Expression analysis and prokaryotic expression purification of HbbZIP74 gene in rubber tree

实验材料为7年生未开割巴西橡胶树无性系‘热研7-33-97’组培苗植株，种植于中国热带农业科学院试验场。茉莉酸、脱落酸、乙烯和水杨酸处理参照Guo等^[9]的方法。橡胶树根、树皮、叶和花等组织同时采样后立即用液氮研磨或保存在−80 ℃。胶乳用液氮速冻后收集到离心管，再放入液氮中，用于RNA的提取。大肠杆菌（E. coli）DH5α和BL21（DE3）菌株分别购买于天根生物科技有限公司（北京）和上海唯地生物技术有限公司，蛋白表达载体pET28a载体由实验室保存，DNA Marker、pMD19T载体、高保真酶PrimeSTAR和T4 DNA连接酶购自Takara公司（大连），质粒提取试剂盒、RNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒来自FOREGENE公司（成都），反转录试剂盒、和荧光定量试剂来自NOVA公司（苏州）。引物合成和测序由中美泰和生物技术有限公司完成。

根据HbbZIP74基因（基因编号：LOC110658634）在 NCBI中橡胶树参考序列XM_021816336.2，使用SnapGene软件设计基因特异性扩增引物（正向引物SPF: 5′-ATGGCATCCTCCAGTGGAAA-3′，反向引物SPR: 5′-ATACCGAAAGAAATCTGGAG-3′）。以橡胶树胶乳cDNA 为模板扩增目的序列，PCR扩增体系：2 μL模板、上下游引物各1 μL、25 μL 2×PrimeSTAR HS（Premix）、ddH₂O 22 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，38个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经挖胶回收纯化后克隆到pMD19T载体中，pMD19T-HbbZIP74经PCR（正向引物M13-F: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′，反向引物M13-R: 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′）扩增筛选阳性克隆，将阳性克隆抽提质粒后测序。

在NCBI网站查找HbbZIP74基因编码的氨基酸序列，利用ExPASy-ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）在线软件分析HbbZIP74蛋白质分子质量、等电点、稳定性和平均亲水系数；采用SMART在线软件（http://smart.embl-heidelberg.de/）预测蛋白保守结构域；采用Plant-mPLoc在线工具（https://www.ncbiwww.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）进行蛋白亚细胞定位预测；分别采用SOPMA（https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）分析HbbZIP74蛋白的二级结构和三级结构。利用Clustal在线网站（https://www.genome.jp/tools-bin/clustal））进行多序列比对，再通过ESPript网站（https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi））将序列比对结果可视化；在拟南芥中bZIP的各基因亚家族各选取1～2个bZIP转录因子，将HbbZIP74蛋白序列通过Clustal进行多序列比对，并用MEGA构建进化树。

RNA的提取采用FOREGENE公司（成都）的植物总RNA提取试剂盒（多糖多酚含量高的样本），并参照说明书操作。cDNA第一链的合成使用NOVA公司（苏州）的去基因组与逆转录一管化三代预混液试剂盒，按照说明书进行操作。

采用NOVA公司（苏州）的Taq SYBR^® Green qPCR Premix（Universal）试剂盒，使用BIO-RADCFX96 Real-time PCR系统（Bio-Rad，USA），进行qRT-PCR分析。HbbZIP74的引物为：qbZIP74F: 5′-GGGCACAGATGATGGAACTTA-3′；qbZIP74R: 5′-CAGCAGCAACAGCACTTATTT-3′。采用Actin为内参基因，引物为：ActinF: 5′-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3′；ActinR: 5′-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′。qRT-PCR的反应体系20 μL：1 μL模板、正反向游引物（10 μmol·L⁻¹）各1 μL、10 μL Taq SYBR^® Green qPCR Premix、ddH₂O 7 μL。qRT-PCR反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。每个样品进行3次生物学重复和3次技术重复实验，结果采用2^−ΔΔCT法分析基因的相对表达量，使用SPSS分析样本间的差异显著性。

根据pET28a载体图谱和HbbZIP74的CDS序列设计正向引物F: 5′-TCGCGGATCCGAATTCATGGCATCCTCCAGTGGAAAT-3′，反向引物R: 5′-GGTGGTGGTGCTCGAGATACCGAAAGAAATCTGGAGAAGCC-3′，以构建成功的pMD19T-HbbZIP74的质粒为模板，通过PCR扩增目的片段并挖胶回收纯化。使用同源重组的方法将扩增产物片段连接到已经酶切完成的pET28a载体上，转化后大肠杆菌DH5α，经过PCR验证（正向引物T7-F: 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，反向引物T7-R: 5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′），挑选具有单一明亮条带的菌落进行质粒提取后，将测序验证的重组表达载体命名为pET28-HbbZIP74。

将pET28-HbbZIP74质粒转入BL21（DE3）菌株中，挑取单菌落接种于含有50 mg·L⁻¹卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃，200 r·min⁻¹，培养16 h。按菌体体积1︰100将菌液接种于含有50 mg·L⁻¹ 卡那霉素的5 mL LB液体培养基，在37 ℃，180 r·min⁻¹培养至OD₆₀₀为0.4−0.6，终浓度分别为0.1、0.3、0.5、1和2 mmol·L⁻¹的IPTG分别在37 ℃振荡培养5 h；在1 mmol·L⁻¹ IPTG浓度下，分别16、20、28和37 ℃振荡培养5 h；在1 mmol·L⁻¹ IPTG、37 ℃条件下，分别诱导1、2、3、4和5 h。对不同条件的诱导样品进行SDS-PAGE电泳，确定最佳诱导表达条件。

根据上述摸索的最佳诱导表达条件，将诱导的200 mL菌液8 000 r·min⁻¹离心5 min后，用PBS缓冲液重悬后离心，再用30 mL洗涤液（1% TritonX-100，500 mmol·L⁻¹ NaCl，2 mol·L⁻¹脲，50 mmol·L⁻¹ Tris-HCl pH7.5，1 mmol·L⁻¹ EDTA）重悬，加入终浓度为1.5 g·L⁻¹的溶菌酶，在冰上摇过夜。冰上超声破碎细胞，4 ℃，9 000 r·min⁻¹离心15 min，用洗涤液重悬，重复2次。再用裂解液（50 mmol·L⁻¹ Tris-HCl pH8.5，8 mol·L⁻¹脲，1 mmol·L⁻¹ DTT）按称重溶解为10～20 g·L⁻¹重悬，静置30 min至沉淀溶解。用0.45 μm水系滤膜过滤裂解液后上镍柱进行纯化，依次用洗脱液（8 mol·L⁻¹脲，50 mmol·L⁻¹ Tris-HCl pH8.5，1 mmol·L⁻¹ DTT），10 mmol·L⁻¹咪唑洗脱液，50 mmol·L⁻¹咪唑洗脱液，100 mmol·L⁻¹咪唑洗脱液进行洗脱后，对收集的样品进行SDS-PAGE电泳。洗脱液装入透析袋，置于复性液（50 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，1 mmol·L⁻¹ EDTA，2.2 mmol·L⁻¹ GSH，1.1 mmol·L⁻¹ GSSG，5% 甘油，pH8.5）中，4 ℃静置透析过夜。再将透析袋放入新的透析液（50 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，1 mmol·L⁻¹ EDTA，pH8.5）中透析，换液3次。透析完后将液体收集透析袋中液体，并分装存于−20 ℃冰箱。

以橡胶树胶乳cDNA为模板，通过特异引物SPF和SPR扩增，得到长度约为500 bp的片段（图1），条带清晰且单一，与预期HbbZIP74 ORF长度相符。将目的片段连接至pMD19T载体后转化到DH5α菌株中，经菌液PCR筛选获得阳性克隆（图1），抽提质粒经测序，确定扩增片段为486 bp，与NCBI数据库中HbbZIP74（登录号：XM_021816336.2）的ORF序列完全一致。重组质粒命名为pMD19T-HbbZIP74。

Figure 1.  Full-length cloning of HbbZIP74

HbbZIP74的ORF全长486 bp，共编码161个氨基酸；相对分子量为18.28 kDa；理论等电点为6.51；不稳定指数为54.54，平均亲水系数为−0.673，表明该蛋白为不稳定亲水蛋白。该蛋白包含一个碱性亮氨酸拉链结构域，位于第26～90个氨基酸（图2−A）。HbbZIP74蛋白二级结构预测结果显示，100个氨基酸（62.11%）参与形成α-螺旋，61个氨基酸（37.89%）参与形成无规则卷曲（图2−B），三级结构预测结果显示，HbbZIP74蛋白主要由α-螺旋和形成无规则卷曲组成（图2−C），与二级结构预测结果相符，约在40 kDa前为亲水区域，41～130 kDa左右为疏水区域（图2−D），HbbZIP74蛋白亚细胞定位预测位于细胞核。

Figure 2.  Structural analysis of HbbZIP74 protein

将橡胶树HbbZIP74（XP_021672028.1）氨基酸序列与拟南芥AtbZIP44（NP_177672.2）、小麦TabZIP2（XP_044406621.1）、水稻OsbZIP11（XP_015622690.1）、西红柿SlbZIP53（XP_004240572.1）、玉米ZmbZIp58（AQK74499.1）、毛果杨PtbZIP43（XP_024461072.1）和木薯MebZIP4（XP_021631325.1）的氨基酸序列进行多序列比对分析，氨基酸序列相似性分别为52.53%、34.43%、42.57%、42.22%、36.11%、31.75%和33.33%。比对结果显示，每个蛋白都含有N-x7-R/K基序，以及2～3个不等的x6-L的7肽重复序列（图3），表明HbbZIP74属于bZIP基因家族。

Figure 3.  Homologous alignment of HbbZIP74 amino acid sequences with other species

将拟南芥中的多个bZIP氨基酸序列与HbbZIP74进行序列比对，并构建进化树。结果发现，拟南芥bZIP依然被分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、M和S共13个亚家族，HbbZIP74与AtbZIP2和AtbZIP11处于一个分支，属于S亚家族（图4）。

Figure 4.  Phylogenetic tree of HbbZIP74

利用qRT-PCR检测了HbbZIP74在橡胶树根、树皮、叶片、花和胶乳等组织的表达情况。从图5可知，HbbZIP74在胶乳中的表达水平最高，树皮中次之，分别为根中表达量的7.66倍和4.48倍，在叶中的表达量和根相当，在花中的表达量最低。

Figure 5.  Expression of HbbZIP74 in different tissues of the rubber tree

激素处理在天然橡胶的生物合成中起着重要的调控作用，因此检测了茉莉酸、脱落酸、乙烯和水杨酸处理的胶乳中HbbZIP74的表达情况。qRT-PCR结果显示，4种激素处理均能诱导HbbZIP74的表达（图6）。脱落酸、乙烯和水杨酸在处理3 h均使HbbZIP74的表达达到正常水平的2倍以上（图6−B—D），茉莉酸在处理在6 h内，HbbZIP74的表达水平基本没有变化，12 h的表达量达到最高值，是正常表达水平的5.36倍（图6−A）。

Figure 6.  Expressions of HbbZIP74 in latex under different hormone treatments

以pMD19T-HbbZIP74质粒为模板，使用引物NCF和NCR进行PCR扩增得到目标片段，通过同源重组将目标片段连接到线性化后的pET28a载体上，转化大肠杆菌。通过菌液PCR检测获得阳性克隆，结果如图7−A所示。阳性单克隆提取质粒，经测序与HbbZIP74的CDS序列一致，表明HbbZIP74蛋白原核表达载体构建成功，重组质粒命名为pET28-HbbZIP74，重组载体如图7−B所示。

Figure 7.  Construction of recombinant vector pET28-HbbZIP74

将pET28-HbbZIP74重组质粒转入BL21（DE3）菌株中，37 ℃扩大培养至OD₆₀₀为0.6时，分别加入终浓度为0.1、0.3、0.5、1、2 mmol·L⁻¹ IPTG后，37 ℃诱导5 h，SDS-PAGE蛋白电泳检测结果如图8−A所示，添加IPTG的菌液均诱导出相对分子量约22 kDa蛋白，与预测的HbbZIP74-His重组蛋白分子量大小一致，表明HbbZIP74-His蛋白在大肠杆菌BL21中成功诱导表达。泳道5和6诱导蛋白量相当且明显高于泳道2～4，说明1 mmol·L⁻¹ IPTG为诱导重组蛋白表达的最适浓度。

Figure 8.  Screening of conditions for expression of HbbZIP74 protein by inducing

将OD₆₀₀为0.6的菌液加入1 mmol·L⁻¹终浓度的IPTG，分别在16、20、28、37 ℃诱导5 h，SDS-PAGE蛋白电泳检测结果（图8−B）表明，泳道2蛋白量最少，泳道5诱导蛋白量表达量最高，表明在37 ℃重组蛋白表达效果最佳。

将OD₆₀₀为0.6的菌液加入1 mmol·L⁻¹终浓度的IPTG，在37 ℃分别诱导1、2、3、4、5 h，SDS-PAGE蛋白电泳检测结果（图8−C）表明，蛋白在1 h就检测到了表达，在3 h的表达量达到最大，继续增加诱导时间蛋白表达量被没有明显增多。因此，确定HbbZIP74-His重组蛋白的最佳诱导条件为在37 ℃使用终浓度1 mmol·L⁻¹ IPTG诱导3 h。

HbbZIP74-His重组蛋白的可溶性进行鉴定如图9−A所示，诱导样品上清液中（泳道3）无目的重组蛋白，而沉淀中（泳道4）包含目的蛋白，说明HbbZIP74-His重组蛋白主要存在不可溶的包涵体中形式存在。将沉淀中的包涵体蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳检测，在裂解液洗涤后杂蛋白基本被洗除，在洗脱液和10 mmol·L⁻¹咪唑洗脱液中则无出现明显的条带，在50 mmol·L⁻¹咪唑洗脱液泳道出现目的条带，后续纯化可用50 mmol·L⁻¹咪唑洗脱液进行洗脱（图9−B）。洗脱后收集蛋白经透析后可获得纯化复性后的 HbbZIP74蛋白（图9−A，泳道5）。

Figure 9.  Induced expression and purification of HbbZIP74 protein

bZIP转录因子作为植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育、种子成熟和萌发、花发育、应对生物和非生物胁迫响应调控中的重要作用已有深入研究，在参与植物次生代谢，调控植物次生代谢产物的生物合成中也发挥了极其重要的作用。大量的研究表明，bZIP转录因子可有效调节植物萜类化合物、黄酮类化合物和生物碱的生物合成。青蒿（Artemisia annua）中，除AabZIP外^[25]，AabZIP9也可以通过促进ADS和CYP71AV1的表达，正向调控青蒿素的积累^[29]。GbbZIP08和GbbZIP15参与了银杏青花素的合成^[30]。雷公藤（Tripterygium wilfordii）bZIP转录因子TwTGA1可以调节雷公藤内酯和倍半萜吡啶生物碱的生物合成^[31]。天然橡胶是产胶植物体内合成的次生代谢产物，短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）和橡胶树中已有bZIP转录因子促进天然橡胶生物合成基因的表达，调节橡胶生物合成的报道^[2,26]。前期本课题组通过酵母单杂交技术，在胶乳cDNA文库中筛选到与法尼基焦磷酸合酶、橡胶转移酶、小橡胶粒子蛋白和橡胶延长因子等橡胶生物合成相关酶和蛋白基因互作的bZIP转录因子HbbZIP74，表明其可能与天然橡胶生物合成调控相关。蛋白多序列比对显示HbbZIP74具有bZIP转录因子的保守结构域，属于bZIP转录因子家族成员。亚细胞定位预测HbbZIP74定位于细胞核中，符合转录因子的一般特征。系统发育分析显示HbbZIP74属于bZIP家族的S亚家族，该家族基因包含一类无内含子基因，编码蛋白分子量一般约20 kDa，和C亚家族能形成同源和异源二聚体，在参与植物胁迫应答中发挥重要功能^[15]。

橡胶树乳管细胞是特异化合成和储存天然橡胶的场所，它上下贯通分布于橡胶树树皮的韧皮部。乳管的数量是决定天然橡胶产量的关键因素^[32]，天然橡胶生物合成相关基因在乳管细胞中高丰度表达^[33]。HbbZIP74在胶乳中的表达量最高，树皮中次之，都显著高于根、叶和花等组织中的表达，暗示HbbZIP74可能与天然橡胶合成存在密切关系。目前已经证实茉莉酸^[14]、乙烯^[34]、脱落酸和水杨酸^[35]等激素在天然橡胶生物合成中起着重要的调控作用。本研究发现，茉莉酸、乙烯、脱落酸和水杨酸均能显著诱导胶乳中HbbZIP74的表达，乙烯对其影响最为显著，并可以持续到48 h，茉莉酸也使其表达量提高5倍多；脱落酸和水杨酸对HbbZIP74影响趋势比较一致，能使HbbZIP74的表达提高2～3倍，但在12 h时HbbZIP74表达量有明显的下降，显示激素对基因的调控存在复杂的机制。综上所述，HbbZIP74可能通过茉莉酸、乙烯、脱落酸和水杨酸信号途径参与对天然橡胶生物合成的调控。

转录因子编码蛋白的表达和纯化是开展其转录调控功能研究的基础，纯化蛋白可通过凝胶阻滞实验确定与靶基因启动子DNA的体外结合，以及结合部位，通过pull-down实验鉴定转录因子的互作蛋白。本研究成功构建了HbbZIP74的原核表达载体，并对HbbZIP74-His重组蛋白的最优表达条件进行摸索。除基因本身特性外，诱导剂浓度、诱导温度和时间都是影响蛋白表达的因素。本研究共使用5种浓度的IPTG诱导蛋白表达，结果表明IPTG浓度的提高有助于蛋白表达量的增加，当浓度到1 mmol·L⁻¹时重组蛋白表达水平达到峰值；温度对重组蛋白的表达影响较大，16 ℃下细菌生长较慢，5 h几乎没有重组蛋白表达，20、28和37 ℃均有重组蛋白表达，且37 ℃重组蛋白表达量最高，这与37 ℃是大肠杆菌最适生长温度有关；HbbZIP74-His重组蛋白在37 ℃对诱导响应较快，在1 h就有较多表达，3 h后达到稳定表达状态。目前认为，包涵体的形成是由于蛋白在细胞内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀，HbbZIP74-His重组蛋白在37 ℃表达速度较快，可溶性检测显示主要以包涵体形式存在。我们尝试降低诱导温度至16 ℃，降低诱导剂IPTG浓度为0.1 mmol·L⁻¹，延长诱导时间至20 h，仍然无法获得可溶重组目的蛋白，推测形成包涵体可能与蛋白自身结构有较大关系。由于无法获得可溶重组蛋白，在37 ℃使用终浓度1 mmol·L⁻¹ IPTG诱导3 h即为HbbZIP74-His蛋白快速高效表达的最优化条件。

通常包涵体蛋白缺乏生物活性，需要分离、纯化和复性用于后续研究。本研究中使用碱性缓冲液溶解包涵体，上清液经滤膜过滤后，使用Ni-NTA柱进行亲和纯化，咪唑洗脱后获得目标重组蛋白，洗脱液使用透析复性、富集，获得可用于下一步研究的HbbZIP74-His纯化蛋白。这一结果将为验证HbbZIP74与靶标基因启动子结合，HbbZIP74与其他蛋白相互作用提供了前提，也为深入研究转录因子HbbZIP74在天然橡胶生物合成中的功能奠定了基础。

本研究克隆了HbbZIP74基因，qRT-PCR分析结果显示，HbbZIP74在橡胶树胶乳和树皮中的表达水平较高，茉莉酸、脱落酸、乙烯和水杨酸处理，可以诱导胶乳中HbbZIP74的表达。通过构建pET28-HbbZIP74原核表达载体，在大肠杆菌（E. coli）BL21（DE3）菌株中进行异源表达和重组蛋白纯化，筛选出HbbZIP74-His重组蛋白的最佳表达条件为1 mmol·L⁻¹ IPTG，37 ℃诱导3 h，重组蛋白主要存在包涵体中。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化获得大小约22 kDa的HbbZIP74-His重组蛋白，为进一步探究HbbZIP74在天然橡胶生物合成中的功能奠定基础。