Apomixis of Hopea hainanensis Merrill & Chun based on SSR and whole genome SNP variations

研究区位于海南热带雨林国家公园的霸王岭片区（ 18°48′ - 19°12′N，108°55′ - 109°17′E）和尖峰岭片区（18°38′—18°48′N，108°47′—109°02′E ）（表1）。本研究选取霸王岭坡垒分布区内开花结果的9棵成年树为母本，挑选无病害且成熟的叶片，硅胶干燥保存备用。同时每棵母树采集大约25枚翅果，带回实验基地萌发并培育种苗。在尖峰岭片区，选择方圆500 m范围内仅有1棵成年且开花的坡垒个体作为研究对象，采用相同的方法采集叶片和果实。

将坡垒翅果带回实验室，去掉果翅，用0.1%的高锰酸钾溶液侵泡20分钟进行表面消毒处理，然后置于海南大学农科实验基地的沙床中萌发，待幼苗长出3～4片真叶，采集叶片提取子代基因组DNA。用于微卫星基因型检测实验的10个坡垒家系的子代个数（表1）。

采用改良的CTAB法提取母树与子代的基因组DNA，使用Wang等^[31]开发的12对微卫星引物进行微卫星基因分型。PCR 扩增在 Eppendorf的热循环仪中进行。总反应体积20 μL，包含2 μL gDNA，0.2 μL正向荧光引物，0.2 μL反向引物，10 μL 2xTaq PCR MasterMix，余下体积用ddH₂O补齐。循环程序如下：94 ℃预变性6 min，然后32个循环（94 ℃变性15 s，59～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s），最后72 ℃延伸7 min。使用ABI3730XL 分析仪（Applied Biosystems）进行片段分析， SSR等位基因的长度用GeneMarker 2.2确定，然后人工校正基因分型结果。

为验证微卫星基因型结果的可靠性，本研究团队从10个家系中随机选取4个（BW4, BW7, BW8, JF），通过简化基因组测序获得母树及子代全基因组水平的SNP标记。基因组DNA由限制性内切酶EcoRI和MseI消化，添加测序接头，电泳后选择400～500 bp的片段，经PCR扩增制备简化基因组测序文库^[32] ，文库由广州捷锐生物科技公司的Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序。

使用Stacks软件包的process_radtags.pl程序对原始下机数据进行拆分^[33] ，过滤低质量碱基。运行denovo_map.pl程序，不依赖参考基因组组装酶切片段。改变个体两个等位基因之间允许错配的数量（M）和种群中任意两个等位基因之间允许错配的数量（n），但保持二者相等，以确定适宜数据的M值，作为组装位点的最佳参数值。使用Stacks软件中的populations程序判读SNP，要求位点缺失数据的比例小于20%，其他过滤条件使用默认值。参数m控制组装一个位点所需的reads数，为了检验reads数对组装和SNP判读结果的影响，本研究团队使用了5个逐步增大的m值（m=3, 6, 9, 12, 15），分析SNP判读结果的变化。基于母本杂合位点开展后续数据分析，确定每个子代与母本SNP位点基因型相同的位点个数。对于同一个家系的母本与子代，分析SNP位点基因型的情况，统计每个SNP位点与母本基因型相同和单个等位基因差异的子代比例，使用python程序绘图可视化统计结果。

12对微卫星引物对10个坡垒母树基因分型的结果见表2。霸王岭9棵母树的微卫星基因型完全相同，并且母树与其子代的基因型也完全相同。尖峰岭母树与霸王岭母树在微卫星基因型上存在差异，但尖峰岭母树与其子代的基因型完全相同。母树与子代基因型完全相同提示坡垒可能行专性无融合生殖，也可能是因为微卫星标记的分辨率不够。为此，本研究团队利用简化基因组测序分析基因组水平上的SNP变异模式，进一步探究坡垒的繁殖模式。

SNP位点变异模式分析在家系内进行。与微卫星基因型的结果不同，子代SNP位点的基因型与母本并不完全相同（表3）。当m=3时，与母本SNP基因型相同的位点在4个家系中均占到81%以上。考虑到坡垒为同源四倍体，有高比例的重复序列，基因组复杂；且SNP判读结果是通过从头组装，在无参考基因组的条件下获得的，因此不排除部分SNP位点可能是组装错误导致的非真实SNP变异。参数m控制组装一个酶切位点所需的reads数，提高m值可以提高组装位点的可靠性^[34]。分析显示，SNP变异位点的数量随参数m值增大而减少，这是因为m值增加导致组装的酶切片段减少，但与母本SNP基因型相同位点的比例逐渐提高。从m取值3到15，与母本具有相同SNP的比例提高了大约7至10个百分点（表3）。这一分析结果表明SNP变异位点中确实存在因组装错误而导致的虚假SNP，而提高参数m的值可以在一定程度上避免虚假SNP的干扰。我们进一步按照与母本基因型相同与单个等位差异统计每个家系在每个SNP变异位点上的组成情况（图1）。伴随m值的增大，与母本完全相同的SNP位点的数量略微减少；但与母本有一个等位差异的SNP位点，其差异比例的分布模式发生明显改变，从连续平缓的增加变为快速陡峭的增长。表明相当比例的SNP位点，其子代与母本SNP基因型的差异很可能是由于子代SNP基因型因组装错误而导致的判读错误。当m值逐步增加，一部分较少个数reads支持的酶切片段不再被组装，因此虚假SNP的数量减少，与母本差异SNP的位点个数减少。同时我们发现，即便m取值为15，仍然存在部分SNP位点其子代与母本存在很高比例的差异（图1），这些SNP位点的产生还有待进一步研究。

Figure 1.  Comparative analysis of SNP variations between mother trees and offsprings in four family linese of Hopea hainanensis under different m values

无融合生殖现象在植物中很常见，目前已在被子植物的70余科300多个属中都发现了无融合生殖现象^[35]。鉴定是无融合生殖研究的前提与关键环节，形态观察、胚胎观察、去雄套袋实验和分子标记检测等是无融合生殖常用的鉴定方法^[36]。早期龙脑香科的无融合生殖主要通过细胞和胚胎学观察进行研究，发现娑罗双属（Shorea），坡垒属（Hopea）和龙脑香属（Dipterocarpus）的多倍体物种存在无融合生殖现象^{[37 − 39]}。近年来分子标记技术被越来越多用于无融合生殖检测。如Pangsuban等^[40]利用RAPD标记发现Garcinia atroviridis种群中58%的子代与母本具有完全相同的条带组成，认为它们是无融合生殖产生的。通过SSR、AFLP和叶绿体片段测序分析，Majesky等^[41]发现Taraxacum scanicum的无融合繁殖种群遗传上高度同质，不同种群内检测到少量的特有基因型，认为是由体细胞突变导致的基因型差异。Yu等^[42]利用SNP标记鉴定出了Iris domestica通过无融合生殖产生的后代及与I. dichotoma的杂交后代。分子标记普遍具有灵敏，稳定的特性，可为无融合生殖鉴定提供有力证据。

本研究通过SSR标记分析显示坡垒的子代与其母树的SSR基因型完全相同，由此推测海南岛的坡垒可能行无融合生殖。基于简化基因组测序获得的覆盖全基因组的SNP变异进一步支持上述推断，显示霸王岭和尖峰岭4个坡垒家系的子代具有很高比例的与母树SNP基因型相同的变异位点。如果通过母树的自交或异交来解释这些变异位点，其发生概率是以0.5为底数，SNP位点个数为指数的幂，数值几乎等于零，因此坡垒母树与子代的SNP变异模式不可能是有性生殖产生的。虽然部分SNP位点观察到一定比例的子代其SNP基因型与母树存在差异，通过提高组装酶切位点的reads数可降低差异SNP位点的比例，显示这部分差异SNP位点很可能是酶切片段组装偏差所致（图1）。由于坡垒为同源四倍体，并且酶切片段是在无参考基因型的情况下组装的，因此酶切片段组装结果中可能存在同源性偏误，进而导致虚假的差异SNP位点。

兼性无融合生殖是指一物种同时进行有性生殖和无融合生殖^[43]，因此无融合生殖产生的子代将与母本基因型完全相同，而有性生殖的子代其基因型与母本可能存在差异。SSR标记的检测结果显示所有子代SSR基因型均与其母本完全相同，支持坡垒为专性无融合生殖。SNP标记分析结果显示子代与母本的SNP变异在大多数位点上保持一致，但子代与母本SNP基因型存在少量差异，这一差异很可能来自体细胞突变^[44]，也可能是无参组装时的偏差所致，后续还应当通过母树与种子基因组重测序分析坡垒是否进行兼性无融合生殖。

坡垒遗传变异研究结果也为其无融合生殖提供了间接证据。Wang等^[11]利用SSR评估了海南岛坡垒种群的遗传多样性，发现其显著低于其他非濒危的坡垒属树种。Tang等^[12]通过简化基因组测序发现海南岛坡垒的核苷酸多样性水平很低，比已经报道的其他极小种群和濒危植物的多样性水平还低。坡垒低水平的种群遗传变异可能与其无融合生殖的繁殖方式有关。

SSR标记结果还显示尖峰岭母树与霸王岭母树基因型存在差异，刘超男^[45]、Wang等^[11]以及Tang等^[12]基于遗传聚类分析，分别发现海南岛坡垒种群有2个或5个遗传类群，表明坡垒种群维持了一定水平的遗传变异。坡垒个体间的遗传变异可能是体细胞突变产生的，多次起源也是产生遗传多样性的可能原因。要准确分析坡垒SNP变异的进化来源，需要获得高质量的坡垒参考基因组，通过基因组重测序进一步探究坡垒遗传变异产生的原因。

当植物无法通过减数分裂产生可存活的种子，或植物因气候、空间隔离、传粉者限制等因素不能进行有性生殖时，无融合生殖可起到繁殖保障的作用^[46]。坡垒为同源四倍体，减数分裂很难产生能育的配子，无融合结实是坡垒更新种群的必然选择。但无融合生殖通常不产生新的变异组合，不利于濒危物种遗传多样性恢复，加剧了坡垒濒危的困境。因此，必须做好现存坡垒个体的保护，以尽可能维持种群的遗传多样性。由于坡垒树体高大，很难直接观察到坡垒的花，后续研究可以通过去雄套袋实验进一步验证坡垒无融合生殖，并通过重测序数据分析评估子代与亲本的遗传差异，探究坡垒遗传变异的输入与维持机制。

繁殖方式是影响种群遗传变异产生与维持的重要因素，决定了物种的进化潜力。基于微卫星和单核苷酸多态性变异，本研究揭示坡垒的繁殖方式为无融合生殖，这与其同源四倍体的性质相符。明确繁殖方式一方面能够促进对坡垒种群进化历史、遗传变异的水平与分布的理解，另一方面也有助于制定合理的保护措施，促进坡垒种群规模与遗传多样性恢复。对于冠层乔木坡垒，很难直接观察和操纵其花部器官，因此基于分子标记的亲子两代变异模式分析是研究这类高大林木繁殖方式的有效手段。基于覆盖全基因组的SNP变异还能提供无融合生殖物种体细胞突变的准确估计，解析坡垒种群遗传变异的来源。后续研究可以创造条件利用去雄套袋实验验证坡垒的无融合生殖能力。