Genome-wide identification and prokaryotic expression analysis of TkBZR family genes in rubber dandelion (Taraxacum kok-saghyz)

本研究所使用的橡胶草采自新疆伊宁野外（42°51′36″N, 80°43′48″E），取植株叶片，经消毒后在无菌环境下，将其切割成小块组织，置于含有吲哚乙酸和细胞分裂素的MS培养基上，通过组织培养扩繁得到无菌植株，移栽至培养间温度约24 ℃、湿度约57%的培养间，光照周期为每天光照16 h加黑暗8 h，按常规栽培措施进行管理。

本研究所使用化学试剂RNA提取试剂盒和质粒提取试剂盒均购于北京天根生物有限公司，构建载体使用的Ready-to-Use Seamless Cloning Kit购于BBI生命科学有限公司。PrimeSTAR Max DNA聚合酶、pMD-19T载体购买于Takara生物公司，pET28a载体大肠杆菌DH5α、DE3感受态细胞为本实验室留存。

在基因组数据库（GWH; http://bigd.big.ac.cn/gwh/）中下载橡胶草的全基因组文件PRJCA000437，并使用BioEdit软件建立本地库。从TAIR网站（http: //www.arabidopsis.org/）获取拟南芥已知的AtBZR氨基酸序列，通过本地Blastp将P<1e⁻¹⁰的序列筛选出BZR/BES基因家族候选成员。将候选基因序列利用InterproScan（https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）和SMART（https://smart.embl.de/）检测是否具有BES1_N结构域，从而得到橡胶草BZR基因家族成员。将橡胶草BZR基因家族成员的氨基酸序列上传至 ExPASy数据库（http://web.expasy.org/protparam/）计算蛋白质的物理参数并预测蛋白的分子量、等电点和亲疏水性。还利用在线网站Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）对TkBZRs蛋白的亚细胞定位进行预测。

通过NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载巴西橡胶树、拟南芥和莴苣（Lactuca sativa）中已被鉴定的BZR家族基因序列。通过 MEGA6.0 的邻接法（Neighbor-Joining）并将Bootstrap 值设定为1 000 ，创建橡胶草BZR蛋白序列的系统发育树，并利用AtBZR、LsBZR、HbBZR和NtBZR构建多物种进化树。

根据基因组注释文件将橡胶草BZR/BES基因家族成员在染色体上的物理位置利用在线工具MapGene2Choromosome v2（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）进行可视化展示。橡胶草BZR蛋白的保守基序利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）网站进行分析，并使用TBtools软件分析橡胶草BZR基因家族基因结构（内含子–外显子）。

将橡胶草全生育期划分为S1～S9^[23]，将无性繁殖而来的生根至3～5 cm的橡胶草移入组培瓶中生长30 d为S1,组培60 d为S2，组培90 d为S3, 然后移栽土培，土培30 d为S4，土培60 d为S5，土培90 d为S6,土培120 d为S7，土培150 d为S8, 土培180 d为S9。其中，S5 时期进行30 d的春化处理，S6 时期为盛花期，S7 时期为种子成熟期，S8时期为衰老期，S9 时期为休眠期。课题组基于前期获得的转录组数据，对橡胶草根、叶、胶乳、花及花莛等5个组织中的TkBZR成员表达水平（FPKM值）进行系统分析，同时整合全生育期S1～S9阶段叶、根、胶乳组织的转录组数据。通过TBtools软件对上述FPKM值进行log2标准化转换，最终构建了TkBZRs在组织特异性和发育时序维度上的差异表达热图。

收集约100 mg的橡胶草叶片组织用液氮低温研磨后按照RNA提取试剂盒说明书进行RNA的提取，得到的RNA经微量分光光度计检测其浓度后使用反转录试剂盒根据其说明书进行反转录得到橡胶草cDNA后进行后续实验。

通过对橡胶草转录组数据分析后得出BZR/BES家族差异表达最显著TkBZR2的序列作为参考序列，用Primer 6.0软件设计特异性引物并以橡胶草cDNA为模板扩增TkBZR2。并连接pMD19-T Vector并转化大肠杆菌感受态，挑取抗性筛选培养基上的阳性单克隆进行PCR检测后交由擎科生物公司测序。

利用Primer 6.0软件设计基因引物，根据TkBZR2基因设计引物（表1）进行PCR片段扩增。PCR产物回收纯化后，将TkBZR2通过同源重组法构建到pET28a（+）载体上（总体积为10 μL、2×Seamless Cloning Master Mix 5 μL、线性化载体1 μL、带有同源臂的基因片段4 μL，PCR仪中50 ℃反应20 min）并转入大肠杆菌DE3感受态细胞，并加入不同浓度的IPTG（0.01、0.1、0.5、1.0 mmol·L⁻¹），分别在28 ℃和37 ℃诱导0、2、4、6、8 h。

为了了解TkBZR/BES家族成员的情况，本研究利用HMMER 3.0软件的hmmersearch功能将BZR的保守结构域在橡胶草基因组文件PRJCA000437进行搜索，将阈值P<1e⁻¹⁰的序列作为TkBZR可能存在的成员。通过对候选成员进行结构域分析，初步获得9个TkBZR/BES家族基因，使用InterproScan和SMART数据库进一步分析候选基因，去除不完整序列。最终鉴定出6个TkBZR/BES家族基因，并根据其分子量大小命名TkBZR1～TkBZR6。从图1可知，这6个基因分布于6个独立的基因组片段（scaffold）上。TkBZR/BES家族的氨基酸长度介于151～316 aa之间，理论等电点最低为7.63，最高为9.38，表明绝大多数TkBZR/BES家族蛋白是碱性蛋白，亲水性系数均小于零，这说明TkBZR/BES家族蛋白均为亲水性蛋白（表2）。

Figure 1.  Gene distribution of the TkBZR gene family on Taraxacum kok-saghyz chromosomes

基于邻接法（Neighbor-Joining）对橡胶草、橡胶树、莴苣、烟草和拟南芥的20个TkBZR家族成员进行1 000次bootstrap统计学检验得到其蛋白系统发育关系。如图2所示，BZR蛋白被分成了5个（Ⅰ～Ⅴ）亚组。其中，橡胶草TkBZR/BES家族基因分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ等4个亚组，与莴苣具有相似的分布模式；橡胶草与莴苣的LsBZR家族基因聚类在同一亚组的成员更多，这表明橡胶草蛋白与莴苣的系统发育关系较为密切。TkBZR1大部分位于V和Ⅱ亚组，其他4个物种的TkBZR/BES基因在这2个亚组也有分布。

Figure 2.  Phylogenetic tree of BZR families in Taraxacum kok-saghyz and other plants

通过上述分析，相同类型的BZR蛋白在理化性质方面相似程度较高，且系统发育关系较为密切的蛋白之间理化性质更为相似。对进化树进行比较后发现，在Ⅱ、Ⅲ、V亚组中莴苣和橡胶草BZR基因处于同一分支，说明莴苣和橡胶草的BZR基因家族在进化过程中有较强的亲缘关系。

TkBZR家族基因成员除TkBZR5外，均含有2个外显子，不同的TkBZR之间在保守结构基序和基因结构上的差异可能是影响其亚细胞定位和功能的重要原因。将TkBZR家族蛋白序列输入到MEME网站上进行在线分析，并利用TBtools将其与进化树结合和美化。根据保守基序分析，TkBZR蛋白中鉴定出6个保守基序，TkBZR1、TkBZR2和TkBZR3含有全部的motif，而TkBZR6只含有motif 1和motif 2，motif1和motif2与TkBZR家族的BES1_N保守结构域所在位置相一致，以上结果说明TkBZR家族结构高度相似，它们在基因进化过程和功能模式上可能具有保守性（图3）。

Figure 3.  Gene structure and motif analysis of TkBZR family

通过对橡胶草不同组织的转录组数据进行分析，推测TkBZRs家族基因在根、叶、茎、胶乳等不同组织中的表达模式。如图4所示，TkBZRs具有组织特异性，除TkBZR6几乎在每个组织中都不表达外，TkBZRs在不同组织中表达量均有显著差异。TkBZR4在橡胶草S6生育期的胶乳组织中表达量达到最高。TkBZR1～TkBZR5在根、茎、叶中均呈现先上升后下降的趋势，但达到峰值的时期并不相同，这暗示TkBZR基因家族成员行使相似的功能，但由于蛋白质序列的内部差异使TkBZRs基因在功能上既有相似性又有差异性。

Figure 4.  Analysis of TkBZR expression patterns

为了进一步探究TkBZR家族基因的功能，本研究克隆了在全生育期表达丰度最高的TkBZR2，利用Primer 6.0软件设计引物，以橡胶草叶片cDNA为模板进行克隆得到了1条长为924 bp的片段，且与目的条带大小相符。将克隆得到的基因片段纯化回收后重组到pMD-19T载体上，挑取单克隆进行菌落PCR然后进行测序。然后在NCBI网站上运用BLAST工具对测序结果进行比对，结果发现，所得基因片段与预期的目标基因序列完全一致。使用DNAMAN将TkBZR2氨基酸序列与其他物种中的BZR氨基酸序列进行比，并预测其蛋白质的亲疏水性（图5）。

Figure 5.  Amplification and analysis of TkBZR2 gene

启动子顺式元件与基因功能密切相关，为了进一步探究TkBZR2的调控机理，找到能够调控TkBZR2的上游基因。如图6所示，本研究提取TkBZR2起始密码子前2 000 bp作为TkBZR2的启动子进行分析，将数据上传至PlantCARE网站进行顺式作用元件进行可视化分析，结果如图6所示。从中可知，TkBZR2基因的启动子区域含有多种激素响应元件、非生物胁迫响应元件等，这表明TkBZR2基因可能受到多种激素的调控，并能够对多种胁迫条件做出响应。

Figure 6.  Analysis of cis-acting elements of BZR2 promoter of Taraxacum kok-saghyz

BZRs是BR信号通路中重要的转录因子，验证其是否具有转录因子的功能，往往需要表达出目标转录因子蛋白来验证其功能，表达出TkBZR2蛋白可以为进一步探究其功能打下基础，也为后续实验提供了材料。 通过设置不同的诱导温度（28 ℃和37 ℃）、不同的IPTG浓度（0.01、0.1、0.5、1.0 mmol·L⁻¹）对TkBZR2蛋白进行原核表达。利用SDS-PAGE电泳检测pET28a-TkBZR2的原核表达条件情况，以找到最优的表达浓度、时间、温度。结果如图7所示，所设的四个IPTG浓度诱导在28 ℃和37 ℃下诱导2、4、6、8 h均能诱导表达出条带大小约为40 kDa的TkBZR2-His融合蛋白，且诱导8 h时蛋白表达量最大。所以选择28、0.01 mmol·L⁻¹ IPTG作为表达 TkBZR2蛋白的条件。后续纯化得到的蛋白经过Western-blot检验可以用于EMSA、ChIP等实验来进行DNA结合活性分析，从而筛选和鉴定BZR2下游靶基因。

Figure 7.  Prokaryotic expression of TkBZR2

在植物基因家族研究不断深入的进程中，BZR家族基因备受关注。当前，众多物种中BZR家族基因的鉴定与分析工作正逐步推进，本研究在橡胶草中鉴定出 6 个BZR/BES家族基因成员，这与拟南芥^[18]、黄瓜^[6]、甜瓜^[24]、葡萄^[25]、枣^[26]等植物中BZR/BES家族基因成员个数相同，与水稻（4个）^[7]、大麦（7个）^[27]、番茄（9个）^[28]等作物中的家族基因成员各不相同，暗示不同物种中需要不同个数的BZR成员行使功能。对不同物种中的BZR家族成员的系统发育进化树分析结果显示，莴苣和橡胶草BZR基因家族在进化过程中有较强的亲缘关系。橡胶草BZR含有典型的BZR/BES保守结构基序，表明BZR/BES基因家族在植物演化进程中具备高度的保守性。这意味着在漫长的植物进化历程中，BZR/BES基因家族发挥着不可或缺且相对稳定的生物学功能，可能参与了植物生长发育的基本调控过程，为植物适应环境变化提供了重要的分子基础。

橡胶草TkBZR基因家族成员展现出独特的理化性质，其平均等电点大多高于7.5，且多数成员主要定位于细胞核内。这一现象背后可能涉及多个关键因素，N端的核定位信号序列可能引导这些成员向细胞核运输，使其在细胞核内发挥转录调控等重要功能；高度保守的DNA结合结构域使它们能够精准识别并结合特定的DNA序列，从而调控下游基因的表达；磷酸化位点的存在则为其功能调节提供了动态机制，通过磷酸化与去磷酸化过程，响应细胞内各种信号通路的变化，进而调控基因表达活性；PEST序列可能参与了蛋白质的降解过程，确保细胞内TkBZR蛋白水平的精确调控；C端结构域的特性也可能对其亚细胞定位及功能发挥产生影响，例如参与蛋白质间的相互作用等。这些结构域和序列共同协作，使得TkBZR基因家族成员在细胞内发挥着复杂而有序的生物学功能^{[15, 16]}。

TkBZR基因家族的基因结构相对简洁，除TkBZR5包含3个外显子和2个内含子外，其余成员均由2个外显子和1个内含子构成。值得注意的是，橡胶草TkBZR基因与烟草^[29]、南瓜^[30]和棉花^[31]BZR基因家族的基因结构呈现出相似性，多数成员也都只有2个外显子和1个内含子，极少数成员有3个外显子和2个内含子。这种相似的基因结构暗示着这些BZR/BES基因家族成员在功能上可能具有一定的保守性，它们可能通过相似的转录调控机制，影响植物的生长发育、激素响应以及逆境适应等生理过程。例如，在响应外界环境信号时，这些基因可能通过类似的剪接方式产生不同的转录本，进而调控不同的下游基因表达，以适应环境变化对植物生长发育的需求。

在对TkBZR2启动子序列的深入剖析中，预测到了一系列参与植物生长发育以及响应生物和非生物胁迫的结合元件。这一发现表明，TkBZR2在植物应对各种胁迫时，能够利用不同的信号通路精细调控植物的生理应答过程，进而对植物生长发育及胁迫响应产生深远影响。过往研究已明确，BZR/BES作为油菜素内酯（BR）信号传导途径中的核心转录因子，在植物激素信号转导网络中占据关键地位。例如，在 bzr1-1D突变体中，BZR1能够与ABA响应元件结合，抑制ABI5转录因子的转录激活，从而降低该突变体对 ABA信号的敏感性^{[32 − 34]}。此外，BES1通过限制ABI3基因的转录活性，阻断ABI3对ABI5的激活作用，从而干扰ABA信号的传递过程。这一系列复杂的调控机制表明，BZR/BES家族基因在植物激素互作网络中扮演着重要角色，它们与ABA等激素信号通路相互交织，共同调控植物的生长发育和逆境适应能力^[35]。

综上所述，本研究在橡胶草BZR基因家族研究方面取得了一系列重要成果。通过全基因组鉴定，本研究成功发现了 6 个橡胶草BZR基因家族的新成员，丰富了对橡胶草基因资源的认识。对橡胶草BZR基因在不同组织部位表达特异性的分析，揭示了其表达具有组织特异性和时空表达特异性。同时，探索该基因在原核系统中的最佳表达条件，为进一步研究其功能提供了有力工具。这些研究结果能为橡胶草BZR/BES家族基因的功能研究提供重要参考，有助于深入解析调控橡胶草生长发育与抗逆响应的分子机制，对橡胶草的遗传改良和品种选育具有重要的理论指导意义，也为其他植物中BZR/BES家族基因的研究提供了有益借鉴。今后，可进一步深入研究TkBZR基因家族成员在橡胶草中的具体生物学功能，明确其上下游调控因子，揭示其在橡胶草生长发育及抗逆过程中的精细调控网络。