Identification and expression pattern analysis of SWEET gene family from Dendrobium catenatum

从NCBI GenBank数据库下载铁皮石斛基因组注释文件（PRJNA262478）^[26]。从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/, v35.0）查询MtN3/saliva结构域（PF03083）的隐马尔可夫模型，利用Hmmersearch进行搜索，保留E≤1×10⁻¹⁰的序列。通过Bio-linux bioinformatics documentation system查询D. catenatum蛋白数据库，初步获得DcSWEET候选蛋白。最后，提交至SMART（http://smart.embl.de/smart/batch.pl）和NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 CDD 在线工具来确定是否具有MtN3/saliva和PQ-loop保守结构域^[27]。使用ExPASy（https://www.expasy.org/）分析DcSWEET蛋白的氨基酸数、分子量、理论pI。使用PSORT工具预测DcSWEET蛋白的亚细胞定位。

使用Clustalw 2.0程序对拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）以及铁皮石斛SWEET蛋白序列进行多重序列比对，将比对结果导入MEGA11，使用泊松模型的最大似然法构建SWEET蛋白的系统发育树，用在线网站Evolview（https://evolgenius.info/evolview-v2）美化。

采用TBtools以及MEME在线工具（http://meme-suite.org/tools/meme）分析27个DcSWEET蛋白序列的保守基序。利用TBtools软件^[28]从铁皮石斛基因组gff注释文件中提取DcSWEET基因结构文件，提取DcSWEET各基因起始密码子（ATG）上游2000 bp序列作为启动子序列，并利用PlantCARE 分析顺式作用元件。利用TBtools对27个DcSWEET保守基序、基因结构和顺式元件进行可视化分析。

基于SRA数据库中的RNA-seq数据（SRP132541）分析干旱胁迫下DcSWEET基因的表达模式。该数据包含基质不同含水量（0、10%～15%和30%～35%）下的基因表达量，根据基因ID筛选DcSWEET基因的表达数据，并使用TPM值构建TBtools热图。根据RNA-seq数据的TPM值，使用Origin软件（version 2022b）分析DcSWEET基因共表达关系^[29] ，根据相关系数，使用Cytoscape（版本3.8.1）进行共表达网络分析，以鉴定核心基因。用于相关性分析的数据是4次重复的平均值。

利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术分析响应干旱胁迫的核心DcSWEET基因的表达模式。以实验室保存的20% PEG8000干旱胁迫下的cDNA为模板^[30]，分析DcSWEET基因在干旱处理3、6、9、12、24、48 h后的基因表达情况。引物序列如表1所示，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂（诺唯赞生物科技有限公司, 南京）进行PCR扩增。RT-qPCR扩增条件为：95 ℃初始变性5 min；95 ℃变性30 sec，60 ℃退火延伸45 s，40个循环。结束后读取荧光信号：95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s，进行熔解曲线分析。试验设置3次生物学重复。以铁皮石斛Actin基因作为内参基因，采用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量^[25]。

本研究中从铁皮石斛中共鉴定到27个DcSWEET基因，根据DcSWEET家族成员与水稻和拟南芥SWEET蛋白的关系，将其命名为DcSWEET1 ～ 27。DcSWEET基因编码的蛋白氨基酸数为201（DcSWEET5）～296（DcSWEET11），分子量为22.44（DcSWEET5）～33.11（DcSWEET11）kDa，理论等电点pI为8.47（DcSWEET25）～9.91（DcSWEET16）。DcSWEET5是编码氨基酸最少、分子量最小的蛋白，DcSWEET11编码氨基酸最多，DcSWEET3分子量最大。27个DcSWEET蛋白的等电点都在7以上。亚细胞定位预测到24个（89%）DcSWEET蛋白定位于细胞质膜上，3（11%）个DcSWEET蛋白定位在叶绿体上（表2）。

利用铁皮石斛（Dc）、拟南芥（At）和水稻（Os）的SWEET家族蛋白序列构建系统发育树（图1），铁皮石斛、拟南芥和水稻的SWEET蛋白均可分为4个亚组。铁皮石斛家族成员在四个亚组中的成员数分别为5、13、6和3，所占比例分别为19%（Clade Ⅰ）、48%（Clade Ⅱ）、22%（Clade Ⅲ）和11%（Clade Ⅳ）。而拟南芥AtSWEET家族成员在4个亚组中的数量分别为3个（18%）、5个（29%）、7个（41%）和2个（12%），水稻OsSWEET家族成员分别为6个（29%）、9个（43%）、5个（24%）和1个（4%）。可以看出，不同植物中SWETT基因在不同亚组中的分布具有相似性。

Figure 1.  Phylogenetic analyses of SWEET proteins from D. catenatum, A. thaliana and O. sativa

共鉴定得到20个基序（图2），DcSWEET蛋白几乎所有成员都包含motif 1、2、3、4，表明这些基序在DcSWEET转运体中是高度保守的。除了DcSWEET5和DcSWEET16外，DcSWEET成员都含有motif 4，这表明DcSWEET5和DcSWEET16可能在与其他成员共同进化的过程中丢失了motif 4（图2−B）。通过NCBI-CDD分析DcSWEET蛋白的保守结构域，发现所有的DcSWEETs都含有两个MtN3/saliva或PQ-loop superfamily（图2−C）。内含子–外显子结构分析表明，DcSWEET基因的内含子–外显子数量高度保守。27个成员中的内含子数量为3到5个之间。有14个（52%）DcSWEETs基因含有5个内含子，6个（22%）成员包含4个内含子，7个（26%）成员包含3个内含子（图2−D）。

Figure 2.  Motifs, structures and phylogenetic relationships of DcSWEET family members

在DcSWEET启动子存在植物激素响应元件（脱落酸、水杨酸、赤霉素、生长素），逆境胁迫相关元件（低温、干旱、胁迫和防御响应元件）、植物生长发育相关元件（昼夜调控、分生组织、种子特异性调控、玉米蛋白代谢调控）、光响应元件（图3）。其中，在10个（37%）DcSWEET基因启动子中检测到参与低温响应的顺式作用元件，在11个（41%）DcSWEET基因启动子中检测到参与干旱诱导的MYB结合位点，在5个（19%）DcSWEET基因启动子中存在防御响应元件。说明大多数的DcSWEET基因参与对非生物胁迫的响应。

Figure 3.  Analysis of cis-elements in the DcSWEET gene promoter regions

利用SRA数据库中的RNA-seq数据（SRP132541），筛选出17个DcSWEET基因参与响应干旱胁迫（图4−A）。根据基因表达量的趋势分析，可将这些基因按表达量变化分为三组（图4−B）。DcSWEET1、DcSWEET4、DcSWEET5、DcSWEET9、DcSWEET11、DcSWEET13、DcSWEET14、DcSWEET15、DcSWEET18共9个基因的表达量随着干旱胁迫的加重而升高，DcSWEET7、DcSWEET16、DcSWEET21在30−35%的基质含水量条件下表达量最高，表明这3个基因可能响应较轻的干旱胁迫。DcSWEET2、DcSWEET12、DcSWEET17、DcSWEET26在10～15%的基质含水量条件下表达量上调，在完全干旱时（0%的基质含水量）处理时迅速下降，表明这4个DcSWEET基因可能对中度干旱胁迫（10%～15%的基质含水量）起响应作用。

Figure 4.  Expressions of DcSWEET genes under drought stress

使用Origin软件对干旱胁迫处理下的17个DcSWEET基因TPM值进行相关性分析，选用皮尔逊系数大于0.8的数据，探讨它们之间可能存在的关系。结果表明，80对基因表现为正相关，60对基因表现为负相关（图5−A）。根据皮尔逊相关系数使用Cytoscape软件绘制共表达网络，共鉴定出5个枢纽基因，分别 为DcSWEET4、DcSWEET11、DcSWEET13、DcSWEET18、DcSWEET27（图5−B）。

Figure 5.  Comprehensive analysis of drought-related DcSWEET genes

为了进一步探讨它们对干旱胁迫的响应，采用RT-qPCR分析了4个核心DcSWEET基因在20% PEG8000下的表达水平。结果（图6）表明，这些基因在干旱胁迫下均有不同程度的上调。在根中，处理24 h后DcSWEET4基因的表达达到最高值。在叶片中，DcSWEET11、DcSWEET13在干旱处理9 h后达到最高值，DcSWEET18在处理24 h后达到最大值，其中DcSWEET11上调28倍，DcSWEET18在处理24 h后上调19倍。在茎中，DcSWEET11和DcSWEET13处理24 h后达到巅峰值，其中DcSWEET11表达量是0 h表达量的40倍。

Figure 6.  RT-PCR analysis of the hub DcSWEET genes under drought stress

SWEET蛋白是存在于细菌、真菌、植物和人类中的主要转运蛋白之一，用于促进糖跨细胞膜运输^[31]。在高等植物中，已报道的SWEET基因数量从17到108个不等，如在拟南芥中已鉴定出17个SWEET基因^[32]、小麦中鉴定到108个^[33]、高粱有23个^[34]、番茄有29个^[35]。本研究鉴定的27个SWEET基因家族成员，编码蛋白长度在201到296个aa。在其他植物中也发现类似的研究结果，如杨桃中的SWEET蛋白的氨基酸数目在229～300^[36]，葡萄中的SWEET蛋白的氨基酸数目在201～289^[37]，菜豆在195～304^[38]。不同植物中的SWEET蛋白的氨基酸数目相似，说明不同SWEET在进化中具有较高的保守性。根据拟南芥系统发育树的分类方法^[39]，27个DcSWEETs被划分为4个亚群（图1）。在大多数植物中，SWEET基因家族中以Clade Ⅱ和Clade Ⅲ为主^[40]。本研究发现铁皮石斛SWEET蛋白中Clade Ⅱ成员数占比48%，Clade Ⅲ中的成员数占比22%，表明铁皮石斛中Clade Ⅱ和Clade Ⅲ也是主要类群。

基因结构分析显示52%的DcSWEET成员含有5个内含子，22%的成员含有4个内含子，26%的成员含有3个内含子。可以推测，SWEET基因的祖先是由 6 个外显子和 5 个内含子组成的基因基本模型。DcSWEET中有近一半成员中内含子数少于5个，可能是其在进化时发生了内含子的丢失或外显子的融合^[41]。MtN3_slv亚家族参与葡萄糖转运，而PQ-loop亚家族参与氨基酸转运^[42]。保守结构域分析表明，Clade Ⅲ家族成员包含两个MtN3_slv超家族结构域，Clade Ⅱ家族7个成员包含两个MtN3_slv超家族结构域，6个成员包含1个MtN3_slv超家族结构域和1个PQ-loop超家族结构域（图2−C）。从系统发育、启动子数量和基因结构分析可以看出，铁皮石斛SWEET蛋白家族在进化上是相对保守的。顺式调控元件是位于基因转录起始区的一类DNA序列，相应的转录因子识别顺式作用元件来调节目标基因的mRNA丰度，在非生物胁迫响应中起着至关重要的作用^[43]。本研究中，在21个DcSWEET基因启动子中发现茉莉酸甲酯顺式作用元件，部分DcSWEET基因启动子中发现与赤霉素、水杨酸、脱落酸和生长素信号相关的顺式作用元件，在10个、11个和5个DcSWEET基因启动子中分别发现了低温响应元件、干旱诱导元件、防御和胁迫响应元件等非生物胁迫响应元件。这些数据表明，DcSWEET可能通过多种机制参与环境胁迫。

糖不仅充当满足组织代谢需求的能量和信号分子，而且还充当渗透剂，以应对干旱胁迫。在小麦中，SWEET基因在干旱和盐胁迫下的上调率高于热胁迫和热联合干旱胁迫^[44]。在脱水和干旱胁迫下， OsSWEET15的表达诱导最为显著，其次是OsSWEET13，OsSWEET12还显示出干旱胁迫的中等诱导作用^[45]。研究发现，大豆叶片中的GmSUC2转录水平在干旱胁迫第15 天显著增加（平均 2.18 倍），并上调了种子中GmSUC2、GmSWEET12和GmSWEET21的转录水平^[46]。根据茶树干旱胁迫的RNA-seq，7个基因在PEG胁迫下上调^[47]。本研究发现，11个含有干旱诱导元件的DcSWEET基因中，DcSWEET1、DcSWEET4、DcSWEET5、DcSWEET9、DcSWEET11、DcSWEET13、DcSWEET14、DcSWEET15、DcSWEET18在基质含水量0%时被诱导，DcSWEET2、DcSWEET12、DcSWEET17、DcSWEET26在基质含水量10−15%时被诱导，DcSWEET7、DcSWEET16、DcSWEET21在基质含水量30-35%时被诱导表达，说明这些基因在不同程度的干旱胁迫下受到胁迫表达，可能参与干旱胁迫的响应。通过共表达网络分析筛选出5个核心基因（图5−B）。RT-qPCR分析进一步表明，DcSWEET11在PEG处理9 h的叶中上调28倍，在处理24 h的茎中表达上调40倍。DcSWEET13在茎和叶中也有不同程度的上调。DcSWEET18在叶中被高度诱导表达，分别在处理9 h和24 h时上调9倍和19倍。DcSWEET4在处理24 h的根中上调2倍。结果显示DcSWEET基因在不同组织中应对干旱胁迫的模式不同，可能参与铁皮石斛不同组织部位应对干旱胁迫，但其功能验证仍需进一步开展。

本研究中，共鉴定了27个DcSWEET基因，同一亚组中的基因结构和保守基序具有相似性。在DcSWEETs启动子的上游序列中发现了4种类别的顺式作用元件。利用公开的铁皮石斛干旱胁迫下的RNA-seq数据，根据表达模式将DcSWEET基因划分为3个簇，结合RT-qPCR实验，发现DcSWEET11、DcSWEET13、DcSWEET18基因可作为铁皮石斛耐旱性潜在候选基因。本研究为进一步阐明DcSWEETs基因在干旱胁迫中的作用奠定了基础。