶分为Tpsa-Tpsg七个亚家族^[18]。倍半萜合酶主要属于Tpsa亚族，其他亚族较少分布。Li等^[19]对白木香中的TPS基因家族进行了鉴定，共获得了分布在五个亚组中的26条TPS基因，其中有16个成员分布在TPSa，占家族成员的半数以上，这表明沉香中萜类成分主要以倍半萜为主。因此，本研究克隆了一条奇楠种质结香过程中重要的倍半萜合酶CNTPS18。该蛋白的理化性质分析表明其为胞内酶蛋白，在细胞质基质中发挥作用，与沉香木质部细胞内充满油脂的显微观察现象互相印证。保守结构域与系统发育树分析显示，CNTPS18蛋白序列高度保守，其与多种同源的植物倍半萜合酶属于Tpsa亚族，序列一致性很高；同时结构预测结果表明其与一种螺环二烯合成酶Vetispiradiene synthase结构高度吻合，推测其具有环化萜烯化合物的功能，主要合成双环倍半萜。另外，相比于AsTPS18，CNTPS18序列具有62个非同义突变，可能导致了TPS18蛋白在不同种质间的活性差异，但其保守结构域与三级结构等预测结果并未表现出差异，后续可以通过体外酶催化等实验，结合倍半萜生物合成通路，进一步探究奇楠种质产生高品质沉香过程中的分子调控机制。

萜类化合物在植物生长、发育和胁迫响应等生理过程中具有关键作用，尤其是其在植物对生物与非生物的防御机制的广泛参与，是植物对抗逆境胁迫的常用手段^[20]。Yu等^[21]在铁皮石斛中发现了涉及四个亚科（TPS-a，TPS-b，TPS-c和TPS-e/f）的34个DoTPS基因，其中大多数基因主要在花中表达，其次是根和茎。受到寒冷和渗透胁迫后，大多数DoTPS基因的表达均得到增强。Zhao等^[22]鉴定并命名了153个小麦的TaTPS基因，转录组得出的表达谱表明，小麦对害虫（如蚜虫）的防御反应可以启动TaTPSs基因过表达，且主要通过激素途径。奇楠种质作为白木香一种新化学型种质，因其结香早、结香快、结香质量高的特性而被种植者青睐，其更优良结香性能的分子作用机制也逐渐被关注和挖掘。目前的研究已经证实，沉香特征成分生物合成相关通路的基因表达在高质量奇楠沉香形成过程中具有重要作用^[23]。本研究通过检测奇楠种质各组织中CNTPS18的表达水平，并对伤害诱导30 d的奇楠种质进行qRT-PCR检测，发现CNTPS18在沉香形成部位（根和茎）高度表达，显著超过其他部位组织，且与其他作物或药用植物的表达模式相近，主要在防御反应中后期（15 d之后）开始大量积累倍半萜类物质，推测其在沉香形成过程中发挥重要作用。

本研究通过对奇楠种质CNTPS18和普通白木香种质AsTPS18基因的序列比对和生物信息学分析，为后期研究奇楠种质结香过程中的转录因子调控机制，解析倍半萜合酶基因的功能奠定基础。同时，本研究结果将为深入研究奇楠种质与普通白木香结香性能差异调控机制，并为今后高品质沉香的生产提供理论依据。