Identification of mosquito species in Hainan Province using COI gene and genetic diversity analyses of Aedes albopictus populations

于2022年10月—2024年3月采集实验蚊虫，采集地：1）海南省海口市中国热带农业科学院院区[海口，HK（19°59′09″ N, 110°19′26″ E）]；2）琼海市嘉积镇长边园[琼海, QH（19°17′56″ N, 110°26′31″ E）]；3）三亚市白鹭公园[三亚, SY（18°15′05″ N 109°30′58″ E）]，4）儋州市两院实验农场十队[儋州，DZ（19°27′25″ N 109°40′14″ E）]。于夜间 20: 00 悬挂功夫小帅光催化诱蚊灯收集的蚊虫，次日早晨收集纱网内的虫体并浸泡在无水乙醇中保存、备用。

成蚊的形态学鉴定参考陆宝麟等^{[19 − 21]}对成蚊的描述，同时参考生命条形码数据库（http://v4.boldsystems.org/index.php）， 沃里德生物系统（http://www.wrbu.org/VecID_MQ.html）和蚊虫分类目录 （http://mosquito-taxonomic-inventory.info/valid-species-list）。

使用镊子夹取单只样本的成蚊蚊腿，加入多颗研磨珠，加入50 μL配制好的碱性裂解液，使用组织破碎仪破碎（频率：30/s，时间：2 min）。参考Mutebi等^{[22 − 23]}方法，用 HotShot 法从研磨液中提取蚊虫基因组DNA，保存至−20 ℃。

以基因组DNA为模板，以COI（Forward）：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，COI（Reverse）：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA引物对COI 基因进行PCR扩增^{[24 − 25]}。扩增体系为 30 μL，其中DNA模板2 μL；TaqDNA聚合酶0.4 μL；上述引物各0.6 μL；10X 反应液3 μL；dNTPs 2.4 μL；ddH₂O 21 μＬ。PCR反应条件：95 ℃ 预性5 min；95 ℃变性30 s，45 ℃ 复性50 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增反应结束后，取3 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 产物经凝胶电泳检测后，切取特异性目标条带进行胶回收，回收产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。

1）序列勘校：通过观察测序峰图中的测序峰是否为单一峰形，且单个峰的峰形是否完整，以确认测序是否成功，对测序前端和尾端数据进行校正，确保测序得到的碱基正确可靠。利用MEGA11对序列进行校正编辑并确保所有序列长度保持一致。将测序得到的序列与GenBank数据库收藏的序列进行同源比对，选择比对后同源性大于98%的序列进行后续分析。

2）序列分析：使用MEGA11对不同来源的COI基因序列进行比对，以确定位点的变异情况。计算每个碱基（腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶）的相对含量；计算碱基和密码子的使用频率。应用MEGA11邻接（Neighbor-Joining，NJ）算法来构建单倍型系统发育树，Bootstrap值设置为1 000。使用Dnasp6.0分析位点多态性进行种群遗传距离计算及单倍型、多样性分析、错配分布（Mismatch distribution）分析。使用PopART 1.7 软件构建单倍型网络（median-joining network）图。使用Arlequin 3.1软件分析计算群体间遗传分化系数（Fst值）、基因流（Nm值）等。以及使用分子变异分析（Analysis of molecular variance, AMOVA）分析种群内和种群间的遗传变异等。从GenBank 中下载中国（福建省、广东省、云南省）和越南、老挝、马来西亚、日本、韩国、意大利、美国和刚果的白纹伊蚊种群的单倍型序列进行群体间Fst和Nm值分析。

PCR扩增产物测序鉴定了516个样本，共检出8属43种吸血蚊虫。它们分别属于按蚊属（Anopheles）、库蚊属（Culex）、伊蚊属（Aedes）、阿蚊属（Armigeres）、巨蚊属（Toxorhynchites）、曼蚊属（Mansonia）、小蚊属（Mimomyia）和煞蚊属（Sabethes）（表1）。还有229个样本经鉴定不属于吸血蚊虫，主要为摇蚊（Chironomidae）以及少量蕈蚊（Mycetophilidae）和大蚊（Tipulidae）（表2）。

按蚊属鉴定了19种，分别为中华按蚊（An. sinensis）、顿尼按蚊（An. deaneorum）、赫坎按蚊（An. hyrcanus）、达氏按蚊（An. darlingi）、带棒按蚊（An. claviger）、埃文斯按蚊（An. evansae）、朝鲜按蚊（An. koreicus）、美彩按蚊（An. splendidus）、孟加拉按蚊（An. bengalensis）、吉普尔按蚊（An. jeyporiensis）、乌有按蚊（An. nili）、雷氏按蚊（An. lesteri）、棋斑按蚊（An. tessellatus）、白跗按蚊（An. albitarsis）、巴西按蚊（An. Braziliensis）、里氏按蚊（An. Rivulorum）、福拉蒂按蚊（An. Forattinii）、瓜拉尼按蚊（An. Guarani）和巴氏按蚊（An. Barberi）。库蚊属鉴定了13种，分别为簇角库蚊（Culex Lophoceraomyia）、白雪库蚊（C. gelidus）、黑点库蚊（C. nigropunctatus）、杂鳞库蚊（C. vishnui）、环纹库蚊（C. annulirostris）、C. usquatissimus、三带喙库蚊（C. tritaeniorhynchus）、尖音库蚊（C. pipiens）、白胸库蚊（C. pallidothorax）、环带库蚊（C. annulus）、二带喙库蚊（C. bitaeniorhynchus）、致倦库蚊（C. quinquefasciatus）、海滨库蚊（C. sitiens）。杂鳞库蚊和环带库蚊占比较多（22.2%、23.8%）。其中，在琼海有数量较多的三带喙库蚊（12.6%）。三带喙库蚊是流行性乙型脑炎主要传播媒介，需提高警惕。本研究在海口检测到5只致倦库蚊，致倦库蚊也传播流行性乙型脑炎。伊蚊属中鉴定了6个种，分别为白纹伊蚊（Ae. albopictus）、刺扰伊蚊（Ae. vexans）、曼氏伊蚊（Ae. mcintoshi）、窄翅伊蚊（Ae. lineatopennis）、长丝伊蚊（Ae. longfilamentus）和伪白纹伊蚊（Ae. pseudalbopictus）。白纹伊蚊数量占总伊蚊比例最多（91.9%）。其中，海口、儋州和三亚白纹伊蚊数量占总白纹伊蚊比例较高（51.6%、16.9.6%、19.4%），琼海（11.9%）较低。骚扰阿蚊（Armigeres subalbatus）、吕宋小蚊（Mimomyia luzonensis）、巨蚊（Toxorhynchites ambionensis）、常型曼蚊（Mansonia uniformis）、煞蚊（Sabethes glaucodaemo）数量稀少，骚扰阿蚊仅在儋州发现，吕宋小蚊和煞蚊是首次在海南使用分子标记发现的新记录种（表1）。

经过测序得到白纹伊蚊COI基因序列118条，去除头尾引物序列，有效序列长度为600 bp。同源比对发现白纹伊蚊COI基因扩增片段同源率高达99%。分析显示，白纹伊蚊COI基因序列的碱基组成为A：28.5%，T：36.8%，C：17.3%，G：16.0%。A+T含量（65.3%）大于G+C 含量（34.7%）；该序列具有明显的碱基偏好，主要为A和T，特别是第三位碱基，A+T的含量达到86.0%（表3）。在此基础上，本研究团队统计分析白纹伊蚊COI基因扩增片段的密码子的使用频率，扩增的COI基因片段不编码丙氨酸和色氨酸。使用频率最高的为亮氨酸（Leu）（30.6%），其次为谷氨酸（11.0%），使用频率最低的密码子是天冬酰胺（0.6%）（表4）。

使用Dnasp6.0对各组的白纹伊蚊COⅠ基因的群体遗传距离进行计算（表5）。各个种群组内遗传距离最大的为三亚种群（0.002 0），其次为海口（0.001 9）、琼海（0.001 3）和儋州（0.000 7）种群。各种群间遗传距离变化范围为 0.001 10～0.001 97，除了琼海种群和儋州种群（0.001 10）距离较近外，其他种群两两间距离差别不大（0.001 69～0.001 97）。这说明海南4个采样区域间白纹伊蚊遗传差异较小。

通过Dnasp6.0分析测序数据，共获得各组白纹伊蚊COI基因单倍型23种（表6）。其中共享单倍型共5个，Hap_1为 4个地理种群共享（海口、琼海、三亚、儋州），Hap_3 为3个地理种群共享（海口、琼海、三亚），Hap_4、Hap_13为海口与琼海共享，Hap_10为海口和三亚共享。这说明海南的白纹伊蚊主要在Hap_1和Hap_3 两个位点发生基因交流。进而，通过MEGA 11邻接（Neighbor-Joining，NJ）算法构建单倍型系统发育树，对海南白纹伊蚊23个单倍型进行分析，结果（图1−A）显示：Hap_1、Hap_2、Hap_3、Hap_7、Hap_5、Hap_13、Hap_23、Hap_12和Hap_16聚为1大支。Hap_2、Hap_14、Hap_11和Hap_22，Hap_6、Hap_8、Hap_15、Hap_17、Hap_19和Hap_9，Hap_18、Hap_10和Hap_21则各聚为1支。通过 PopART 1.7 软件构建的23个单倍型网络（median-joining network）（图1−B）显示，Hap_1（被全部4个地理种群所共享）为优势单倍型，基本所有的单倍型都以Hap_1为中心，其他单倍型则可能从Hap_1演化而来。而Hap_3也成为一个小中心。各单倍型之间相差一个突变步骤（图1−B）。

Figure 1.  Analysis of the genetic structure and genetic diversity of geographic populations of Ae. albopictus in Hainan

对海南白纹伊蚊遗传多样性分析发现三亚的白纹伊蚊单倍型多样性最高（0.73），核苷酸多样性也是最高为（0.001 99）。其次为海口（单倍型多样性：0.68，核苷酸多样性：0.001 91）。儋州的单倍型多样性（0.22）和核酸多样性（0.000 74）最低。虽然海口的单倍型数量（17）最多，单倍型多样性（0.68）相很高，但有意思的是，三亚单倍体数量并不多，但单倍多样性和核酸多样性均是最高，说明三亚的遗传多样性较为丰富（表7）。

分子变异分析（Analysis of molecular variance, AMOVA）结果表明：海南4个种群间COI基因的遗传差异占11.51%，而种群内部的差异占88.49%。使用软件Arlequin 3.1计算白纹伊蚊 COⅠ基因的种群间遗传分化系数Fst，根据Fst值计算基因流水平（1−Fst）/（4*Fst）（表8）。按照Fst<0.05为种群出现轻度分化，0.05<Fst<0.15为种群出现中度分化，0.15<Fst为种群出现高度分化^[26]。结果显示，三亚种群和儋州种群（Fst=0.065，Nm=3.6）为中度分化，说明三亚种群和儋州种群基因有一定交流。其他种群两两之间（Fst<0.05，Nm>5.18）处于轻度分化, 其他种群基因交流频繁。同样，本研究团队还分析了海南白纹伊蚊种群与国内外其他地区种群的Fst值和Nm值（表9）。海南种群与福建种群（Fst = 0.65）、意大利种群（Fst = 0.61）、日本种群（Fst = 0.61）、韩国种群（Fst = 0.58）之间，遗传分化较大。而海南种群与云南种群（Fst = 0.27）、老挝种群（Fst = 0.22）、越南种群（Fst = 0.19）、马来西亚种群（Fst = 0.28）Fst 值较小，而Nm值较大（1.26−2.15）。表明海南种群与云南种群、老挝种群、越南种群、马来西亚种群Fst 值相对较小，但依然是高度分化，基因交流程度依然比较低。

如果错配分布的实际观察结果与期望值的某个假定模型（恒定或收缩）相吻合，则说明群体状态与期望的假定模型一致，反之，则说明背离期望值的假定模型，群体处于扩张状态（曲线为单峰）。由图2可见海南的白纹伊蚊种群的分布为单峰分布，与期望的分布不一致，说明海南白纹伊蚊种群经历过扩张。

Figure 2.  Population mismatch analysis of Hainan Ae.albopictus based on mitochondrial COI gene

海南岛是中国南方的一个热带岛屿，蚊种丰富，海南岛有面临蚊媒疾病爆发的风险。COI基因是研究蚊虫遗传多样性和建立种内关系有价值且可靠的诊断工具。随着数据的丰富，COI基因鉴定蚊虫种类越来越有效^{[27 − 28]}。本研究从海南岛东西南北4个地理区域收集蚊虫并研究蚊虫的多样性和遗传分化情况，共捕获8属43种吸血蚊种，它们分别属于按蚊属（Anopheles）、库蚊属（Culex）、伊蚊属（Aedes）、阿蚊属（Armigeres）、巨蚊属（Toxorhynchites）、曼蚊属（Mansonia）、小蚊属（Mimomyia）和煞蚊属（Sabethes）。其中，主要蚊虫为按蚊属19种，库蚊属13种，伊蚊属6种。吕宋小蚊和煞蚊（S. glaucodaemo）是首次在海南使用分子标记发现。测序得到的COI基因有效序列长度为600 bp，该短序列碱基组成：A：28.5%，T：38.2%，C：16.3%，G：16.0%。A+T含量（66.7%）大于 G+C 含量（32.3%）。碱基组成主要为A和T，特别是第三位碱基，A+T的含量达到86%，这个结果与其他学者对线粒体COI基因研究结果相似^{[24, 29 − 30]}。本研究统计了COI编码蛋白的氨基酸组成，COI基因编码18种氨基酸，其中亮氨酸密码子的使用频率最高，该结果与对天牛中线粒体基因的研究结果相似^[31]。通过分析海南4个地理种群的遗传距离发现，儋州、海口、三亚、琼海种群间遗传距离较小，种群两两间距离差别不大。这说明海南4个采样区域间白纹伊蚊遗传差异较小，与 Li 等^[15]研究结果相似。

种群分化系数（Fst）又称为固定系数（Fixationindex），表示种群之间的遗传分化程度，范围在0～1之间，值越大表明种群的分化程度越高。基因流（Nm）表示基因在群体中的流动，Nm越大说明群体之间交流越频繁，Nm小于１时表明种群间基因交流极少，存在很大分化，当Nm的值大于１时可以抑制群体间的分化^[32]。分子变异分析表明海南4个区域中，除了三亚种群和儋州种群（Fst=0.065，Nm=3.6）之间为中度分化，基因有一定交流。其他种群两两之间（Fst<0.05，Nm>5.18）处于轻度分化，基因交流频繁。系统发育树中各单倍型的聚类也没有表现出明显的地域特征，这可能是由于海南地理隔离程度较低，不同地区之间存在一定较频繁基因交流相关。将海南种群与其他地区的种群进行分子变异分析发现，中国海南种群与中国福建种群、意大利种群、日本种群、韩国种群之间，遗传分化较大。研究还发现，中国海南白纹伊蚊种群与中国云南种群、老挝种群、越南种群、马来西亚种群Fst 值相对较小，有一定的基因交流。Fang等^[33]研究发现，中国海南白纹伊蚊仅与中国云南种群表现出一定的基因流动，中国海南与中国广东或中国福建种群之间的基因交流受阻，本研究结果与Fang等^[33]研究结果类似。Li等^[15]研究结果显示中国海南种群与中国云南、老挝种群之间存在一定的基因流动。研究结果提醒：海南自由贸易港建成后，人员会频繁流动，蚊卵有可能会被东南亚国家或非洲务工人员携带入岛，进而可能会造成白纹伊蚊传播的登革热等疾病风险升高，故建议政府应做好相应应对措施，防范输入性病例的出现。通过使用DnaSP6.0分析中国海南白纹伊蚊进化过程，结果显示，海南白纹伊蚊的错配分布曲线呈现单峰泊松分布，海南白纹伊蚊种群可能发生过一次群体扩张，群体大小保持相对稳定^{[34 − 35]}。

本研究丰富了海南蚊虫的分子鉴定的内容，为海南白纹伊蚊的遗传结构和种群动态提供了新的认识，为进一步研究该物种的生态学、传播病原体以及防控策略提供了重要线索。研究发现儋州、海口、三亚、琼海各种群间遗传距离较小，种群两两之间大多数处于轻度分化，种群中间基因交流较频繁，各种群间的遗传多样性不高。这些使得海南不同地理种群的白纹伊蚊具有相似的媒介能力^[36]。本研究还存在一些局限性，未来可以进一步完善和扩展，可通过更全面的地理区域采样来了解海南白纹伊蚊的生态和遗传特征。