Analysis of prokaryotic protein expression and disease resistance function of cassava gene RXam2

供试材料为‘华南124’木薯品种，将木薯茎杆截成10～15厘米茎杆（保留2～3芽点），种植在混有营养土和蛭石的花盆中，茎杆于28～30 ℃和12 h光照/ 12 h黑暗条件下生长。

通过数据库phytozome（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/blast-search）查找MeRXam2的CDS序列，用Primer 5.0软件设计引物，引物合成和测序委托华大基因公司完成，具体引物信息如（表1）所示。

取木薯叶片0.2～0.5 g，用液氮研磨充分，采用CTAB提取法提取木薯RNA。用反转录试剂盒（11151ES0，YEASEN）将RNA反转录为cDNA，每个RNA样品取4 μL，依次加入反转录酶混合体系5 μL、水11 μL，混合均匀后，37 ℃反应5 min，85 ℃终止反应，RNA与cDNA存放在−80 ℃冰箱保存备用。

以cDNA作为模板，用FastPfu DNA Polymeraset扩增MeRxam2片段，琼脂糖凝胶电泳检测基因片段大小，将目的片段用胶回收试剂盒回收，将回收的片段与 pEASY-Blunt3 连接，并转化到DH5α感受态细胞中（ZC101-2，ZOMANBIO），然后挑选单菌落进行菌落PCR验证，PCR程序设置程序如下：预变性95 ℃，3 min、变性95 ℃，30″、退火55 ℃，3 min、延伸72 ℃，片段长度1000 bp/min、变性至延伸设置循环n≥32次，最终延伸72 ℃，5 min。若为阳性克隆，挑选单一明亮的单克隆菌株送华大公司测序，测序返回结果与网站上的序列进行比对，将MeRXam2序列一致的菌液保存。

蛋白质的理化性质通过在线软件（https://web.expasy.org/protparam/）进行分析；通过在线软件（https://www.uniprot.org/）绘制蛋白质的二级结构；蛋白质的三级结构通过在线工具SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行预测；磷酸化位点通过（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）进行预测，蛋白的跨膜结构相关信息通过（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测，构建进化树所需序列在NCBI网址（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上下载，利用MEGA.11软件进行进化树的构建。

用Xam侵染木薯叶片组织，然后分别取0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h的样品提取RNA，反转录为cDNA，用实时荧光定量PCR检测MeRXam2的表达量，使用0.1 mL 96孔qPCR板白色（KG2554，KIRGEN），在实时荧光定量系统（CFX Connect™ Real-Time，Bio-RadLaboratories）中进行。

提取构建成功的MeRXam2-Blunt3载体质粒，以质粒为模板，扩增MeRXam2的片段，用限制性内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切载体pET32a，用同源重组连接的方法将MeRXam2片段连接到已经线性化的pET32a 载体上，转化后，经过菌落PCR验证，挑选具有单一明亮条带的菌落，并用LB液体培养基培养，提取质粒，双酶切验证，符合预期大小，并送华大公司测序，若序列一致，即视为构建载体成功。

将构建成功的质粒MeRXam2-pET32a转入到BL21（DE3）感受态细胞（ZC121-2，ZOMANBIO），经PCR验证，挑选具有单一明亮的菌落进行后续的实验。将过夜的菌液加入新鲜含氨苄青霉素钠抗性的LB液体培养基中，使菌液的OD₆₀₀值为0.1～0.2，放入摇床中培养（37 ℃，150 r·min⁻¹），当OD₆₀₀值达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为1 mol·L⁻¹，继续放入摇床中（37 ℃，150 r·min⁻¹）进行培养并诱导蛋白。与此同时，取0、1、3、6 h的蛋白样品，离心（12 000 r·min⁻¹，10 min），弃上清，菌体用100 μL PBS（pH7.4）重悬，超声波破碎，离心（4 ℃，12 000 r·min⁻¹，5 min），弃上清，沉淀用PBS悬起，然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blot）检测，并测定蛋白浓度。

细菌数的测定：木薯在接种Xam后喷施蛋白，于0、3、6天后用打孔器取相同大小的叶片，用75%的乙醇浸泡5 min，灭菌水清洗3次，吸水纸吸干叶片表面水分，用研磨器将叶片组织磨碎，加入灭菌水混匀，在超净工作台里进行梯度稀释，并点在不含抗性的固体的培养基中，倒置放入28 ℃恒温培养箱进行培养，第2天进行细菌数的统计。

为克隆MeRXam2基因，首先提取木薯叶片总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量发现有28 s、18 s条带（图1-A），即为RNA提取成功。然后将RNA反转录成cDNA，用木薯内参基因进行PCR检测cDNA的质量，发现可扩增单一条带，说明cDNA反转录成功（图1-B）。最后以cDNA为模板，扩增MeRXam2目的片段，得到与预测大小一样的片段（图1-C）。

Figure 1.  Acquisition of the MeRXam2 gene

通过对MeRXam2蛋白磷酸化位点进行预测，发现有多个磷酸化位点（图2-A），通过构建进化树发现与MeRXam2同源性最高的是橡胶树（Hevea brasiliensis）HbRXam2 （图2-B），橡胶树和木薯同属于大戟科植物，两条蛋白序列同源性达到84.26%。此外，对蛋白进行了跨膜结构域预测，该蛋白不存在跨膜结构域（图2-C）。

Figure 2.  Physio-chemical analysis and evolutionary tree construction of MeRXam2 protein

基于TCOD expression在线数据库（https://ngdc.cncb.ac.cn/tcod/expressions）中MeRXam2在不同组织的表达情况，并绘制成柱状图，发现MeRXam2在胚胎发生结构和易碎胚性愈伤组织的表达量相对较高（图2-D）。此外，我们通过对蛋白结构的预测，发现MeRXam2结构主要包括3个区域：靠近N端的CC结构域（35～55 aa）、中间区域的NB-ARC（170～519 aa），NB-ARC其中又包含3个小区域，分别是NB结构域（170～323 aa），ARC1结构域（324～401 aa），ARC2结构域（402～519 aa）、还有靠近C端的LRRs结构域（520～1186 aa），LRRs是典型的NLR结构，根据在线软件（https://www.uniprot.org/）提供的信息绘制了该蛋白的结构（图2-E）。另外，我们还通过网站绘制了MeRXam2的三级结构（图2-F）。蛋白质的理化性质通过在线软件（https://web.expasy.org/protparam/）进行分析，结果表明MeRXam2为木薯特异性免疫系统的受体NLR蛋白，CDS序列有3516 bp，氨基酸序列有1 186 aa，该蛋白分子式为C₅₉₄₇H₉₅₉₆N1₅₉₈O₁₇₁₃S₆₁，预期蛋白大小约为132.847 kD，理论等电点8.12。

为了了解MeRXam2是否参与到木薯的抗病过程中，采用实时荧光定量PCR技术检测MeRXam2基因在木薯被Xam处理0 h、1h、3 h、 6 h、12 h和24 h后的表达水平。研究结果发现随着时间的变化，MeRXam2表达量逐渐增加，且在24 h时的表达量达到最高（图3），这表明MeRXam2可能参与到木薯抗病反应过程中。

Figure 3.  MeRXam2 gene expression profile level

为构建MeRXam2-pET32a原核蛋白表达载体，首先用PCR体系扩增了MeRXam2片段（图4-A），通过同源重组连接的方法，将目的基因与已用限制性内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切好的载体pET32a连接（图4-B），转化到DH5α感受态细胞中，通过菌落PCR验证，挑选阳性单克隆（图4-C），用含氨苄青霉素钠抗性的液体LB培养，提取质粒，双酶切验证，切下来的目的片段大小符合（图4-D），并送测序验证，测序结果返回与序列一致，即为载体构建完成。

Figure 4.  Construction of MeRXam2 gene vector

为探究蛋白的功能，本研究进行了MeRXam2-pET32a的蛋白诱导，结果发现能在37 ℃下诱导出蛋白，并且随着时间的增加，蛋白的浓度也增加（图5-A～图5-B）。为进行后续的实验，对6 h的蛋白用酶标仪测定蛋白浓度，MeRXam2蛋白在595 nm吸光度平均值为0.735，标准曲线Y=0.5493X+0.4016（R²=0.993 8），最终得出蛋白浓度为0.608 g·L⁻¹。

Figure 5.  MeRXam2-pET 32 protein

为探究MeRXam2蛋白对Xam繁殖的影响，我们对木薯叶片接种了Xam病原菌，并对接种了Xam的木薯植株分别外源喷施水、pET32a蛋白和MeRXam2蛋白，检测病菌的繁殖情况，结果发现，对照组的细菌数显著高于实验组（图6），推测MeRXam2蛋白可能参与了木薯的抗病过程，并且外源喷施MeRXam2蛋白可有效减缓病原菌的繁殖。

Figure 6.  The influence of MeRXam2 protein on pathogenic bacteria

植物中编码NLR结构域的基因是植物中重要的抗病基因，能够识别病原菌微生物，调节免疫反应^[27]。基于木薯细菌性枯萎病害的危害性，鉴定和分离木薯抗病基因具有重要意义^[28]。因此挖掘出有利用价值的NLR基因，对提高木薯产量和保证粮食安全具重要意义^[29]。

目前研究表明，不同物种中皆发现了具有NLR结构的蛋白，该结构蛋白常具有NBS和LRR结构域，如苜蓿（Medicago ruthenica）基因组中共鉴定出338个NLR基因^[30]，薯蓣（Dioscorea polystachya ）基因组中鉴定出167个NBS-LRR基因^[31]，猕猴桃（Actinidia chinensis ）基因组中鉴定了100个NBS-LRR基因^[32]，研究对12个蔷薇科基因组进行有关NBS-LRR基因搜索，筛选出2 188个NBS-LRR基因^[33]。本研究中分析了木薯MeRXam2的蛋白结构，发现MeRXam2的C端含有一种典型的NLR结构-LRR结构域（520-1186 aa）（图2E），这表明MeRXam2是NLR基因。

不同物种的NLR蛋白都与抗病性有关联，例如，水稻（Oryza sativa）^[34]、拟南芥（Arabidopsis thaliana ）^[35]、小麦^[36]等物种。在具有NBS-2的转化体的水稻中，其植株对叶瘟病能产生抗性，通过基因转化和标记辅助选择渗入易感籼稻品种中，赋予了籼稻株对叶片稻瘟病的抗性^[34]。在拟南芥中ZAR1抗病小体，作为钙渗透性阳离子通道来触发免疫和细胞死亡^[35]。在小麦中发现TaRACK1B能调节小麦花叶病毒感染的免疫反应，病毒可能会破坏植物NLR蛋白复合物，抑制NLR蛋白介导的广谱抗病毒免疫反应，从而导致小麦易受病毒感染^[36]。与此一致的是，本研究通发现MeRXam2可以参与到木薯抗病应答反应中（图3）。在有关蛋白与植物的抗病研究中，外源喷施超敏蛋白对葡萄霜霉病有抑制效果^[37]。进一步对MeRXam2蛋白抗病功能分析中，Xam的繁殖受到外源喷施的MeRXam2蛋白的影响，MeRXam2蛋白可有效缓解细菌的侵染（图6）。NLR蛋白在体内同样也发挥了重要作用，在NLR蛋白在植物防御反应中，有通过充当守卫或诱饵，有作为下游信号转导成分，有调节蛋白结构等各种机制，进而影响植物的免疫反应^[38]。后续可进一步研究MeRXam2在木薯体内的具体抗病分子机制。

综上所述，NLR基因是植物中重要的抗病基因家族，NLR蛋白对提高植物免疫力具有巨大潜在研究价值，本研究为木薯分子育种提供了理论依据和候选蛋白。