Cloning and preliminary functional analysis of MeIAA19 in cassava

试验材料为木薯品种‘SC124’ （South China 124）的后代，种植于海南大学海甸校区热带农业试验基地（20°03′N，110°19′E）。

取适量木薯叶片进行液氮速冻，将其充分研磨至粉末，使用CTAB法^[20]提取RNA，反转录为cDNA后，−80 ℃低温储存。

根据Phytozome数据库中木薯MeIAA19基因的序列信息，设计全长扩增引物MeIAA19-F（ATGGCGAGCGTGCTAGGAGGC）和MeIAA19-R（TCAGGTTCTGCTCTTGCATTT）。以木薯cDNA为模板，使用Pfu高保真酶扩增MeIAA19片段。产物经琼脂糖凝胶电泳检测后进行切胶回收，并连接至pEASY-T3载体中。转化后经菌落PCR检测，挑选条带单一的阳性克隆测序验证。将测序对比结果与目的片段一致的菌液低温保存备用。

通过在线软件ProtParam分析MeIAA19编码蛋白的理化性质。使用在线网站InterPro鉴定MeIAA19蛋白序列内的保守结构域。通过数据库Phytozome13查找MeIAA19在其他物种中的同源序列，并运用DNAMAN软件进行比对。

利用数据库UniProt对木薯MeIAA19蛋白进行亚细胞定位预测。构建植物表达载体pEGAD-MeIAA19，与空载pEGAD分别转入GV3101农杆菌感受态，并侵染烟草叶片48 h后，通过激光共聚焦显微镜观察侵染的叶片。

根据同源重组原理重新设计引物，并在R端加Flag标签，以测序正确MeIAA19-T3的质粒为模版扩增目的片段，连接至BamHI和EcoRI酶切回收后的pET32a载体上，进一步挑取单菌落进行PCR并酶切验证。将验证成功的质粒转入DE3大肠菌株中，并诱导蛋白。菌液OD₆₀₀值为0.6左右时，加入IPTG，并取0、1、3、6 h样品，离心后弃上清，留存菌体。最后使用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）重悬菌体后进行检测^[21]。

将37 ℃条件下诱导0、1、3、6 h的蛋白样品，离心并重悬。在其中加入蛋白上样缓冲液，涡旋充分，进行SDS-PAGE电泳检测。电泳完成后，分别进行考马斯亮蓝染色和WB检测^[22]。

按照1.5步骤摇菌诱导蛋白后，测定MeIAA19-pET32a和pET32a蛋白浓度，以0.5 mg·mL⁻¹的浓度进行早晚喷施木薯叶片。3 d后取样测活性氧并提RNA反转录cDNA，分析MePR1和MePR2的表达量。

所用Xam菌株由实验室自行分离鉴定。将Xam菌株活化后用无抗LB在28 ℃条件下培养12 h后，将菌液放入离心机中4 000 r·min⁻¹，离心10 min得到菌体，用渗透液（100 mL ddH₂O中含1 mL 1 mol·L⁻¹ 的MgCl₂，pH5.7）重悬菌体后接种处理木薯叶片。

使用引物对MeIAA19-F/R对木薯叶片的cDNA进行PCR扩增，获得约750 bp大小的特异亮带（图1），将目的片段进行回收纯化后连接pEASY-T3载体并转化至大肠杆菌中。通过单菌落PCR验证，得到条带大小与目的片段一致的阳性克隆，并将以上单克隆摇菌送测序。测序结果显示扩增序列片段长732 bp，序列比对后发现其与木薯基因组数据库中的MeIAA19基因序列一致。

Figure 1.  Amplification of full-length MeIAA19

使用在线工具ProtParam分析MeIAA19编码蛋白的理化性质，结果显示：MeIAA19编码244 aa，等电点为6.63，蛋白分子量为26.64 kDa，脂肪系数为67.90，亲水系数为−0.515（<0），不稳定系数为37.71（<40），属于稳定亲水蛋白（表1）。同时，使用InterPro在线网站鉴定MeIAA19蛋白序列内的保守结构域，发现MeIAA19蛋白在其16～234 aa中含有AUX/IAA结构域，其中，125～225 aa处含有1个PB1保守结构域，与AUX/IAA家族的特征一致（图2）。

Figure 2.  Structural analysis of MeIAA19 protein

为了研究MeIAA19蛋白在不同植物中是否具有较高的同源性，将MeIAA19与杨树（Populus deltoides）、水稻、拟南芥、大豆（Glycine max）、香蕉（Musa acuminata）、番茄、马铃薯的IAAs序列进行同源比对，发现IAAs蛋白在不同的植物中具有较高的特异性，且在C端具有较高的保守性（图3）。MeIAA19与杨树中IAA蛋白的同源性最高，同源性为84.67%。

Figure 3.  The multiple sequence alignment of MeIAA19 with homologous genes from different plants

为了探究MeIAA19蛋白在植物体内的亚细胞定位，对MeIAA19蛋白的定位进行预测，结果表明：MeIAA19蛋白定位于细胞核中（图4−A）。同时，为了进一步确定其定位，通过农杆菌侵染烟草观察荧光发现对照组pEGAD空载在细胞核和细胞质均分布较强的绿色荧光信号，而融合表达载体MeIAA19-pEGAD只在细胞核观察到绿色荧光，与DAPI染色结果一致，说明MeIAA19蛋白定位于细胞核中（图4−B）。

Figure 4.  Subcellular localization of MeIAA19

提取测序正确的MeIAA19-T3菌株质粒，并通过PCR扩增得到目的片段（图5−A），通过同源连接法将MeIAA19连接到pET32a载体上，再进行菌落PCR验证（图5−B），进一步双酶切验证获得4个阳性克隆（图5−C），表明MeIAA19-pET32a融合载体构建成功。将构建好的MeIAA19-pET32a （DE3）菌株置于37 ℃诱导蛋白，分别于诱导表达0、1、3、6 h取蛋白样品。

Figure 5.  Construction of the prokaryotic expression vector MeIAA19-pET32a

将上述取的不同时间点蛋白样品进行超声破碎、离心，通过考马斯亮蓝染色（图6−A）和Western blot（图6−B）同时进行验证。结果显示，该温度条件下可以成功诱导目的蛋白，并且随着诱导时间的增加，其蛋白浓度也随之增加。

Figure 6.  Induced expression of MeIAA19 protein

为了探究MeIAA19蛋白是否参与木薯的免疫反应，将MeIAA19-pET32a和对照pET32a蛋白分别喷施于木薯叶片上，发现喷施MeIAA19-pET32a蛋白后，其活性氧爆发明显增加与对照组相比（图7−A）。同时，实验组中MePR1的表达量是对照组5倍、MePR2表达量是对照组的2倍（图7−B），差异极显著，推测该蛋白参与木薯免疫反应。

Figure 7.  The function analysis of MeIAA19 protein

为进一步探究MeIAA19在响应生物胁迫中的功能，分析其在Xam胁迫处理下的表达模式，发现接种Xam后MeIAA19的转录水平在0～24 h内随时间的增加呈现上升的变化趋势（图8），进一步表明MeIAA19可能参与木薯的免疫反应。

Figure 8.  The expression level of MeIAA19 under Xam infection

生长素几乎在所有植物中都有存在，广泛参与植物生长、发育及各种逆境胁迫等过程^{[3, 23 − 24]}。AUX/IAA家族是生长素早期响应的关键家族，是调控植物生长素反应的重要转录调节因子，与生长素反应因子相互作用发挥功能^{[5 − 6]}。

本研究从木薯中克隆并鉴定MeIAA19基因，其编码蛋白包含1个Phox and Bem1p（PB1）保守结构域，该结构域促进Aux/IAA和ARF蛋白的相互作用^[25]，推测MeIAA19可能与ARF蛋白互作，进而通过IAA信号介导木薯的生长发育和响应胁迫反应，还需进一步的升入探究。通过烟草瞬时转化证实MeIAA19定位于细胞核。此外，外源施加该蛋白可显著诱导木薯的活性氧爆发和免疫相关基因MePRs的表达。这些结果表明MeIAA19可能通过活性氧信号和水杨酸信号调节木薯的免疫反应，与前人的研究结果基本一致^[26]。本研究通过原核表达蛋白并分析该蛋白的功能，缩短研究周期，是一种快速研究基因功能的简单便捷的方法。

研究表明，AUX/IAA基因家族参与植物免疫^[17]，通过对木薯叶片进行Xam胁迫处理，发现MeIAA19转录水平随Xam侵染时间的增加呈现上升的变化趋势。在拟南芥中，AUXIN RESISTANT2 （AXR2）（编码IAA7蛋白）和AUXIN RESISTANT3 （AXR3）（编码IAA17蛋白）的表达量在Fusarium oxysporum处理下被显著诱导表达，且负调控拟南芥对F.oxysporum的抗性^[27]。此外，棉花的GhIAA43通过调节水杨酸合成和信号传导相关基因（PAL、PAD4、NPR1、EDS1、PR1、PR2、PR3和PR4）表达介导棉花对V.dahliae抗性^[17]。同样，水杨酸通过稳定IAA7蛋白从而介导拟南芥对Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 （PstDC3000） 的抗性^[28]，推测MeIAA19可能通过介导多个信号通路参与木薯对细菌性枯萎病的抗性。同时，这些结果表明IAAs广泛参与介导植物对细菌性和真菌性病害的免疫反应。此外，研究表明MeIAA19主要在不同品种苗期和主根的形成期表达，且低温、高温、盐胁迫等非生物胁迫处理抑制其表达^[18]，说明MeIAA19可能参与木薯苗期的发育和主根的形成。总之，MeIAA19有望作为潜在的木薯抗病育种候选基因。这对后续探究木薯MeIAA19抗逆的调控机理奠定基础，也为发掘MeIAA19在木薯遗传改良或生物技术应用中的潜在价值提供参考。