Effects of temperature and light on the growth and pigment levels of Kappaphycus alvarezii

本试验所用的长心卡帕藻材料为2024年5月采集于海南省陵水黎族自治县黎安潟湖，运至海南省海洋与渔业科学院琼海科研基地，在配套循环水设施的方形水泥池中暂养7 d，水泥池规格为10 m×1 m×1.5 m，日循环水量70%以上。暂养期间水温为27～29 ℃，盐度33，自然光照。挑选生长状态良好、藻体表面无损伤的健壮褐色藻株（图1）作为试验材料，冲洗、去除表面附着生物。

Figure 1.  Appearance morphology of Kappaphycus alvarezii (Brown strain)

将长心卡帕藻株系切段，取长度为3 cm的藻株并放入500 mL锥形瓶中，每个锥形瓶放10株，加入500 mL的培养液并用封口膜封口，放入光照培养箱中进行培养。培养液为高温灭菌后的天然海水，添加NaNO₃ 24.3 mg·L⁻¹和KH₂PO₄ 1.75 mg·L⁻¹作为营养盐补充。试验设置21、27 、33 ℃共3个不同温度处理组，每个处理组设3组平行（3个锥形瓶，下同），光照强度为4 000 lx，盐度为33，光周期L∶D=12 h∶12 h。每3 d更换一次培养液，共培养21 d。

利用光照培养箱分别设置光照强度为1 000、4 000、7 000、10 000 lx的处理组，每个处理组设3组平行。温度统一设为26 ℃，盐度为33，光周期L:D=12 h:12 h，培养液条件和培养藻株数量同1.2.1。每3 d更换一次培养液，共培养21 d。

生长指标以相对生长率（relative growth rate，RGR）和成活率进行评价；出芽情况以出芽数和出芽率进行评价。

式中：t为试验培养时间（d，本研究中t=21），W₀为初始鲜质量（g），W_t为t天后的鲜质量（g）。

试验结束后，测量各组的叶绿素a（Chl a）、类胡萝卜素（Car）、藻红蛋白（R-PE）和藻蓝蛋白（R-PC）的含量。其中，Chl a和Car的含量采用无水甲醇提取测定，分别根据Porra^[22]和Parsons^[23]计算含量；R-PE和R-PC的含量采用磷酸缓冲液提取测定，根据Beer^[24]计算含量。具体如下：

根据式（5）～（8）计算藻体的Chl a和Car含量：

式中，C_{Chl a}为提取液Chl a的质量浓度，单位（µg·mL⁻¹）；C_Car为提取液Car的质量浓度，单位（µg·mL⁻¹）；V为样品提取液总体积（mL），实验中为5 mL；样品Chl a含量及样品Car含量单位（µg·g⁻¹）；W_FW为样品鲜质量，单位g，实验中为0.1 g；A为上清液在相应波长下的吸光值。

根据式（9）～（12）计算藻体的藻胆蛋白含量：

式中，C_R-PE为提取液R-PE的质量浓度，单位（µg·mL⁻¹）；C_R-PC为提取液R-PC的质量浓度，单位（µg·mL⁻¹）；V为样品提取液总体积，单位mL，实验中为10 mL；样品R-PE含量及样品R-PC含量单位（µg·g⁻¹）；W_FW为样品鲜质量，单位g，实验中为1 g；A为上清液在相应波长下的吸光值。

采用Excel 2019和SPSS 18.0 统计软件进行数据处理及统计分析。用One-way ANOVA（Tukey）进行显著性检验（P<0.05）。

经过21 d的室内培育试验，长心卡帕藻在不同温度和光照条件下，其生长和出芽均表现出差异。在同一光照水平下，3个温度试验组的长心卡帕藻枝段成活率均达到100%，在培养温度为27 ℃时，长心卡帕藻的RGR为（1.55±0.14 ）（%·d⁻¹），显著高于其余两组（P<0.05）。除了生长较快之外，27 ℃试验组的藻体枝段出芽率达到100%，而21 ℃和33 ℃试验组出芽率只有70%和90%。此外，27 ℃试验组的平均出芽数也高于其余两个温度试验组，平均出芽数达到（5.40±0.36）个（表1）。

在光照试验中，当温度统一设定为26 ℃时，随着光照强度的升高，长心卡帕藻的RGR值呈先上升后下降的趋势，在4 000 lx时达到最高，4 000、7 000 lx两个光照强度试验组藻体的RGR值显著高于其余两组（P<0.05），分别为（1.58±0.22）（%·d⁻¹）和（1.44±0.18）（%·d⁻¹）。4000 lx和7000 lx两个试验组的平均出芽个数也具有显著优势，分别为（5.17±0.45）和（4.73±0.35）个，但其两者之间差异不显著（P>0.05）。所设置各光照强度试验组的藻体成活率和出芽率均达到100%（表2）。

当光照强度统一设置为4 000 lx时，长心卡帕藻在不同温度条件下进行室内培养，随着温度的升高藻体叶绿素a和类胡萝卜素的含量均呈先上升后下降的变化（图2）。温度为21 ℃的试验组藻体的叶绿素a含量显著低于其他两组（P<0.05），为（27.86±1.66）μg·g⁻¹；在温度为27 ℃时，长心卡帕藻的叶绿素a和类胡萝卜素含量均达到最高值，类胡萝卜素的含量显著高于其余两组（P<0.05），含量为（25.28±4.22）μg·g⁻¹，但27 ℃和33 ℃两个试验组叶绿素a的含量之间差异不显著（P>0.05）。

Figure 2.  Pigment content of Kappaphycus alvarezii at different temperatures

随着温度的变化，长心卡帕藻藻体的藻红蛋白和藻蓝蛋白含量变化幅度并不大，在21、27、33 ℃的藻红蛋白含量分别为（121.68±13.58）、（119.88±9.33）、（112.56±17.36）μg·g⁻¹，藻蓝蛋白的含量分别为（14.93±1.91）、（13.61±5.32）、（17.36±3.22）μg·g⁻¹，相互间并无显著差异（P>0.05）（图3）。各温度处理组中藻体的藻红蛋白含量均高于藻蓝蛋白含量，且藻红蛋白的含量随着温度升高略有降低。

Figure 3.  Phycobiliprotein content of Kappaphycus alvarezii at different temperatures

在不同光照条件下进行室内培育21 d后，长心卡帕藻藻体的叶绿素a和类胡萝卜素含量也呈现出差异性。当光照为1 000 lx时，长心卡帕藻的外植体枝段的叶绿素a含量为（57.11±5.40）μg·g⁻¹，显著高于其他光照组（P<0.05），但类胡萝卜素的含量为（6.43±2.31）μg·g⁻¹，显著低于其余组（P<0.05）。在光照强度为4 000～10 000 lx 时，藻体叶绿素a和类胡萝卜素的含量呈小幅下降，光照强度升高反而抑制色素的积累，但它们之间差异并不显著（图4）。

Figure 4.  Pigment content of Kappaphycus alvarezii at different light intensities

随着光照强度的变化，长心卡帕藻藻体的藻胆蛋白含量也出现了变动。由结果可知，各试验组的藻胆蛋白变化幅度并不大，光照为4 000 lx的试验组的藻红蛋白和藻蓝蛋白含量分别为（257.87±21.45）、（101.33±13.91）μg·g⁻¹，均显著高于其余组（P<0.05）。光照强度为1 000 lx和7 000 lx的试验组藻红蛋白和藻蓝蛋白含量并无显著差异，而光照强度为10 000 lx的试验组藻红蛋白的含量为（177.21±12.83）μg·g⁻¹，显著低于其余组（P<0.05）。在温度为26 ℃时，长心卡帕藻的藻红蛋白和藻蓝蛋白均随着光照的增强呈先上升后下降的趋势，在4 000 lx时达到最高（图5）。

Figure 5.  Phycobiliprotein content of Kappaphycus alvarezii under different light intensities

温度是影响海藻生长和代谢的核心环境因子，主要通过控制藻体内的生化反应（如光合作用速率等）来影响藻类的生长和繁殖^[25]。在本研究中，长心卡帕藻室内培养的RGR和平均出芽数随着温度升高呈先升高后下降趋势，在27 ℃时均达到最高值，且培养藻株全部发芽，而当温度降低至21 ℃或升高至33 ℃时RGR显著下降，藻株的出芽数量和出芽率也出现向下波动。Shalvina等^[26]研究同样发现，在低于30 ℃时，越高的温度使得长心卡帕藻的日生长率越高。Terada等^[27]研究也表明长心卡帕藻在实验室下培育时，28 ℃和32 ℃时其相对生长率较高，当温度升高至36 ℃长心卡帕藻的死亡率达100%。这与本试验结果十分相似，可以表明温度变化显著影响着长心卡帕藻生长和出芽效率，在室内培养时过高或过低的温度均不利于长心卡帕藻的枝段分生。温度的改变同样影响着海藻藻体的色素积累，本研究发现，长心卡帕藻的Chl-a和Car随着温度的升高呈先上升后下降的变化，在27 ℃和33 ℃时藻体的Chl-a含量显著提高，表明温度升高可阶段性增强光合色素合成，从而支持藻体增殖。此结果与赵素芬和何培民^[28]的研究结论互为印证。而Car主要起捕捉传递光能和逆境保护等作用，在本研究中温度为27 ℃时藻体的Car含量达到最大值。随着温度变化长心卡帕藻藻体的藻胆蛋白含量未表现明显波动（P>0.05），R-PE含量随温度升高略微下降，这表明对长心卡帕藻的藻胆蛋白含量产生显著影响的阈值可能在21 ℃～33 ℃范围之外。陈伟洲等^[29]研究发现，皱紫菜的藻胆蛋白含量在20 ℃以上时随着温度升高呈上升趋势，在26 ℃时其含量显著升高（P<0.01）。笔者认为，温度对藻体藻胆蛋白积累的影响具有种属差异性。因此，在室内环境培养海藻时，温度调控需匹配物种生理特性，摸清适宜的环境促生长条件，从而实现高效培养。

光照与海藻生长繁殖密切相关，是海藻在生长过程中进行光合作用的基础条件^[30]。本研究结果表明，在1 000～10 000 lx的光照强度范围内长心卡帕藻的藻株均全部存活并分生出芽，其RGR和平均出芽数随着光照强度的增强呈先上升后下降趋势，在区间为4 000～7 000 lx内有利于长心卡帕藻生长和出芽，当光照强度达到10 000 lx时RGR和出芽数显著降低，表现出明显的高光抑制现象。赵素芬等^[19]研究同样发现，光照强度为1 700 lx时长心卡帕藻褐色株系的日生长率达到最高，随着光照强度升高长心卡帕藻的生长受到抑制。这与本研究结果十分接近，但本试验中长心卡帕藻的RGR达到最高值时光照强度为4 000 lx，笔者认为出现这一区别可能的原因是温度、盐度和营养液等条件选择不同。光照强度的变化能导致海藻的光合作用效率不同，从而表现出藻体色素蛋白的合成有所差异。本研究中，长心卡帕藻的Chl-a含量在1 000 lx时显著高于其他光照组，这可能是由于低光照导致光反应中光能捕获不足，海藻通过增加光合色素的合成量以增强对有效光能的吸收效率。但其他色素在低光照时的积累并未表现出优势，说明长心卡帕藻在遇到低光时通过色素含量的动态调节来维持光合作用效率。张建伟等^[31]研究同样发现，低光照时瓦氏马尾藻光合色素显著较高。在本试验中，低光虽促使长心卡帕藻Chl-a含量提升，但藻体的生长率和出芽数量显著较低，这表现出光合色素补偿机制（如光捕获能力增强）与生长脱钩的特征。Aguirre-von-Wobeser等^[32]研究同样发现色素过度积累并不一定会提高长心卡帕藻的光合作用效率和生长。本研究中当光照强度为4 000 lx时长心卡帕藻体中R-PE和R-PC均显著升高，但光照强度升高至10 000 lx时，藻体的R-PE含量则显著降低，说明高光会出现抑制长心卡帕藻的R-PE合成。这与张文文^[33]的研究结果一致，证实光抑制效应可能导致蛋白的加速降解。由本研究结果可以得知，当光照强度波动时长心卡帕藻的生长变化与色素蛋白积累的关联性更强，表明光照更能诱导长心卡帕藻体内色素蛋白的生成代谢，从而促进光合作用效率，但光照超阈值会引起光合色素的代谢紊乱。

本研究表明，通过精确调控温度与光照参数，可实现长心卡帕藻室内高效培育，在培养温度为27 ℃、光照强度在4 000 lx时，藻体成活率较高。本文研究结果能够为长心卡帕藻的规模化苗种繁育提供关键参数支撑。此外，营养盐动态消耗规律及光谱特性对藻体代谢的影响可作为长心卡帕藻人工培育的未来探究方向，从而构建光-温-营养耦合调控模型，以完善室内扩繁工艺，推动产业化应用。