Cloning of MeARF and screening of interacting proteins in cassava

本研究使用的木薯品种为‘华南124’，培养方法为盆栽，固体培养基由蛭石和营养土3∶1的比例混合制成，截取2 ～ 3个芽点的木薯茎杆，将其插入在培养基中培养，置于温室中培养，培养温度为28 ℃，湿度为80%。

取约0.3 g的木薯侧芽放于加入液氮的研钵中进行迅速研磨，将研磨好的样品使用CTAB裂解细胞的方法提取RNA（注意使用无酶EP管，在冰上进行实验），之后用分光光度计测定RNA的浓度，将所得的RNA放置于−80 ℃保存。

使用反转录试剂盒（YEASEN，11151ES10/11151ES60）将RNA反转录为cDNA。配置反转录体系（表1）于1.5 mL无酶离心管，在37 ℃水浴条件下反应5 min用于cDNA合成以及gDNA的消化，最后在85 ℃水浴的条件下放置30 s，由此来终止反应，将所得反应产物放置于−80 ℃保存。

通过开放数据库Phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）查找木薯MeARF的相关信息，发现MeARF的CDS区域长度为2 861 bp；由于MeARF全长过大，本研究以cDNA为模板对MeARF进行了分段克隆并送测序后，合成全长大小为2 861 bp的目的片段，并连上pEASY-Blunt3载体（Transgen，CB301-01），然后以Blunt3-MeARF为模板进行片段的扩增。PCR反应体系20 μL，包括Mix（Vazyme，P112-03）10 μL，ddH₂O 8 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，模板1 μL（PCR反应程序如表2所示）。

通过开放数据库Phytozome查找木薯MeARF的氨基酸序列，将该序列进行Blast比对，得到不同物种中与MeARF同源性较高的氨基酸序列，将这些序列输入MEGA11软件上绘制成进化树。

通过Uniprot在线数据库（https://www.uniprot.org/id-mapping/）和SWISS-MODEL网站（https://swissmodel.expasy.org/）进行MeARF蛋白结构的预测分析。

使用Primer5软件进行定量引物的设计，设计了前端引物QMeARF-F和后端引物QMeARF-R。以cDNA（木薯的茎、叶柄、叶片、侧芽和须根）为模板，用荧光定量PCR仪进行扩增，PCR程序如表3所示。反应体系为：ddH₂O 6.5 μL，cDNA 0.2 μL，前端引物0.4 μL，后端引物0.4 μL，SYBR荧光染料（Vazyme，Q111-02）7.5 μL。

使用（https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html）网站设计特异性引物MeARF-AD-F/R，酶切位点选择NdeⅠ和EcoRⅠ，以Blunt3-MeARF质粒为模板，进行PCR扩增，回收目的片段，酶切pGADT7载体并进行胶回收，通过同源连接的方法进行目的基因和线性载体的连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α（Zomanbio，ZK206），在氨苄抗性的固体培养基培养10 h，挑取单菌落，并以挑取的菌落为模板进行PCR验证，将得到的阳性克隆对应的菌液加入到相应抗性的液体LB中，置于摇床中进行培养（37 ℃，150 r·min⁻¹），提取质粒，并进行双酶切验证，送测序，将测序的结果与Phytozome网站上的MeARF序列进行校对，与目的片段的序列一致，则完成相关基因表达载体的构建。本研究引物合成均由华大基因公司完成（表4）。

取−80 ℃保存的AH109菌株，划线于YPDA固体平板上，置于28 ℃培养2 ～ 3 d；挑取平板上生长的酵母单菌落，置于5 mL的YPDA液体中，28 ℃摇床培养8 ～ 10 h；吸取一定量的AH109菌液，置于50 mL的YPDA溶液中进行转摇，调节初始OD₆₀₀为0.2 ～ 0.3，之后置于28 ℃培养3 ～ 5 h，使OD₆₀₀值到达0.6左右；将菌液分装在50 mL离心管中，4 000 r·min⁻¹，低转速离心10 min，去上清；每管加入20 mL 的ddH₂O重悬，4 000 r·min⁻¹，低转速离心10 min，去上清；加入2 mL的1×TE/LiAC重悬，完成酵母感受态细胞的制备。

将ssDNA，木薯pGBKT7文库质粒，pGADT7-MeARF质粒各10 μL混合于2 mL离心管中，做8 ～ 10组；每管加入200 μL的酵母感受态细胞；加600 μL的PEG/LiAC，上下颠倒混匀，在28 ℃摇床培养1 h；加入70 μL的DMSO（Solarbio，D8370-100），42 ℃水浴热激30 min；12 000 r·min⁻¹离心30 s，去上清；沉淀用300 uL的1×TE重悬后涂布于SD-Trp-Leu（Coolaber，PM2220）和SD-Trp-Leu-Ade-His（Coolaber，PM2110）固体培养基上，放置于28 ℃的培养箱中进行培养。

将转化后的酵母在28 ℃培养箱培养3 d，挑取在SD-Trp-Leu-Ade-His固体培养基上生长的酵母单菌落于5 mL的SD-Trp-Leu-Ade-His液体培养基中，在28 ℃的摇床中培养；3 d后，提取酵母质粒，分别使用MeARF-AD-F/R和pGBKT7-F/R引物对质粒进行扩增，将阳性克隆对应的目的片段进行回收，把回收的片段送测序。使用开放数据库Phytozome对测序的结果进行比对分析，最终得到与MeARF相互作用的候选蛋白。

扩增MeARF片段，同时将pGADT7载体质粒用Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ进行酶切，电泳条带大小符合预期实验结果（图1−A）；挑取单菌落进行菌落PCR，电泳结果表明存在条带清晰单一的阳性克隆（图1−B）；提取质粒进行双酶切验证，酶切位点选择Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ，结果表明，酶切后的条带大小约为2 800 bp，符合目的片段的大小（图1−C）。将质粒送序列检测后结果一致，最终完成相关表达载体的构建。

Figure 1.  Amplification of the MeARF fragments and constructing the expression vector of pGADT7-MeARF

选取26个不同物种与MeARF同源性较高的氨基酸序列，将这些序列与MeARF的氨基酸序列一起输入到MEGA软件上绘制成进化树（图2）。结果表明，大戟科橡胶树属的橡胶树中的HbARF与MeARF的亲缘关系较近，用DNAMAN软件比对二者的氨基酸序列，置信度为86.73%。

Figure 2.  Construction of the evolutionary tree of ARF

为了解析MeARF的功能，本研究首先分析了MeARF的蛋白结构。发现MeARF的结构域包含一个位于N端156-258 aa的B3结构域（B3 DNA binding domain，B3），该区域与结合元件AuxRE（Auxin-responsive element，AuxRE）有关。该蛋白的C端含有一个位于839～923 aa处的PB1结构域（Phox and Bem1p，PB1），能够与Aux/IAA（Auxin/indoleacetic acid，Aux/IAA）互作，稳定ARF的二聚体并促进其结合DNA（图3）。

Figure 3.  Structural analysis of the MeARF protein

为了分析MeARF在木薯不同组织中的表达情况，本研究利用在线数据绘制图4−A。结果发现，MeARF在有组织的胚胎发生结构和侧芽的表达量较高；并且相关研究表明生长素可以调控植物胚胎的发育并促进侧芽的萌发^{[14 − 15]}，这些结果进一步说明了MeARF与生长素之间的联系。

Figure 4.  Expression profiling of MeARF in different tissues of cassava

为了验证MeARF在木薯不同组织中的表达情况，本研究测定了MeARF在木薯茎、叶柄、叶片、侧芽和须根的表达量，结果发现MeARF在木薯侧芽的表达量最高，在木薯叶片的表达量最低，这个结论与在线数据库的结果类似，进一步说明了MeARF在木薯的不同组织都存在表达（图4−B）。

为探讨pGBKT7-MeARF进行酵母双杂交筛选pGADT7文库的可能性，本研究首先进行了pGBKT7-MeARF的自激活实验，通过观察pGBKT7与pGBKT7-MeARF两种组合分别在SD-Trp和SD-Trp-Ade-His固体培养基的生长情况来判断pGBKT7-MeARF是否有自激活现象。实验采用了4种浓度梯度稀释接种在培养基上。实验结果表明，pGBKT7与pGBKT7-MeARF两种组合均在SD-Trp固体培养基上生长；而在SD-Trp-Ade-His固体培养基上，只有pGBKT7-MeARF组合的酵母生长（图5）。这些现象说明了pGBKT7-MeARF存在自激活现象，可以单独激活下游基因的表达。

Figure 5.  The self-activation validation of pGBKT7-MeARF

由于pGBKT7-MeARF存在自激活现象，本实验采用pGADT7-MeARF作为诱饵蛋白对木薯的pGBKT7文库进行筛选，发现在SD-Trp-Leu固体培养基上均有酵母生长，在SD-Trp-Leu-Ade-His固体培养基上一共得到了12个单菌落，把这些单菌落在SD-Trp-Leu-Ade-His固体培养基上划线保存，发现其可以在SD-Trp-Leu-Ade-His固体培养基上正常生长（图6−A）。挑取这些单菌落，摇菌，提取酵母质粒，使用MeARF-AD-F/R引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表明存在6个阳性克隆（图6−B）；另外，使用pGBKT7-F/R引物进行菌落进行扩增，共得到8个单一条带（孔道3含有3条单一条带）（图6−C）。选择对应的目的条带进行切胶回收，并将回收的片段送测序。

Figure 6.  Screening of the cassava pGBKT7 library by using pGADT7-MeARF

对测序的结果进行比对，最终得到了7个候选蛋白（表5），分别是：线粒体相关的NADH脱氢酶[泛醌]-铁硫蛋白8-a（Manes.15G163400.1）、依赖钠的磷酸盐转运蛋白（Manes.14G035900.1）、多聚泛素4（Manes.14G035900.1）、GTP酶激活蛋白REN1（Manes.02G146100.1）、木薯生长素应答蛋白IAA8（Manes.05G187100.1）、溶质载体家族35（Manes.17G049400.1）、富含亮氨酸的重复蛋白，一些含有F-box的蛋白质（Manes.05G050000.1）。使用数据库中的E值和置信度来反映比对结果的可靠性，结果表明这7个测序结果与候选蛋白序列比对的置信度都在90%以上，E值接近或者等于0，这些结果表明了序列比对的准确性。

ARF作为生长素信号通路的重要组成部分，在植物的生长发育以及逆境胁迫中发挥着重要作用^{[2, 10]}。已经有27个ARF基因在木薯中被鉴定^[16]，但其在木薯发育及逆境胁迫的研究较少。本研究通过对其蛋白结构以及在木薯中各组织中的相对表达量的分析，并筛选到相关互作蛋白，为这一基因的功能研究提供研究基础。

为了探究MeARF的功能，本研究首先通过构建进化树的方法，发现大戟科橡胶树属的橡胶树中的HbARF与MeARF的亲缘关系较近（图2）。ARF结构的多样性，影响了其功能的差异性，进而影响生长素的作用^{[17 − 19]}，因此深入对ARF的蛋白结构进行研究，有利于更好的解析生长素在植物中的作用。当前的研究普遍认为，ARF蛋白主要包括3个结构域：N端的DNA结合域（DNA binding domain，DBD），中间区域（Middle region，MR）和C端PB1结构域^[17]。DNA结合域主要负责与生长素响应元件结合，其与顺式作用元件的相互作用是通过植物特有的B3亚结构域发生的^[18]。MR结构域作为ARF功能的决定因素，其参与了生长素感知、蛋白质可用性控制和DNA结合调节的过程中，还具有作为相互作用枢纽的潜在作用^[19]。PB1结构域具有稳定ARF与DNA的结合和与Aux/IAA相互作用的双重功能^[20]。本研究通过对MeARF蛋白的三维结构进行分析，发现了MeARF蛋白含有B3和PB1两个结构域（图3），但是对于MeARF的B3结构域是否可以与下游的生长素响应元件结合还尚不清楚。通过在线数据库预测，发现MeARF在木薯的很多部位都存在表达，其中MeARF在有组织的胚胎发生结构和侧芽的表达量较高（图4），说明MeARF可能参与木薯胚胎和侧芽的发育，这为这一基因的功能研究提供了潜在的基础。

ARF作为转录因子，通过与一系列蛋白互作在植物中发挥作用。相关研究发现，生长素响应因子ARF与Ethylene response factor108（ERF108）相互作用，介导棉花纤维次生细胞壁的生物合成^[21]。还有研究表明，植物激素油菜素内酯、生长素和赤霉素通过Brassinazole resistant（BZR）-ARF-Phytochrome-interacting factor（PIF）/DELLA的协同作用调控拟南芥中光形态建成相关的下胚轴伸长^[22]。另外，ARF2与Ethylene-insensitive3-like1（EIL1）之间的相互作用可增强EIL1的活性，从而促进木瓜成熟过程中相关基因的表达^[23]。在拟南芥中，ARF4能够通过竞争ARF5与IAA12结合来调控芽再生过程^[24]。MeARF作为一个转录因子，其可能存在于一个巨大的互作网络中，本研究通过酵母双杂交实验获得了7个互作蛋白，其中一部分是与植物生长发育相关的蛋白，包括了线粒体相关的NADH脱氢酶[泛醌]-铁硫蛋白8-a、GTP酶激活蛋白REN1、木薯生长素应答蛋白IAA8和富含亮氨酸的重复蛋白，一些含有F-box的蛋白质。其中，对于模式植物拟南芥，其线粒体中的NADH脱氢酶亚基可以挽救slow growth3（slo3）突变体的生长缺陷以及种子的发育缺陷^[25]。另外，Rho GTP酶激活蛋白REN1可以通过抑制拟南芥花粉管中的Formin homology5（FH5）来控制顶端肌动蛋白聚合^[26]。在杨树中，ARF7.2的MR和PB1结构域分别负责其与DELLA或Aux/IAA蛋白的相互作用，进而调节杨树形成层的发育^[27]。而MeARF也包含了PB1结构域，因此推测MeARF蛋白可能通过PB1结构域与AUX/IAA8的相互作用。大豆中存在一种具有C端leucine-rich repeat（LRR）结构域的F-BOX蛋白（F-BOX proteins with C-terminal LRR domains，FBXL），其可以显著提高大豆的种子产量、豆荚数、每株种子数、株高^[28]。另外，本研究还筛选到了与植物胁迫相关的蛋白，比如多聚泛素4。之前的研究表明，在不同的胁迫下（渗透胁迫、生理盐水胁迫和冷冻胁迫），水稻中的多聚泛素启动子基因存在差异表达^[29]。除此之外，筛库还获得了一些目前在植物中研究较少的蛋白，如依赖钠的磷酸盐转运蛋白、溶质载体家族35，它们在植物中的功能以及作用机理还有待进一步研究。

综上所述，本研究通过分析MeARF的蛋白结构域（DBD、MR和PB1结构域）及其在木薯不同组织中的相对表达量，并获得了7个与MeARF相互作用的候选蛋白，可为后续进一步解析MeARF在木薯中的功能验证和作用机理奠定了理论基础。