Preliminary functional analysis of the tatD gene in Vibriosis parahaemolyticus

实验所用溶藻弧菌由海南大学南海微生物资源开发与利用课题组所提供，菌株编号为HN08155（WT），分离自1只患病石斑鱼。实验所用具有氯霉素与苄青霉素抗性的自杀质粒pDM4由海南大学微生物资源开发与利用课题组所保藏，所用DH5α、Top10感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

1）LB培养基：胰蛋白胨10 g·L⁻¹，酵母膏5 g·L⁻¹，氯化钠20 g·L⁻¹；2）LBS培养基：胰蛋白胨10 g·L⁻¹，酵母膏5 g·L⁻¹，氯化钠30 g·L⁻¹；3）2216E培养基：胰蛋白胨1.5 g·L⁻¹，酵母膏0.3 g·L⁻¹，氯化钠6 g·L⁻¹，磷酸铁0.01 g·L⁻¹；（4）M9培养基：M9药品11.4 g·L⁻¹，葡萄糖4 g·L⁻¹，氯化钠19.5 g·L⁻¹。

DNA提取试剂盒购自天根生化科技北京有限公司，DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA生物技术公司，限制性内切酶、DNA 聚合酶和 T4 连接酶与PCR相关试剂均由 TaKaRa 公司提供，引物合成与测序分别由上海生工生物工程股份有限公司与华大基因科技股份有限公司完成。实验所用其他试剂均为常规试剂。

实验前期已对溶藻弧菌HN08155进行全基因组测序分析。从溶藻弧菌全基因组DNA（美吉生信云：https://www.majorbio.com）中挑选全部tatD基因进行基因信息比对，将tatD基因序列翻译为氨基酸序列，使用Uniprot蛋白数据库，进行蛋白信息查询比对，以验证tatD基因翻译后的氨基酸序列。此外，利用NCBI进行TatD蛋白的结构域分析，同时通过蛋白质数据库Pfam进行结构域的预测验证。最后，应用ProtParam tool预测TatD蛋白的理化性质，包括分子量、等电点等重要参数。溶藻弧菌DNA利用天根生化科技北京有限公司 DNA提取试剂盒进行提取，以提取DNA为模板，利用tatD基因相关引物（表1）扩增tatD基因ORF框，PCR产物经过切胶、纯化后，由华大基因科技股份有限公司进行测序。

使用DNA提取试剂盒TIANGEN提取溶藻弧菌HN08155基因组DNA。利用软件SnapGene viewer以测序获得的HN08155全基因组序列中的tatD基因为模板设计上游/下游同源臂PCR引物（tatD-U、tatD-D，表1）。利用引物tatD-UF+UR、tatD-DF+DR分别扩增tatD基因上下游片段，将扩增上下游片段纯化回收后做为模板，利用tatD-UF+DR引物扩增tatD基因框内缺失片段，PCR产物经过纯化回收与自杀质粒PDM4进行双酶切后进行连接，构建重组载体PDM4-tatD载体，将重组载体转化至溶藻弧菌（WT）。自杀质粒在宿主内无法正常的进行复制，要么会被识别为外源DNA而被清除，要么整合到宿主染色体上，与其一同复制。自杀质粒PDM4含有蔗糖致死基因，当同源性DNA片段发生重组时，在蔗糖培养条件下，无法进行正常的复制，从而筛选出tatD基因缺失株。利用 tatD-TF+TR（表1）引物分别进行验证，在构建成功的单基因缺失菌株上重复上述步骤，从而构建双基因缺失株与三基因缺失株。

将保藏的菌株进行活化，挑选单菌落到液体培养基中30 ℃、180 r·min⁻¹培养12 h，将菌液按百分之一的接种量转接到无菌液体培养基中，相同条件下培养至对数生长期。按上述接种方式与接种量将菌液接种至新鲜液体培养基中，混匀后按每孔200 μL培养液转入96孔板，重复6次，酶标仪测定菌液OD₆₀₀数值，连续监测48 h，通过OD₆₀₀数值反映菌株的生长情况。LB培养基为富营养条件，M9为低营养条件。

将菌株活化后选择单菌落转接至新鲜液体培养基中培养过夜，培养后的菌液按上述菌种量转接至液体培养基中培养至菌株生长对数期，将培养液在4 ℃、5 000 r·min⁻¹条件下离心10 min，弃沉淀取上清液。将从北京索莱宝科技有限公司购来的小牛胸腺DNA溶于无菌ddH₂O中，移液枪吸取10×反应缓冲液（MgCl₂）1 μL与小牛胸腺DNA 1 μL配制降解反应体系，加入各菌株上清液4 μL，添加无酶ddH₂O至10 μL反应体系；EDTA具有螯合金属离子的作用，添加DNase I酶与EDTA做为对照，将反应体系在30 ℃下反应30 min，使用琼脂糖凝胶电泳测定菌液上清液对DNA的降解能力。

将菌株在LB液体培养基中活化培养，30 ℃振荡培养至对数生长后期，在4 ℃、4 000 r·min⁻¹条件下离心8 min，收集菌体，用 PBS缓冲液（pH = 7.4）洗涤2次，重复3次重悬在Triton X-100（ 体积百分数为0.1% ）缓冲液中，测定其OD₆₀₀值， 随后在 30 ℃、180 r·min⁻¹下振荡培养。每隔1 h测定菌株OD₆₀₀值。细菌的自溶率可以通过以下公式得出：

自溶率（%）= 即时吸光度/初始吸光度×100 ，

其中，即时吸光度表示细菌每间隔1 h后的OD₆₀₀值，初始吸光度表示初始重悬后菌液的OD₆₀₀值。

将菌种活化后挑选单菌落在5 mL LBS液体培养基培养14 h，按1﹕100 （L/μL）接种量将菌液转入新鲜LB培养基中震荡培养至菌液OD₆₀₀值为0.6，将所有菌株菌液OD₆₀₀值调整至相等，按上述接种方式与接种量将菌液接种至新鲜LB液培养基中，混匀后按每孔200 μL培养液转入96孔板，重复5次。孔板置于30 ℃培养箱中培养，在4 h、8 h、16 h、20 h、24 h后分别取出孔板，弃上清，用1×PBS（pH=7.4）洗脱放置55 ℃条件下烘干15 min，加入0.1%结晶紫溶液（CV）220 μL，30 min后，弃CV溶液，用1×PBS（pH=7.4）进行3次洗脱，将孔板放置55 ℃条件下烘干15 min，每孔加 200 μL 95%乙醇进行30 min再溶，酶标仪测定孔板OD₅₇₀值，以时间为横坐标，以OD₅₇₀值为纵坐标绘制生物被膜形成量曲线。

通过全基因组系列分析发现溶藻弧菌HN08155含有3个tatD基因，分别对其命名为tatD1（tatD2409）、tatD2（tatD2024）、tatD3（tatD0097），通过PCR扩增与生物信息学分析发现其碱基对tatD1全长为774bp， tatD2为768 bp，tatD3为762 bp（美吉：MJ20211021082，图1）。Pafm分析工具分析发现3个同源蛋白都带有TIM-桶状的TatD结构域，该结构域具有Mg²⁺依赖金属水解酶与3’-5’ ssDNA/RNA核酸外切酶特性。

Figure 1.  Illustration of Vibrio alginolyticus tatD Gene

PCR扩增tatD基因上下游片段条带清晰（图2-A），目的基因与自杀质粒经双切后连接构建重组载体，利用tatD-T-F+T-R引物验证条带清晰（图2-B）。将重组载体PDM4-tatD转化至溶藻弧菌HN08155，通过自杀质粒的特点构建tatD基因缺失型菌株，利用tatD1-TF+TR、tatD2-TF+TR、tatD3-TF+TR引物筛选并验证目的基因缺失菌株。结果表明，HN08155菌株中的完整条带在2 000 bp左右，tatD基因缺失菌株条带在1 100 bp左右（图2-C），将PCR产物纯化回收送测，测序结果证明正确。构建成功的基因缺失菌株分别命名为△tatD1、△tatD2、△tatD3、△tatD12、△tatD13、△tatD23、△tatD123。

Figure 2.  Cloning of tatD gene from Vibrio alginolyticus and screening of tatD gene deletion strains.

溶藻弧菌HN08155（WT）与tatD基因缺失株在正常营养条件下，48h内的生长曲线如图3-A所示， 溶藻弧菌野生株与tatD基因的缺失株生长趋势相似。最初各种菌株都处于生长延迟期，在这个时期内，各菌株生长速度较为缓慢；在对数生长期时，细菌生长迅速，并且细菌数量呈指数级增加，在各菌株进入了生长平台期后，细菌增长稳定，生长曲线基本上趋于一致。结果表明，单独缺失tatD任何一个基因，或者缺失两个基因，以及三者同时缺失，均未对溶藻弧菌HN08155的生长特性产生明显影响。在营养条件较低的M9培养基中，各tatD基因缺失菌株的生长能力明显高于野生株。其中△tatD123、△tatD2与△tatD3菌株生长趋势显著上升（ P < 0.000 1）（图3-B），在培养48 h后，tatD基因缺失株菌体浓度均高于野生株。同时，在不添加Fe²⁺时，野生菌株与缺失菌株生长差异明显，而在添加Fe²⁺后，各菌株生长差异不显著，菌株生长趋势与菌体浓度差异缩小（图3-C）。表明溶藻弧菌tatD基因在不同营养条件下表现出了不一样的功能。

Figure 3.  Determination of the growth capabilities of wild-type strain HN08155 and tatD gene deletion strains

Figure 4.  Bacterial cell density of the wild-type strain HN08155 and the tatD gene knockout strain in M9 medium containing Fe²⁺ after 6 hours and 8 hours

溶藻弧菌野生株与tatD基因缺失株上清液对DNA的降解能力结果见图5，野生株上清液的降解DNA效果明显高于缺失株，而三基因缺失株的降解效果显著下降。△tatD12菌株上清液的降解能力比其它双基因缺失株要弱。在单一基因缺失菌株中，△tatD3菌株的上清液降解能力明显高于其它单基因缺失株。此外，在添加EDTA后，无论是野生株还是基因缺失菌株，均失去了对DNA的降解能力。结果表明，溶藻弧菌tatD基因的表达提升了其核酸酶活性，在这一过程中表现出了对于金属离子的需求，在这一点上与，DNase I酶发挥作用时表现出了相似性，其中，tatD2基因降解DNA分子的能力最高。

Figure 5.  Analysis of DNA degradation using agarose gel electrophoresis

在Triton X-100（体积浓度为0.1%）的诱导下。对溶藻弧菌HN08155（WT）及其tatD缺失菌株进行的自溶活性分析结果如图6所示。图7显示了在6和12 h，测定的野生菌株与tatD缺失菌株的自溶率。在0～6 h内，野生株和tatD基因缺失株的自溶活性曲线呈现缓慢下降趋势，在6 h的时候，两者自溶率之间尚无显著性差异，而在6～12 h，野生株和tatD基因缺失株的自溶活性曲线下降速度加快，12 h的时候，tatD基因缺失株自溶率显著高于野生株。结果表明，与野生型菌株相比，tatD基因缺失株的自溶活性显著降低。

Figure 6.  Self-lysis curve of HN08155 and tatD gene knockout strains

Figure 7.  Comparison of autolysis ability between HN08155 and tatD gene knockout strains

本实验测定了野生株和tatD基因缺失株在24 h内生物膜形成量（图8）。图9显示了在8 h时野生型和tatD基因缺失株的生物被膜形成量。实验显示tatD基因缺失株生物被膜形成量与生物被膜形成趋势均高于野生株。在这一阶段，各菌株的生物被膜量快速增加，在经过8 h后，除了△tatD13基因双缺失株和△tatD123三基因缺失株外，其他所有菌株都已达到了其生物被膜形成量的峰值。其中溶藻弧菌△tatD13菌株的生物被膜形成量最多；在8～16 h时,除了△tatD13基因双缺失株△tatD123三基因缺失株之外，其他菌株的生物被膜逐渐出现溶解下降的趋势。而在16～20 h的时间段内，所有菌株的生物被膜形成量都呈现了先上升后下降的波动。这种波动趋势的出现可能是由于后期菌体聚集所造成的，进而导致生物膜形成量曲线出现异常上升现象。在8 h，△tatD2、△tatD12、△tatD123菌株形成的生物被膜量与厚度、密度均高于野生株。研究结果表明，溶藻弧菌在缺失tatD基因后，其生物被膜形成量增加，而降解生物被膜的能力减弱。这证实了tatD基因具有调控生物被膜形成和抑制生物被膜形成的能力。

Figure 8.  Biofilm formation of wild-type（WT）strain and tatD gene deletion mutant

Figure 9.  Biofilm formation of the wild-type（WT）strain and a tatD gene deletion mutant after 8 hours

为了深入研究溶藻弧菌HN08155菌株中tatD基因的功能和作用机制，本研究构建了tatD基因缺失突变株，并对其进行生物学特性分析。实验结果显示，在正常营养条件下，tatD基因的缺失对溶藻弧菌的生长能力没有影响。一些类似研究结果也表明，tatD基因不参与细菌生长调控，如单增李氏特菌、化脓性隐球菌、肺炎链球菌和迟缓型艾德华氏菌在失去tatD基因后，其生长能力并未受到影响^[21]。不过，进一步的实验表明，在营养较为匮乏的环境下，tatD基因敲除菌株相较于野生型菌株表现出了更好的生长能力，各缺失株与野生株相比具有明显的生长趋势上的差异，在添加Fe²⁺后，各菌株生长差异会显著降低。这种差异可能是由于tatD基因缺失菌株能够形成较野生株更多的生物膜，膜中细菌生长缓慢以及被膜的保护能力增强了tatD基因缺失株的生长能力；也有研究结果表明，tatD是铁硫蛋白质控制中心组成成分之一，对于蛋白的输出至关重要^[22]，在M9培养条件下可能影响了离子相关蛋白的输出，进而影响了菌株的生长；以上实验结果证明了tatD基因并非溶藻弧菌生长核心基因，在正常营养条件下缺失了tatD基因并不会影响溶藻细菌的生长。而在不利的环境条件下，溶藻弧菌可能通过tatD基因调控形成生物被膜，或影响了离子相关蛋白的输出，进而影响了菌株的生长。

在应对不利的环境条件以及维持群体稳态中，生物被膜发挥着至关重要的作用。研究发现tatD基因缺失后缺失株生物被膜生成量均高于野生株，其中△tatD13缺失株形成的生物被膜最多，以上实验结果说明tatD基因参与了生物被膜形成的调控。生物被膜保护性取决于其胞外聚合物（EPS）的组成，由于不同细菌能够产生多种多样的EPS。在这个复杂的过程中，胞外多糖和胞外蛋白差异显得尤为关键^[23]。与胞外多糖、蛋白不同，eDNA是生物被膜网状分子结构的组成成分。本研究团队在上清液降解小牛胸腺DNA的实验中，分析野生株与缺失株对于DNA分子的降解能力，结果发现，tatD基因的存在增强溶藻弧菌对于DNA分子的降解能力，同时对于金属离子的需求，与DNase I酶发挥作用时表现出了相似性。

eDNA从细胞内部释放到胞外的方式之一就是自溶。在深入研究tatD基因时，发现tatD DNases 参与多种微生物的程序性凋亡^{[24 − 26]}。推测tatD可能参与了细菌自溶，从而释放eDNA，对此本研究开展了溶藻弧菌自溶性分析实验，实验结果表明，溶藻弧菌在缺失tatD基因后自身自溶活性受到了影响，自溶能力下降。tatD基因参与了细菌自溶，但仍没有直接证据表明溶藻弧菌通过菌体自溶释放eDNA进而促进细菌生物被膜的形成。

本研究通过构建tatD基因缺失菌株，初步探究了tatD基因在溶藻弧菌生长与生物被膜形成等方面的功能，结果表明，在正常营养条件缺失tatD基因不会影响细菌的生长，在营养贫瘠的条件下，tatD基因可能参与了细菌的生长调节。同时，tatD基因也参与溶藻弧菌生物被膜形成与细菌自溶性的调节，缺失tatD基因，生物被膜形成量增加；自溶性下降。这些结果为研究tatD基因在弧菌致病机制中的功能奠定了基础。