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塑料由于具有耐久性、延展性和低成本等优点，已被广泛应用于各个领域[1]。同时，塑料的产量也呈现爆炸性增长。据统计，1950年全球塑料年产量仅为150万t，而到2023年已增至4.3亿t[2]，预计到2050年，全球塑料年产量将再次翻倍[3]。目前，只有约10%的塑料废弃物得到有效回收利用，大量的塑料废弃物被填埋或进入环境中[4]。由于塑料的非生物降解性，它们在自然环境中很难分解，导致大量塑料废弃物在陆地和海洋中积累，造成严重的环境污染。在众多塑料降解方法中，生物降解技术由于生态友好性和高效性而备受关注。该技术利用微生物或其代谢产物将塑料分解为无害物质，从而实现塑料废弃物的绿色处理[5]。近年来，许多学者开始探索自然界中具有塑料降解潜力的微生物，并获得了显著进展。Sivan等[6]在聚乙烯（PE）薄膜中分离出1株细菌（Rhodococcus rube C208），其通过分泌漆酶降解多种塑料。Veena等[7]堆肥中分离出2株细菌（Bacillus pacificus，Pseudomonas mucidolens），它们通过产生纤维素酶，从而有效降解低密度聚乙烯（LDPE）。随着研究的不断深入，慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）逐渐引起了学者们的关注。作为α−变形菌门（Alphaproteobacteria）的一类固氮菌属，其广泛存在于全球各地的土壤中。罗功文等[8]通过对55个覆盖塑料薄膜的农田进行研究，发现慢生根瘤菌属是塑料圈群落的关键枢纽物种之一。Tanunchai等[9]研究发现，PE微塑料处理后，慢生根瘤菌属在土壤中的丰度显著增加。本实验室前期宏基因组分析也得出了类似的结果，受PE污染的土壤中Bradyrhizobium ORS_375丰度较无PE污染的土壤更高。同时，B. ORS_375丰度和已知的塑料降解相关基因丰度呈现显著正相关。这些结果暗示，慢生根瘤菌属具有塑料降解潜力，但还需后续进行验证实验。细胞色素P450（CYP450）因能够在聚合物长链各个位置进行氧化，将聚合物裂解为短链碳而备受关注，被认为是塑料降解过程中的关键酶，然而并非所有CYP450都有降解塑料能力[10 − 13]。CYP450属于血红素–硫代酸盐蛋白的超家族，包含多个羟化酶亚家族，广泛分布在从古细菌到人类的大多数物种中，其中30%的细菌含有CYP450，比如慢生根瘤菌属中的物种[14 − 17]，推测CYP450羟化酶在这些物种中可能发挥微塑料降解功能，但仍需要实验验证。因此，探寻慢生根瘤菌属中CYP450羟化酶的来源，对于了解慢生根瘤菌在塑料降解中所发挥的深层作用机制具有重要意义。
本研究对28株慢生根瘤菌开展比较基因组学分析，了解其基因组结构与功能，探究核心、附属及特有基因组的生物学功能。通过系统发育分析，揭示CYP450羟化酶在细菌和古菌中的进化历程，探讨慢生根瘤菌属获取其编码基因的路径，旨在为慢生根瘤菌降解塑料的机制提供新见解。
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28株慢生根瘤菌。
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使用dataset软件从NCBI批量下载28株组装程度为complete的慢生根瘤菌属基因组序列。使用BPGA[18]对28株慢生根瘤菌基因组进行泛基因组分析。使用Diamond[19]将泛基因组中的核心基因组、附属基因组以及独特基因组在KEGG数据库中进行功能注释。分析的结果通过gnuplot和R包ggplot2[20]进行可视化。
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用dataset软件从NCBI批量下载1999—2024年上传的细菌（5 494株）和古菌（342株）的完全组装基因序列以及蛋白质序列。收集慢生根瘤菌属基因组中CYP450羟化酶蛋白质序列，使用Mafft[21]进行多序列比对后利用Hmmer[22]的hmmbuild参数构建隐马尔可夫模型，将构建的隐马尔可夫模型用于筛序细菌和古菌中的CYP450羟化酶同源基因并提取包含同源基因的物种。
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用Orthofinder[23]筛选物种中的单拷贝核心基因，使用muscle[24]对核心基因进行多序列比对，比对结果输入到trimal[25]提取保守序列，串联后输入到IQ-TREE[26]，基于最大似然法构建物种树。同样使用muscle[24]对同源基因进行多序列比对，而后输入到IQ-TREE[26]，基于最大似然法构建基因树。物种树和基因树均使用IQ-TREE的-bb参数（UFboot）进行
1000 次重复抽样检验，取距离最远两物种的中点确定树根。用TaxonKit[27]对物种树上所有物种进行谱系注释，将物种分类至门水平，用不同颜色表示。所有的系统发育树使用ITOL[28]进行可视化。 -
在Count[29]中使用基因丢失倾向法（Propensity for Gene Loss）推断慢生根瘤菌属基因组获得丢失频率以及CYP450羟化酶的获得丢失情况。为了分析CYP450羟化酶在慢生根瘤菌属以及细菌和古菌中的进化历程，使用Ranger-DTL[30]对物种树以及CYP450羟化酶基因树进行1 000次循环随机分析，AggregateRanger对结果进行汇总，筛序结果中出现超过400次的水平转移事件。
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为了探究慢生根瘤菌属的基因组多样性，从NCBI中共获得慢生根瘤菌属中28个完全组装的物种参考基因组进行泛基因组分析。结果显示，慢生根瘤菌属泛基因组中共包含36,731个基因，其中核心基因（所有菌株共有基因）1 905个，仅占5.2%；附属基因（两个或多个菌种共有的基因）16,396个，占44.6%；特有基因（菌株特有基因）18 430个，占50.2%（图1）。28个物种的特有基因数目237～2 549个（图1）。这些结果说明，慢生根瘤菌属的基因组具有明显的多样性，在进化过程中能够适应不同的环境。随着基因组数目的增加，慢生根瘤菌属泛基因组的大小也随之增加，没有趋于饱和，而核心基因组却逐渐减小（图2）。说明慢生根瘤菌属具有开放的泛基因组，能够从外界获取更多基因，如微塑料降解基因。
Figure 1. Comparative genomic analysis of 28 Bradyrhizobium strains
Figure 2. Pan genome and core genome
为了揭示慢生根瘤菌属泛基因组的功能特征，本研究使用KEGG数据库对核心基因、附属基因以及特有基因进行功能注释（图3）。核心基因组大部分的功能与维持各种基础生命活动相关，比如碳水化合物代谢（13.59%）、氨基酸代谢（12.75%）、能量代谢（6.98%）、膜运输（5.87%），辅因子和维生素的代谢（4.97%）。附属基因的功能是氨基酸代谢（12.29%）、膜运输（11.75%）、碳水化合物代谢（11.36%）、异源生物降解和代谢（6.75%）、信号转导（6.01%）。特有基因功能与附属基因相似，主要为氨基酸代谢（12.76%）、碳水化合物代谢（11.69%）、膜运输（10.29%）、异源生物降解和代谢（6.79%）、信号转导（6.79%）以及脂代谢（5.33%）。相比于核心基因，在附属基因以及特有基因中膜运输、异源生物降解和代谢、脂质代谢、信号转导等相关功能比例升高。研究表明，塑料降解过程需要多种功能基因的协同作用。这些基因涉及异源生物降解和代谢、膜运输、脂质代谢以及其他关键信号通路[31 − 34]。
Figure 3. Pan-genomic KEGG functional annotation
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为了分析慢生根瘤菌属在进化过程中的基因流动，研究基于1,052个单拷贝核心基因构建了慢生根瘤菌的系统发育树。基于拓扑结构和物种的进化距离，慢生根瘤菌属的系统发育树可以分为六个主要进化支（图4）。其中，B. australafricanum与其他慢生根瘤菌属成员在进化上具有显著的分歧。本研究收集了28个物种的分离地点和分离来源。尽管某些物种自相同的分离地点或来源，但它们在系统发育树中的进化距离却较远（图4），显示出遗传多样性，这与慢生根瘤菌属具有开放的泛基因组，容易与其他物种进行遗传物质的交换有关。
Figure 4. Species tree of Bradyrhizobium
研究通过系统发育树和慢生根瘤菌属直系同源基因表达矩阵，推断出慢生根瘤菌属的祖先基因组。结果显示，祖先基因组中包含6 570个基因家族，其在进化过程中经历了复杂的动态变化，包括频繁的基因获得和丢失（图4）。在大多数末端节点中，基因获得的比例高于基因丢失（图4），相反，在慢生根瘤菌属祖先的基因组中，大部分基因发生了丢失。进化距离相近的物种之间，基因的获得和丢失趋势并不完全一致。这些结果表明，基因的获得和丢失推动了慢生根瘤菌属多样性的形成，帮助它们适应日益复杂的生存环境，并在进化出塑料降解相关功能中发挥了重要作用。
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收集的慢生根瘤菌属28个物种中每一个物种都含有CYP450羟化酶同源基因，本研究基于这些同源基因构建了CYP450羟化酶基因的系统发育树（图5）。该系统发育树的拓扑结构与慢生根瘤菌属的系统发育树拓扑结构相似，说明慢生根瘤菌属中的CYP450羟化酶基因主要以垂直传递方式进化，仅在个别物种之间存在水平基因转移。为了进一步探究CYP450羟化酶基因的进化历程，本研究在细菌和古菌中搜索了慢生根瘤菌属CYP450羟化酶的同源基因。在细菌中发现456个同源基因，在古菌中发现 69个同源基因，共涉及312个物种。基于这些同源基因构建CYP450羟化酶在细菌和古菌中的基因树，并使用TaxonKit对物种进行谱系注释（图6）。在基因树中，56%的CYP450羟化酶基因来源于放线菌门，且倾向于聚集在同一个进化枝；13%来源于古菌，同样倾向于聚集在同一个进化枝；而其余31%并没有按照预期，以门为单位进行聚集，而是分散在各个进化枝。基因树中最先发生分化的基因来源于放线菌门，而古菌的两个门则分化最晚。这一发现表明，古菌中出现CYP450羟化酶的时间可能晚于细菌。我们所关注的慢生根瘤菌属于假单胞菌门（Pseudomonadota），在基因树中的占比较少，只有不到2%，散乱分布于不同进化枝。其中本研究关注的物种B. ORS375，其CYP450羟化酶基因与放线菌门（Actinobacteria），而非假单胞菌门聚在一起，并且分支枝长较长。
Figure 5. Gene tree for CYP450 hydroxylase in Bradyrhizobium
Figure 6. Gene tree for CYP450 hydroxylase
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本研究对上述含有慢生根瘤菌属CYP450羟化酶同源基因的细菌和古菌进行比较基因组学分析。在312个物种中找到11个单拷贝核心基因，基于这些核心基因使用最大似然法构建物种树。与基因树的散乱分布不同，物种树中来自同一门的物种几乎都聚集在同一个进化枝（图7）。其中，甲基杆菌属与慢生根瘤菌属进化距离最近，这2个属在分类学上都属于α-变形菌纲（Alpha-Proteobacteria），它们有着共同的祖先，并在进化过程中逐渐分化，形成了不同的属。
Figure 7. Horizontal gene transfer of CYP450 hydroxylase
为了探究CYP450羟化酶基因如何流向慢生根瘤菌属，研究利用RANGER-DTL对基因树和物种树进行了比较，挖掘CYP450羟化酶基因在进化过程中的复制、水平转移和丢失事件。结果显示，CYP450羟化酶基因频繁发生水平转移，仅有少量的复制，在456个同源蛋白基因中，共发生了1 002次水平转移和71次基因复制。水平转移不仅限于同一门之间，还发生在不同门水平，甚至是细菌和古菌界之间。研究提取与慢生根瘤菌属相关的水平转移事件，结果表明，慢生根瘤菌属与其相邻进化枝的多囊菌属（Polyangium）的假定祖先发生了水平转移。放线菌门中的诺卡氏菌属（Nocardia）和链霉菌属（streptomyces）是慢生根瘤菌属及其假定祖先获得CYP450羟化酶基因的供体。
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本研究通过比较基因组学和系统发育分析，发现慢生根瘤菌属具有开放的泛基因组结构。泛基因组分析结果表明，该属的基因获得的比例高于基因丢失。这一发现表明，慢生根瘤菌属可能通过基因水平转移或其他机制获得新的基因和功能，以应对日益复杂和变化的生存环境。该推测与慢生根瘤菌在共生固氮过程中基因水平转移的研究成果一致。已有研究表明，慢生根瘤菌通过基因水平转移（如nod和nif等基因）在不同根瘤菌株之间广泛交换基因，这一过程显著增强了慢生根瘤菌的适应性和功能多样性[35 − 36]。
在对CYP450羟化酶基因的系统发育树分析中，本研究特别关注的B. ORS375菌株的CYP450羟化酶基因表现出显著的变异特征，可能是由于突变赋予该菌株降解塑料的潜力。进一步挖掘CYP450羟化酶基因在细菌及古菌中的水平转移情况发现，放线菌门中的诺卡氏菌属（Nocardia）和链霉菌属（Streptomyces）是慢生根瘤菌属及其假定祖先获得CYP450羟化酶基因的潜在供体。目前，对于放线菌门在塑料降解领域的研究也取得了显著的进展。Monica等 [37]从坦桑尼亚受塑料污染的土壤中分离出2株具有高塑料降解潜力的链霉菌——Streptomyces werraensis 和S. rochei。研究表明，锚定肽和Streptomyces sp. strain K30的融合蛋白能增强PE的生物降解活性[38]。此外，诺卡氏菌属产生的酯酶对于聚乳酸和聚对苯二甲酸乙二醇酯具有降解潜力[39]。这些发现进一步支持了通过水平转移从放线菌门获取CYP450羟化酶基因的慢生根瘤菌属获得了氧化长链烷烃、塑料以及其他外源性分子的潜力。通过这一基因的转移，慢生根瘤菌属不仅能够氧化复杂的有机化合物，还为进化出塑料降解能力提供分子基础。
Evolutionary analysis of the plastic-degrading hydroxylase gene CYP450 in Bradyrhizobium
doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240175
- Received Date: 2024-11-24
- Accepted Date: 2025-02-07
- Rev Recd Date: 2025-01-15
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Key words:
- Bradyrhizobium /
- hydroxylase gene CYP450 /
- plastic degradation /
- comparative genomes /
- phylogenetic analysis
Abstract: To explore the evolutionary history of the Bradyrhizobium and its plastic degradation-related gene the hydroxylase gene CYP450, and to understand the mechanisms by which the genus acquires its plastic degradation potential. In this study, 28 fully assembled strains of Bradyrhizobium were collected to investigate the evolution and dissemination of Bradyrhizobium and their hydroxylase genes CYP450 through comparative genomic and phylogenetic analyses. The results revealed that, compared to the core genes, the unique and accessory genes of Bradyrhizobium exhibited an increase in functions related to plastic degradation, such as membrane transport, xenobiotic biodegradation and metabolism, lipid metabolism, and signal transduction. Bradyrhizobium has an open pan-genome, enabling it to acquire genes from other species, adapt to new environments, and evolve new functions. Analysis of the flow of the hydroxylase gene CYP450 in bacteria and archaea revealed that Bradyrhizobium likely acquired hydroxylase gene CYP450 from the Actinobacteria phylum through horizontal gene transfer, thus gaining the potential for plastic degradation.
| Citation: | LU Zhenzhang, MA Jiayue, LI Juanjuan, CHI Xue, MA Xiang, TANG Yanqiong, LI Hong. Evolutionary analysis of the plastic-degrading hydroxylase gene CYP450 in Bradyrhizobium[J]. Journal of Tropical Biology. doi: 10.15886/j.cnki.rdswxb.20240175
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