Screening of internal reference genes of tomato under different plant parts and hormone treatments

本试验中的番茄品种为 “Alisa Craig”（AC）。番茄种子用5%的次氯酸钠溶液消毒5 min，无菌水清洗3次，再用75%的酒精消毒30 s，无菌水清洗3次。番茄种子在无菌培养皿中萌发后，将发芽的种子转移到1/4强度的霍格兰营养液中生长。置于光周期为12 h/12 h、温度为（24 ± 1） ℃的培养箱中。

选择14 d龄长势一致且健康的水培番茄幼苗进行处理，外源植物激素的处理浓度参考Xu等^[12]的方法，使用10 μmol·L⁻¹ IAA、1 mmol·L⁻¹ SA、0.1 μmol·L⁻¹ BR及10 μmol·L⁻¹ ETH，参考Omena-Garcia等^[15]的方法，使用10 μmol·L⁻¹ GA，参考Hu等^[16]的方法，使用1 μmol·L⁻¹ ABA，参考Lu等^[17]的方法，使用10 μmol·L⁻¹ CTK。参考Albuquerque等^[18]的方法收集不同处理组0 h、3 h、6 h番茄的根、茎和叶片组织提取RNA并反转录为cDNA，然后将同一处理条件下的根、茎和叶片组织的cDNA按照时间段等量混合用于qRT-PCR分析。不同组织部位的样品为收集的正常水培条件下番茄的根、茎和叶片组织样品。每个处理均重复3次。样品置于液氮中，−80 ℃冰箱保存备用。

使用植物组织总RNA提取试剂盒（天根, N2730, 中国）提取番茄不同处理组的总RNA，提取步骤按照试剂盒的说明书进行。使用ToloScript 第一链 cDNA 合成试剂盒（ToLoBio, 中国上海）合成 cDNA，操作步骤参考说明书，cDNA 置于-20 ℃冰箱保存备用。

选择DNAJ蛋白（DnaJ-like protein/Protein binding/folding, DNAJ）、延伸因子（Elongation factor 1‐α, EF-1α）、肌动蛋白（Actin, ACT）、泛素（Ubiquitin 3, UBI）、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（Adenine phosphoribosyltransferase, APT）、网格蛋白连接复合物介质（Clathrin adaptor complexes medium subunit, CAC）、相互作用蛋白（TIP41-like protein, TIP41）和60S核糖体蛋白（60S ribosomal protein L8, RPL8）等8个常见的内参基因作为候选内参，基因及引物序列来源于文献，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，详细信息见表1。

以番茄不同组织的cDNA等量混合为模版，对8个候选内参基因进行PCR扩增，扩增反应体系10.0 µL：2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）5.0 µL，10 µmol·L⁻¹上、下游引物各0.4 µL，100 ng·µL⁻¹ cDNA模版0.2 µL，RNase-Free ddH₂O补足至10.0 µL。扩增程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，以上3个步骤30个循环，72 ℃延伸10 min，待PCR反应完成之后，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。以所有样本的cDNA为模版，根据qRT-PCR系统的熔解曲线进行引物特异性检测。每个样本3次重复。

以所有样本的cDNA为模版在qTower3实时荧光定量PCR系统（Analytikjena, GER）中使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 试剂盒（Vazyme）检测候选内参基因的Ct值，反应体系15.0 µL：2×Taq Plus Master Mix 7.5 µL，10 µmol·L⁻¹正、反向引物各0.3 µL，100 ng·µL⁻¹ cDNA模版1.0 µL，RNase-free ddH₂O补足至15.0 µL。扩增程序：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸45 s，以上2个步骤进行40个循环，60 ℃再延伸15 s，每个样本3次重复。

根据qRT-PCR得到的结果绘制候选内参基因Ct值的箱线图。候选内参基因的稳定性分析使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等算法评估，通过RefFinder（http://www.heartcure.com.au/reffinder/）在线程序综合分析候选内参基因的稳定性。

选择长势一致的14 d苗龄番茄幼苗，将幼苗置于10 μmol·L⁻¹ IAA浓度的营养液中处理，收集处理后0 h、3 h、6 h的番茄根、茎和叶部组织，按照1.3的方法提取总RNA和合成cDNA，以cDNA为模版，根据IAA处理和不同组织中筛选的最稳定和最不稳定的基因为内参，使用实时荧光定量PCR仪检测样本中SlGH3.4基因的表达情况，体系和程序同1.6，数据采用2^−△△Ct法计算，每个样本重复3次，目的基因引物序列参考Chen等^[23]的报道。

使用Graphpad Prism软件绘图，SPSS 26.0软件进行显著性分析（p < 0.05）。

以不同组织等量混合的cDNA为模版，对8个候选内参基因进行PCR扩增，并使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测其扩增产物的特异性。如图1所示，所挑选的8个候选内参基因PCR的扩增产物条带单一，无引物二聚体，且PCR扩增片段的大小与预测一致。由图2可知，8个内参基因的熔解曲线都呈现单峰，表明了候选内参基因引物具有较高的特异性和可靠性，可进行后续实验。

Figure 1.  Results of routine PCR amplification of candidate reference genes in tomato root, stem and leaf tissues

Figure 2.  Melting curve of tomato candidate reference genes

根据所有样品中的Ct值分布情况绘制箱线图（图3）。Ct值越低，说明基因的表达丰度越高。 8个候选内参基因的Ct值范围为15.42～29.55，其中EF-1α的平均Ct值最低（平均Ct值20.18），表达丰度最高，TIP41的表达丰度最低（平均Ct值23.32）。RPL8和DNAJ基因的波动范围较大，在所有样品中表达均不稳定。其他基因的Ct值离散程度大体相同，没有明显区别。

Figure 3.  Ct values of 8 candidate reference genes in all the samples

geNorm分析是用M值（稳定值）评估内参基因的稳定性，阈值为1.5，且M值越小稳定性越好^[24]。根据geNorm分析结果（图4），在生长素处理下EF-1α和UBI表达最稳定；赤霉素处理和不同组织中ACT和APT表达最稳定；脱落酸处理下，DNAJ和UBI表达最稳定；细胞分裂素和乙烯处理下的最佳内参是UBI和TIP41；油菜素内酯和水杨酸处理下APT和UBI是最稳定的内参。在所有样品中，候选内参基因的表达稳定性排序为EF-1α=APT>UBI>ACT>DNAJ>TIP41>CAC>RPL8，APT和EF-1α是最稳定的内参。

Figure 4.  geNorm analysis of stability of candidate internal reference genes in tomato seedlings under different treatments

NormFinder分析是通过方差分析（S值）评估内参基因的稳定性，S值越小稳定性越好^[25]。如图5所示，在生长素、赤霉素、脱落酸和油菜素内酯处理下的最佳内参为APT；乙烯处理下的最佳内参为ACT；不同组织中最稳定的内参为TIP41。在所有样品中，UBI是表达最稳定的内参，同时也是细胞分裂素和水杨酸处理下最稳定的内参。

Figure 5.  NormFinder analysis of stability of candidate internal reference genes in tomato seedlings under different treatments

BestKeeper软件测算SD值（标准偏差）和CV值（变异系数）来评估内参基因表达的稳定性，SD值和CV值越小，内参基因的稳定性越高^[26]。从表2可知，在赤霉素和水杨酸处理下SD值和CV值最小的内参为CAC；脱落酸处理和不同组织中SD值和CV值最小的内参分别是ACT和APT；其余处理下SD值和CV值最小的内参均为TIP41。此外，BestKeeper软件还可以对内参基因的Ct值测算相关性系数（r），SD值和CV值越小且r值较高的内参基因越稳定^[27]。在脱落酸处理下ACT的r值为0.652；不同组织中APT的r值为0.991；其余处理下排名最高的内参r值均较低，但最终排名需要综合SD值和CV值分析。因此，在赤霉素和水杨酸处理下最稳定的内参为CAC；脱落酸处理下最稳定的内参为ACT；不同组织中最稳定内参为APT；其余处理下最稳定的内参均为TIP41。

Delta CT（ΔCt）法是根据基因表达差异的可重复性对候选基因稳定性进行排序，计算公式为Q = EΔCt，Delta CT值越小，内参基因稳定性越好^[28]。分析结果（图6）表明，在生长素、赤霉素、脱落酸和油菜素内酯处理下，APT均能稳定表达；乙烯处理下的最佳内参为TIP41；不同组织中表达最稳定的内参为EF-1α。在所有样品中、细胞分裂素和水杨酸处理下UBI表达最稳定。

Figure 6.  Delta CT analysis results

geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT等4种算法的结果有一定的偏差，是由于4种算法的原理和程序不同导致。因此，我们利用RefFinder在线程序对这4种算法进行综合评估。由表3可知，在生长素、赤霉素、脱落酸、油菜素内酯处理和不同组织中APT表达最稳定；乙烯处理下表达最稳定的内参为TIP41；在所有样品中、细胞分裂素和水杨酸处理下最稳定的内参为UBI。

IAA作为促进和影响植物发育及生理变化的激素，几乎影响着植株形态发育的全过程^[29]。GH3基因是早期响应IAA的关键基因之一^[30]。以IAA处理下和不同组织中，综合排名最稳定的内参基因APT和最不稳定的内参基因RPL8对生长素响应基因GH3.4进行不同组织部位的表达分析。结果（图7）表示，在IAA的诱导下，以稳定的APT为内参时，SlGH3.4基因在番茄根、茎和叶片中的表达模式都呈上升趋势，表达差异显著。以不稳定的RPL8为内参时，根部表达模式呈上升趋势，而在茎部和叶片中呈先上升后下降的趋势，表达量明显变化，以上结果表明筛选出的稳定内参较准确和可靠。

Figure 7.  Expression patterns of SlGH3.4 gene induced by exogenous IAA

qRT-PCR是评价目的基因表达水平的重要技术手段，而内参基因的稳定性是保证试验结果精确度的关键影响因素^[31]。然而，同一物种在不同试验条件下或者不同组织中内参基因的稳定性也存在差异，因此选择合适的内参基因来减少试验中的误差是极其重要的^[32]。例如，宋雄^[33]发现欧芹（Petroselinum crispum ）在SA处理下ACT和EF-1α表达的稳定性最佳，但本研究结果显示，番茄在SA处理条件下ACT的稳定性不如EF-1α，且与白圣懿等^[13]的报道一致。此外，黄丽萍等^[34]的研究中显示，APT和UBI在香瓜茄不同组织表达稳定性最好，在本研究中，APT和UBI不仅在番茄不同组织中表达较稳定，还在不同植物激素条件下表达最稳定，而在紫花苜蓿中^[35]，不同植物激素条件下ACT的表达最稳定，进一步说明不同试验条件下稳定表达的理想内参基因并不存在。综上，本研究根据多种植物激素处理和不同组织中各内参稳定性的综合排名，发现APT和UBI的表达相对较稳定。

内参基因稳定性的筛选方法因其各自的原理和程序不同，故所得出的结果也不同。研究表明，番茄自交系“Hawaii 7996”在接种青枯菌菌株 ‘RS 489’ 后进行内参基因的稳定性筛选，在geNorm和NormFinder算法中最稳定的内参均为TIP41，而BestKeeper分析结果显示最稳定的内参为UBI^[18]。本研究中，在geNorm、NormFinder和Delta Ct算法中SA和BR处理下最稳定的内参均为APT和UBI，而BestKeeper分析结果显示最稳定的内参分别为CAC和TIP41。geNorm、NormFinder和Delta Ct的分析结果类似，但是与BestKeeper分析略有差异，这种现象也存在于石蒜属和无患子植物中^[4,36]。因此，为了减小软件算法原理不同所造成的差异，利用RefFinder在线程序进行综合分析，从而综合评估出最稳定的内参基因^[37]。

为了确定分析结果的准确性，选择生长素响应基因GH3.4对筛选出的内参进行验证。GH3基因编码的酰胺合成酶是生长素动态平衡的调节因子，SlGH3.4基因在IAA处理和丛枝菌根（AM）真菌定植的根中被强烈诱导^[23,38]。通过qRT-PCR检测最稳定的内参基因APT和最不稳定的内参基因RPL8对SlGH3.4基因的表达水平。结果显示，在外源IAA处理下，选择稳定的基因为内参时，SlGH3.4基因在番茄不同组织中的表达趋势一致，证明了所筛选的内参基因适用于分析IAA信号转导相关基因的表达水平。而选择不稳定的基因作为参考时，SlGH3.4基因在茎部和叶片的表达量发生明显变化。说明使用不稳定的内参导致基因表达的分析结果不可靠，这与岳炜楠等^[35]、Liu等^[39]的研究结果一致。因此，在选择不同处理及不同组织样品内参基因时，需要结合多种算法综合分析结果并对其进行验证，以提高结果的准确性。

本研究利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT以及RefFinder等算法对番茄不同组织及不同激素处理下内参基因的稳定性进行综合评估。结果表明，在IAA、GA、ABA、CTK、SA、BR、ETH等7个激素处理条件下、不同组织部位及所有样品中，均表达较稳定的内参基因为APT和UBI。使用稳定的内参基因APT和不稳定的内参基因RPL8对筛选的结果进行验证，发现选择稳定的内参基因可以更准确的展示目的基因的表达水平。综上，本研究为后续番茄在不同激素条件下和不同组织中筛选合适的内参基因提供了一定的理论参考。